一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的SNP引物及其应用

技术领域

本发明属于中药材分子鉴定领域，具体涉及一种用于鉴定中药材绞股蓝和乌蔹莓的SNP（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）引物。

背景技术

绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino为葫芦科绞股蓝属绞股蓝的干燥全草，又称“七叶胆”、“五叶参”、“遍地生根”，具有清热解毒、止咳清肺祛痰、养心安神、补气生精之功效，是目前除人参属外含有人参皂苷的唯一植物，被誉为“第二人参”和“南方人参”。由于绞股蓝具有多种药效及保健功效，已经开发成一系列药用或药食两用的产品，具有非常广阔的开发前景。

目前，药材市场上绞股蓝主要混淆品为乌蔹莓，乌蔹莓来源于葡萄科乌蔹莓属乌蔹莓Cayratia japonica (Thunb) Gagn.的全草，由于绞股蓝和乌蔹莓的生长环境相似，而且全草有具有相似的形态特征，鲜品都较难分辨，而干品由于比较松脆，容易被压碎，更加难于辨别，因此，民间常有把乌蔹莓误认为绞股蓝，甚至有书籍上也把乌蔹莓与绞股蓝相互混淆。

目前主要通过显微鉴别、化学成分仪器检测等方法对绞股蓝与乌蔹莓进行鉴定，而这些方法较为繁琐。王翀等采用ISSR-PCR技术在DNA分子水平上鉴别７种绞股蓝属植物，可有效区分鉴别常见绞股蓝属植物（ISSR-PCR鉴别绞股蓝属７种植物[J] . 中草药，2008，39(４) ：588-591．）。蒋军富等采用RAPD技术对绞股蓝及其伪品进行DNA指纹图谱鉴别研究，得到不同产地绞股蓝及乌蔹莓基因组的差异性DNA片段， 这些片段可以区别两者，为绞股蓝的品种鉴定、辅助选择育种等研究奠定了基础(绞股蓝的RAPD指纹图谱鉴定及其特异DNA片段克隆、序列分析[J]．中药材，2009，32(2)：190-193．)。刘镛等研究表明绞股蓝与其混伪品的ITS２序列的二级结构在４个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异，用最大简约法构建的系统发育树分枝明显，可有效区分绞股蓝与其混伪品。

此外，一些专利文献也报导了针对绞股蓝与乌蔹莓的鉴别方法。例如CN102191333A公开了一种在DNA水平鉴定绞股蓝与乌蔹莓的方法，该方法利用绞股蓝DNA特征性片段SCAR标记克隆测序的结果，设计绞股蓝SCAR标记的特异引物，从而对绞股蓝进行DNA水平鉴定。

与SSR、SCAR、RAPD等分子标记相比，SNP的数量更加丰富，更适合用于复杂性状的遗传分析，SNP技术不需要对扩增产物进行测序，操作较为简单，样品也不易受到污染，具有较高的特异性和准确性。

CN 114990246A公开了一种用于鉴定乌蔹莓及其伪品的SNP引物，SNP位点在叶绿体基因组psbA-trnH序列，利用该引物对样品进行扩增，乌蔹莓能够扩增出一条491bp的条带，而包括绞股蓝在内的其它样品都没有扩增产物。该SNP引物虽然也能用于乌蔹莓与绞股蓝的鉴别，然而由于其不能扩增绞股蓝，因此无法实现绞股蓝与除乌蔹莓以外的其它伪品的鉴别区分，无法从掺伪混合样品中特异性鉴别出绞股蓝，另外，在利用该引物对绞股蓝与乌敛莓的掺伪混合样品进行检测时，还存在灵敏度低等缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供另一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的SNP引物，通过在核糖体ITS2序列中筛选SNP 位点并设计引物，优化反应体系和扩增条件，最终实现了绞股蓝与乌敛莓以及其它伪品的鉴别区分。一方面，本发明为绞股蓝与乌蔹莓的鉴别区分提供更多的SNP位点和引物选择；另一方面，本发明能更好地检测绞股蓝掺伪混合样品，能将混淆品中极低量的绞股蓝检测出来。

为实现上述目的，本发明使用了以下技术方案：

一种用于鉴定绞股蓝和乌蔹莓的SNP引物，所述SNP引物的正向引物序列如SEQ IDNO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，正向引物的倒数第二位C为错配碱基，目的在于增强引物的特异性。

本发明进一步提供了所述的SNP引物在鉴定绞股蓝和乌蔹莓中的应用，以及一种鉴定绞股蓝和乌蔹莓的试剂盒。

本发明还提供了一种高效快速鉴定绞股蓝和乌蔹莓的方法，该方法包括以下步骤：

1）提取待测样品的基因组DNA；

2）以提取的基因组DNA为模板，利用所述的SNP引物进行PCR扩增；

3）对扩增产物进行凝胶电泳检测。

其中，所述PCR扩增的反应体系中含有0.4-0.8μL的正向引物和反向引物。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系中还含有1μL模板DNA、12.5μL预混液，总体积25μL。

其中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性，保持3min；95℃变性，保持30s，54℃退火，保持30s，72℃延伸，保持45s，共22个循环；72℃终延伸，保持10min。

若凝胶电泳出现 212 bp的特异性条带，则鉴定为绞股蓝。

本发明的有益效果是：

本发明能够在相对较短时间内快速鉴定中药材绞股蓝和乌蔹莓，该方法特异性强，灵敏度较高，在中药材鉴定中具有很好的应用前景。

本发明通过多序列比对筛选，找到了绞股蓝ITS2序列中的SNP变异位点，并设计了特异性引物和PCR反应条件，从而实现绞股蓝和乌敛莓区分和掺伪鉴定。

附图说明

图1是PCR循环次数的筛选实验。图中，泳道1-3为22循环次数；4-6为23循环次数；7-9为24循环次数；10-12为25循环次数。1、4、7、10为绞股蓝的扩增条带；2、5、8、11为乌蔹莓，无扩增条带；3、6、9、12为空白对照。

图2是PCR退火温度的筛选实验。图中，电泳泳道1-3为52℃；4-6为52℃；7-9为52℃；10-12为52℃。1、4、7、10为绞股蓝的扩增条带；2、5、8、11为乌蔹莓，无扩增条带；3、6、9、12为空白对照。

图3是 PCR引物加入量的筛选实验结果。图中，电泳泳道1-3为 0.2μL，4-6为0.4μL，7-9为0.6μL，10-12为0.8μL。1、4、7、10为绞股蓝的扩增条带；2、5、8、11为乌蔹莓，无扩增条带；3、6、9、12为空白对照。

图4是本发明对掺伪混合样品的检测结果。图中，1→10分别代表乌蔹莓中掺入绞股蓝比例为0%，1%，2%，3%，5%，10%，30%，50%，80%，100%；11为空白对照。

图5是对比例对掺伪混合样品的检测结果。图中，8→1分别代表绞股蓝中掺入乌蔹莓比例为1%，3%，5%，10%，30%，50%，80%，100%。

图6是本发明对绞股蓝DNA的检测灵敏度。图中，1→10分别代表绞股蓝DNA浓度79ng/μL，60ng/μL，40ng/μL，20ng/μL，10ng/μL，5ng/μL，3ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL；11为空白对照。

M为DL 1000 DNA Marker。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行详细说明。实施例中所使用的PCR仪器型号为T100

实施例1检测方法的建立

1．绞股蓝、乌蔹莓基因组DNA的提取

采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取绞股蓝和乌蔹莓的基因组DNA。

1）取药材粉末30mg，加入1mL核分离缓冲液充分混匀，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心5min，弃上清液，重复该步骤2次；

2）将经核分离缓冲液处理后的样品中加入700µL缓冲液GP1，65℃水浴2h，水浴过程中颠倒离心管数次混合样品；

3）在样品充分水浴后，向样品组织裂解的混合液中加入700µL氯仿，完全混匀，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心5min，将离心得到的上清液转移到一个新的离心管里；

4）上清液中加入700µL缓冲液GP2，颠倒混匀，充分混匀后转移至吸附柱中，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心30s，弃废液；

5）向吸附柱中加入500µL缓冲液GD，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心30s，弃废液；

6）向吸附柱中加入600µL漂洗液PW，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心30s，弃废液，并重复该步骤一次；

7）将吸附柱再次放回收集管中，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心2min，将吸附柱转移到新的离心管，彻底晾干吸附柱中的漂洗液；

8）向吸附柱膜的正中位置悬空滴加洗脱缓冲液TE 50µL，在室温条件下放置5min使洗脱缓冲液TE充分浸润吸附柱膜，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2．引物的设计

从NCBI数据库下载绞股蓝和乌蔹莓ITS2序列，采用MEGA 11软件进行序列比对，筛选可能存在的特异性位点的基因序列，结果发现绞股蓝及其混伪品的核糖体 ITS2序列中多态性丰富，存在大量的SNP位点。其中，绞股蓝的ITS2序列在第38、45、49等多位点发生变异。

第38位点的G/A的这种多态性位点在不同个体之间发生相对稳定的变异，并且G/ASNP位点的次要等位基因（minor allele）频率适中，即MAF值在0.05到0.5之间，同时此位点为错义突变，具有潜在的遗传差异，这使得它们适合进行关联分析和基因型-表型关联研究，因此可以此变异位点设计引物。排除差异过大，变异不稳定，不适合设计为引物的位点，结合MAF值和扩增产物长度，最终选择了38位点（G/A）设计引物，产物长度大于100bp，利用琼脂糖凝胶电泳即可进行检测。

绞股蓝ITS2序列：

GAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAG

乌蔹莓ITS2序列：

GAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAG

采用OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator在线网站（http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html）进行检查，预测引物没有发夹结构、引物二聚体、回文序列等引发扩增错误的结构。最终设计出以下一对引物碱基序列：

3．位点特异性PCR扩增条件的筛选

1）反应循环次数考察

以样品基因组DNA为模版，利用筛选得到的引物进行PCR扩增，选择22、23、24、25四个循环次数的扩增程序。

经过电泳条带验证（图1），结果表明，在22循环次数时绞股蓝的单一目标条带清晰，因此选择反应循环次数为22。

2）退火温度筛选

以样品基因组DNA为模版，利用筛选得到的引物进行PCR扩增，选择52℃、54℃、56℃、58℃共四个退火温度来进行考察。

经过电泳条带验证（图2），结果表明，当退火温度为54℃时，绞股蓝的单一条带清晰且没有出现拖尾现象，有利于提高检测的敏感性和准确性，因此选择最优退火温度为 54℃。

3）引物加入量考察

以样品基因组DNA为模版，利用筛选得到的最优引物进行PCR扩增，在上述引物体系中引物加入量分别选择0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL进行验证。

经过电泳条带验证（图3），结果表明，0.2μL时条带亮度较低，而0.4μL，0.6μL，0.8μL条带均正常显示，为提高检测敏感性，优选引物加入量为0.4-0.8μL。

通过以上试验筛选，最终确定PCR反应体系和程序如下：

反应体系：

反应程序：

实施例2 检测效果的验证

1.掺伪混合检测考察

设置不同浓度梯度的绞股蓝与乌蔹莓的混合物，向乌蔹莓中掺入绞股蓝比例为0%，1%，2%，3%，5%，10%，30%，50%，80%，100%。提取样品基因组DNA并使用优化后的反应体系和程序进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果见图4。

结果表明，随着绞股蓝占混合物比例增加，扩增产物的条带亮度逐渐增强，当绞股蓝占比为1%时可检测出绞股蓝条带，因此所建立的方法能将混合体系中低至1%的绞股蓝检出。

同时，利用CN114990246A的方法对样品进行检测，设置不同浓度梯度的绞股蓝与乌蔹莓的混合物，向绞股蓝中掺入乌蔹莓比例为1%，3%，5%，10%，30%，50%，80%，100%。凝胶电泳检测结果见图5。

正向引物：GACTCAATGGAAGCTGTTCTAA

反向引物：GAATGATAACCATAACGAAAACG

反应体系：

反应程序：

结果表明，随着乌蔹莓占混合物比例增加，扩增产物的条带亮度逐渐增强，当乌蔹莓占比为5%时，开始检测出乌蔹莓条带，因此所建立的方法能将混合体系中最低5%的乌蔹莓检出。

2.灵敏度实验

以绞股蓝基因组DNA为模版，利用筛选得到的优化反应体系进行PCR扩增，设置不同浓度梯度的绞股蓝模板DNA浓度，DNA的浓度分别为79ng/μL、60ng/μL、40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、3ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL。提取样品基因组DNA并使用优化后的反应体系和程序进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果见图6。

结果表明，绞股蓝扩增出的特异性条带随着模板DNA浓度的降低，特异性条带逐渐变浅，当DNA浓度为0.1ng时仍有扩增条带，故该方法对绞股蓝DNA的检测限为0.1ng。