负调控PICKs基因在降低植物中植酸含量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及负调控PICKs基因在降低植物中植酸含量中的应用。

背景技术

肌醇六磷酸(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate，简写InsP6或IP6)，又称植酸(phytic acid)，是植物，尤其种子(特别是禾谷类，豆类，油料等作物种子)储存磷素的主要形式，对维持植物体内磷的稳态有着重要作用。由于IP6含有6个带负电的磷酸基团，因此对矿物质(镁，钙，铁等阳离子)和蛋白质具有强烈的螯合能力。而单胃动物缺乏相应的植酸酶，所以难以吸收利用植酸螯合的稳定盐及蛋白复合物，最终以粪便形式从动物体内排入环境，因此IP6被认为是“抗营养素”，一方面降低了动物对矿物质等营养元素的利用率，另一方面排泄物中未消化的植酸盐会进一步造成环境水体的富营养化等问题，因此IP6对人类及动物的营养和生态环境都有诸多负面影响。如何解决种子中大量IP6的存在与环境污染及人类营养元素低利用率之间的矛盾成为科学工作者的一大难题。

近年来，从作物品种选育的源头上解决IP6含量偏高的问题是育种工作者所寻求的重要育种目标，低植酸含量的作物种质创新，突变体的遗传特性及其相关基因的定位和功能解析研究已经成为新的研究热点和解决途径。但是如何得到低植酸的植物种质仍然未知。

发明内容

本发明的目的在于提供负调控PICKs基因在降低植物中植酸含量中的应用，可以降低植物尤其植物种子中的植酸含量，为低植酸育种提供技术支持。

本发明提供了负调控PICKs基因在降低植物中植酸含量中的应用，所述PICKs基因包括PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6中的至少四种；所述PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示。

优选的，负调控PICKs基因通过降低所述PICKs基因在植物中的表达或降低PICKs基因编码的蛋白实现。

本发明还提供了降低植物中PICKs基因表达或降低植物中PICKs基因编码的蛋白含量的生物材料在降低植物中植酸含量中的应用；所述PICKs基因包括PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6中的至少四种；所述PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述生物材料为下述A1～A10中的至少一种：

A1：用于敲除上述技术方案所述应用中PICKs基因的核酸分子；

A2：含有A1所述核酸分子的重组表达载体；

A3：含有A1所述核酸分子的重组微生物；

A4：含有A2所述重组表达载体的重组微生物；

A5：含有A1所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A6：含有A2所述重组表达载体的转基因植物细胞系；

A7：含有A1所述核酸分子的转基因植物组织；

A8：含有A2所述重组表达载体的转基因植物组织；

A9：含有A1所述核酸分子的转基因植物器官；

A10：含有A2所述重组表达载体的转基因植物器官。

优选的，所述A1中的核酸分子包括用于敲除PICK5的核酸分子、用于敲除PICK6的核酸分子和T-DNA序列中的多种，所述用于敲除PICK5的核酸分子和用于敲除PICK6的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

优选的，用于敲除PICK5的引物的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示；

用于敲除PICK6的引物的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

优选的，所述植物包括拟南芥；所述植物包括植物种子。

本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为下述A1～A4中的至少一种：

A1：用于敲除上述技术方案所述应用中PICKs基因的核酸分子；

A2：含有A1所述核酸分子的重组表达载体；

A3：含有A1所述核酸分子的重组微生物；

A4：含有A2所述重组表达载体的重组微生物。

本发明还提供了一种培育低植酸植物的方法，包括：降低目的植物中PICKs基因的表达，或降低目的植物中所述PICKs基因编码蛋白的含量，得到所述低植酸植物。

优选的，降低目的植物中PICKs基因的表达或降低目的植物中所述PICKs基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入敲除所述PICKs基因的核酸分子。

有益效果：

本发明提供了负调控PICKs基因在降低植物中植酸含量中的应用，通过敲除植物中的PICKs基因，即敲除目的植物中的PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6基因中的至少四种，降低PICKs基因在植物中的表达或直接影响编码蛋白的功能，使植物中尤其是植物种子中的植酸含量显著减少，进而明确PICKs功能的缺失可以减少植物中植酸的含量，对采用生物手段降低植物种子植酸的含量有着重要意义，为低植酸植物育种提供重要的技术基础和支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中picks突变体T-DNA插入信息示意图；

图2为实施例1中三引物法对picks突变体进行纯合性鉴定的结果图；

图3为实施例1中野生型和T-DNA插入突变体株系目标基因表达量对比图；

图4～6为实施例2中CRISPR载体图谱；

图7为实施例4中PICK5的CRISPR敲除突变位置信息示意图；

图8为实施例5中野生型、突变体株系种子内植酸含量的对比图。

具体实施方式

本发明提供了负调控PICKs基因在降低植物中植酸含量中的应用，所述PICKs基因包括PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6中的至少四种；所述PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示。本发明所述PICKs基因优选包括PICK1、PICK2、PICK3和PICK4，或PICK1、PICK2、PICK3、PICK4和PICK5，或PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6，更优选为PICK1、PICK2、PICK3、PICK4和PICK5。

在本发明中，所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的核苷酸序列长度分别为1482bp、1536bp、1398bp、1479bp、1401bp和1452bp，分别具体如下所示：SEQ IDNO:1：5'-ATGACATCTCAGCTAAAACGAACTTTAACCAAGAGATACGGTGTTCTTGAACTGTGGGAGATCATAGTGATTGCTCTCTTTGCAGCCTTCATAGTAATCCTTGTCCTTTCAGTTTGGCTCAGCTTCCGTAAAAAGTCCAAAAGATCTAATGCTACAACGCTTCCTGTAACTCAAAGCCCTCGCTTTACCGAAGAAATAAAAGAAATAAGTGTTGATCATGGTTCATCTAACAACAATGGTACTTCTTACCAAACTCTTGATGAGAAATTCGTTGAGGACATCGAGAATGGCGATAAGTTCTCTGGTTCTTTGGAGAAAAAACCCCTGGTTGGGTCACATTTGCCTCCTAGTACTCCTTCAACAACAGCTCCTTCACCTCTCTTGGGTCTTCCTGAGGTTTCTCACATTGGTTGGGGTCATTGGTTCACTCTCCGTGACCTTCAACTCGCGACTAATCATTTCTCCAAGGAGAGTATCATCGGAGATGGTGGTTATGGAGTTGTTTACCATGGAACTTTGACTAACAAAACCCCTGTGGCTGTCAAAAAGTTGCTCAACAATCCAGGTCAAGCTGATAAAGATTTCAGAGTTGAGGTGGAAGCTATAGGACATGTCCGGCATAAGAACTTAGTTCGGCTTCTTGGATATTGCGTTGAAGGAACACATAGGATGCTGGTTTATGAGTACATGAACAATGGGAACTTAGAGCAATGGCTTCATGGAGACATGATTCACAAAGGGCATCTCACTTGGGAGGCTCGCATCAAAGTTCTTGTTGGCACTGCAAAGGCACTGGCTTATCTTCACGAAGCTATTGAGCCAAAAGTGGTGCATAGAGACATAAAATCAAGCAATATACTGATGGATGACAACTTTGACGCAAAGTTATCTGATTTCGGTCTTGCTAAATTGCTTGGAGCTGATTCAAATTACGTCAGTACTCGAGTTATGGGTACATTCGGGTATGTCGCACCTGAATACGCTAACTCTGGTCTCCTAAACGAAAAGAGCGATGTGTACAGCTATGGTGTTGTTCTCTTGGAAGCTATTACTGGAAGGTATCCAGTGGATTATGCGCGGCCTAAAGAAGAGGTGCATATGGTGGAGTGGTTAAAGCTAATGGTTCAACAGAAACAGTTTGAGGAAGTGGTGGATAAAGAGCTTGAGATCAAACCAACAACAAGCGAACTTAAACGAGCACTTTTGACAGCTTTAAGATGCGTTGATCCTGATGCAGACAAGAGGCCAAAGATGAGTCAAGTGGCTCGAATGCTTGAATCTGATGAATACCCTGTGATGCCTAGAGAGGAACGAAGAAGAAGGAGAAATCAGAACGCAGAGACGCATAGAGAAAGCACAGACACGAATAAAGATAATGATATAACAACAGATGCAAAGATTTGA-3'；

SEQ ID NO:2：5'-ATGGGTTCTGGTTTAAATGACACATTATCTCGGAACTACAATGGTTTGGAGCTATGGGAGATAATAGTGATTGTTCTCTCCGCGATATTCGTTGTAGTTTTAGCTATATCGCTATGGCTTACTTTCAGAAGAAAAACCTCTAGATCTTCTTCTAATCTAATCCCTGTTAGTCGCCAGATTCCTCCTAGTGTTCCTGAAGAGATTAAAGAGATTAGAGTCGACGAGGTTTCTTCAAGCAATGGTGGGAATGGATACCCCTCTATTAGTGAGAAATTTGGCGATAAAGAACCCGAAAAAGGGATAAAAGCAGAGTCAGAAAATGGCGATAGTAGCCGGTCAGGCTCGTTTAATCACTTGGAGAAAAAAGACGGATCGAGCGTATCTTCTGCTAATCCTTTGACAGCTCCATCTCCTTTGTCTGGTCTTCCTGAGTTTTCTCACCTTGGATGGGGACATTGGTTCACTCTTAGAGATCTTCAGATGGCTACTAATCAGTTTTCAAGGGATAATATCATCGGTGATGGTGGATATGGAGTTGTTTACCGCGGTAACCTTGTTAATGGTACTCCTGTTGCTGTTAAAAAGTTGCTCAACAATTTAGGACAAGCTGATAAAGACTTCAGAGTTGAAGTTGAAGCTATAGGTCACGTTCGACATAAAAACTTGGTCCGCCTTCTCGGATATTGTATGGAAGGAACGCAGAGGATGCTGGTGTATGAGTATGTTAACAATGGAAATTTGGAGCAATGGCTCCGTGGAGACAATCAAAATCATGAGTATCTTACATGGGAGGCACGAGTGAAAATTCTTATTGGGACAGCCAAAGCGCTCGCGTACCTTCACGAGGCGATTGAGCCAAAAGTGGTGCACAGAGACATTAAGTCTAGTAACATTCTGATTGATGACAAATTCAATTCTAAAATTTCTGACTTTGGACTTGCTAAACTACTTGGTGCTGATAAGAGTTTTATAACTACTAGAGTTATGGGTACCTTCGGTTACGTAGCTCCAGAGTATGCGAATTCCGGTCTTCTGAATGAGAAAAGCGATGTCTACAGCTTCGGGGTTGTACTCTTGGAAGCTATAACTGGTAGATATCCGGTAGACTATGCTCGTCCACCACCCGAGGTACATTTGGTGGAGTGGCTGAAGATGATGGTCCAACAAAGACGATCAGAAGAAGTGGTTGATCCAAACCTTGAAACAAAACCATCTACAAGTGCTTTGAAAAGAACACTATTGACTGCTTTGAGATGTGTTGATCCAATGTCTGAGAAAAGACCGAGGATGAGCCAAGTTGCACGTATGCTTGAATCCGAAGAATACCCAATTGCTAGAGAGGATAGGAGAAGACGAAGGAGTCAGAACGGGACAACAAGAGATTCAGATCCTCCGAGGAACAGCACAGACACTGACAAGAGTGAGTACCATGACCTAAAGCCTGAAGGTGGATAG-3'；

SEQ ID NO:3：5'-ATGCCACCTGAGAGTTCTTTAAACGCTGAAATGTCCAAGAAGATATCATTTTTTGGTTTGAAGGGTTTGAAGTTGTGGGTATGGGTATGTTTGGTAGTTGGAGTATTCATAGTTATGATTCTCTGCATCTTGTCTCTATGGATCACATTCCGTCGGAAATCTAGAAGGTCTTCAAGCAAGTTTCCTTTCAACCAAATACCACATGTGTCCAAAGATATCAGAGTCGACAGGGCTGGGTTTCAGAATCCTCACCCCGAAAGTTTATATATAGAAATGAATGATAAATCCACTGGAAAAACGATGATGTCTCACTTGGGAAGAACCAAGTCTAGTGATAATGACACTTTGAGTCAATGTAGCTCTGTGAATCACCATGAGAGAGCTTGTAGTTCTCATTCTGGTGAAGAAGGAGGCTTTGGAAGTGCTGGGAGACAGTATGGAGGAGGACCTGTAACAGCATCTCCTTTGGTTGGTTTACCAGAAATATCCCATCTTGGTTGGGGACACTGGTTTACTCTTAGGGATCTTGAGCTAGCAACCAACCGTTTTGCTCCAGTGAATGTGCTTGGAGAGGGTGGTTATGGAGTAGTTTATAGGGGTAAACTTGTTAATGGTACCGAGGTTGCTGTAAAGAAGCTTCTGAACAATCTAGGGCAAGCTGAGAAGGAATTTCGGGTAGAAGTTGAGGCTATTGGTCATGTACGGCACAAGAATCTTGTTAGGCTTTTAGGATATTGCATAGAGGGAGTTCATCGGATGCTTGTTTATGAGTATGTTAATAGTGGTAACTTAGAACAATGGCTACATGGAGCAATGCGGCAACATGGAAATCTCACTTGGGAAGCACGGATGAAAATCATTACTGGTACTGCACAAGCGCTTGCTTACTTGCATGAAGCAATAGAACCAAAAGTGGTCCACAGAGACATAAAAGCAAGTAATATATTGATTGATGATGAGTTTAATGCAAAACTCTCTGACTTTGGGTTAGCCAAGCTCTTGGACTCGGGTGAGAGTCACATCACTACCAGAGTCATGGGTACCTTTGGATATGTAGCACCAGAATATGCTAATACAGGTCTTTTAAACGAAAAGAGTGATATATATAGCTTTGGTGTCTTGCTTCTTGAAGCTATAACTGGTCGAGATCCAGTTGATTATGGTCGTCCTGCTAATGAGGTGAATCTTGTTGAATGGCTAAAGATGATGGTTGGAACAAGAAGAGCAGAAGAAGTTGTGGATCCAAGACTTGAACCTAGACCTAGTAAAAGTGCTTTGAAACGTGCACTCTTGGTTTCCCTTAGATGTGTTGATCCTGAAGCAGAGAAACGTCCTAGAATGAGTCAGGTTGCGCGCATGCTTGAATCTGATGAACACCCTTTTCACAAGGAGAGGAGGAACAAAAGGAGCAAAACCGCGGGCATGGAGATTGTTGAGACCAAAGACGAATCTCTTGGTCCTAGTGGCTCAGAGACAAAGCCTTAG-3'；

SEQ ID NO:4：5'-ATGTCATCTGAGAGTTCTCTGAGTGCTGACATGTCGAAGAAGGTCTCATTTTTAGGTTTGAAGGGTATGAAACTGTGGGTACTGATTTGTTTAGTAGTTGGCACATTTGTAGTTTTGGTTTTCTGTATATTATCTCTATGGATTGCATTCCGCCGGAAATCCCGGAGATCATCTCACAAGCTGTTACCCTTCAGTCAAATACCACGCGTGGCGAAAGATATCAGGGTTGATGATAGAGTTGGGTTTCAAAATCATAATGAAAATTTATCTATCACAAATGCTGATAAATCTAGTGACAGAAACTCTGGGAAGATGATGTCTTACTTGGGAAGAACGAAGTCTAGTGATAATGATAGTATAAGTCAATGTAGCTCTGTGCATCATCATGAGAGAGCTTGTAGTTCTCACTCTGGTGAAGATGGAAGCTTTGGAGCTGCTTGGAGACAAAATTCCCTATCACAGGGCGGGCTAGTAACAGCATCTCCTTTGGTTGGTTTGCCAGAAATATCTCATCTTGGTTGGGGACACTGGTTTACTCTTAGGGATCTTCAGCTAGCCACCAACCGTTTTGCTGCTGAAAATGTAATCGGTGAGGGTGGTTATGGAGTAGTTTATAAGGGTAGACTCATCAACGGTAATGATGTTGCTGTAAAGAAGCTTCTTAACAATCTGGGACAGGCTGAGAAGGAATTCCGGGTTGAAGTTGAGGCTATTGGTCATGTACGGCACAAGAATCTTGTAAGGCTTCTAGGATATTGCATAGAGGGTGTTAATAGGATGCTTGTTTATGAGTATGTGAATAGTGGTAACTTAGAACAATGGCTACATGGAGCCATGGGAAAACAAAGCACTCTCACTTGGGAGGCTCGCATGAAAATCCTTGTTGGTACTGCGCAGGCGCTTGCTTATTTACATGAAGCAATAGAACCAAAAGTAGTCCACAGAGACATAAAAGCAAGCAATATCCTGATTGACGATGACTTCAATGCAAAGCTTTCTGATTTTGGGTTGGCCAAGCTCTTAGACTCGGGTGAGAGTCACATCACGACCAGAGTCATGGGAACCTTTGGATATGTCGCACCCGAATATGCTAATACAGGTCTATTGAATGAGAAGAGTGACATCTATAGCTTTGGTGTCCTGCTGCTAGAGACTATAACTGGAAGAGATCCAGTTGACTATGAACGTCCAGCTAATGAGGTGAATCTGGTCGAATGGCTAAAGATGATGGTTGGAACAAGAAGAGCTGAAGAAGTTGTTGACTCAAGGATTGAGCCTCCACCCGCTACACGTGCTCTGAAACGTGCACTTCTTGTTGCCCTGAGATGTGTGGATCCTGAAGCACAGAAACGGCCTAAAATGAGCCAGGTTGTGCGGATGCTTGAATCCGATGAACACCCTTTTCGTGAGGAGCGGAGGAACAGAAAGAGTAGAACAGCGAGTATGGAGATTGTTGAAACCACTGAGGAATCAGCTGACACAAGCAAAGGGCCTGGTCACTCAGAGAACACTACAAAACCTGAGAAGACTCATGTATAG-3'；

SEQ ID NO:5：5'-ATGGCTGGACTTAAGATCTGGCAAGCCATCTTTATCACCATTGCACTGATCATCATTGTCGTACTCTCTGTTCTTTCATTTTGTCTCATTTGGAAAAAGAAATCAAGAAGATCCAAAACCTTAAGTCTTCCCATCATACAAACCCCTGTGGTGTCAAAGGAGATCAAGGAAGTCAGGATCGAGCATGTTGTCTCAACGAGTAGTAACTTCGATCCTCAGGATGAAAACAACAATGAATCTGACAAATTCTTGCTTAATTTGGAAATGGAGAAGAACAGAGAGAATGGTTTGAGTAGTAGCCGGTCTGGTTCAGGCAAAGAAGGTTATTTATGTGTTGCAAACCGGTCTACTTCATCATTGTATGAGATGGCTACACCATCACCATCACCTCTTTCTGGTTTACCTGAGTCACACCTTGGATGGGGTCATTGGTTTACTCTGAGAGATCTTGAGATAGCAACAAACAGATTCTCAAAGGAAAATGTGATTGGTGAAGGAGGCTATGGAGTTGTTTACCGAGGCGAGTTGGTCAATGGGAGTCTTGTTGCCGTGAAAAAGATCCTAAACCACTTGGGACAAGCAGAGAAAGAGTTTAGAGTAGAGGTAGATGCTATAGGTCATGTGCGTCACAAGAACTTGGTACGTCTTCTAGGATACTGCATTGAAGGCACAAACAGGATATTGGTTTATGAGTATATGAACAATGGGAACCTTGAAGAATGGCTTCACGGAGCAATGAAACATCATGGATATCTAACTTGGGAAGCTCGAATGAAAGTTCTCACTGGAACATCCAAGGCTCTTGCATATCTACACGAGGCAATCGAACCAAAAGTGGTGCATAGAGACATCAAGTCGAGCAACATCTTGATCGATGATAGATTCAATGCAAAGATTTCTGATTTTGGCCTTGCCAAGTTACTTGGAGATGGGAAAAGCCATGTGACTACTAGAGTCATGGGAACATTTGGGTATGTTGCTCCTGAGTATGCGAATACCGGACTTTTGAATGAAAAGAGTGATGTGTACAGCTTTGGTGTCTTGGTCTTAGAAGCAATAACCGGAAGAGATCCTGTGGATTACGCGCGGCCTGCTAATGAGGTGAATTTGGTTGAGTGGTTGAAGATGATGGTAGGATCTAAGAGATTAGAAGAAGTCATTGATCCAAACATAGCAGTTAGGCCAGCGACTAGAGCACTGAAACGAGTACTTCTTACAGCACTTAGATGCATTGATCCTGATTCTGAAAAGAGACCTAAAATGAGTCAAGTTGTGCGTATGCTGGAGTCTGAGGAATATCCTGTACCAAGAGAGGAGCGGAGAGTGCGCAGAACGCAAGAGGAAAACTCGGATACCGATAGAAGCAGACCGGTTTCAAGATCACAGAGCAAGAGACTGTAA-3'；

SEQ ID NO:6：5'-ATGGGAGGTGACTTGAAAAGCCAGCTATCTAGAGAGAGCCATGTGTTTGGACTTAAGGTGTGGGAAGTAATTGGTATAGCTGTTGCATTGCTCATCATAGCTATCCTCTCTGTTCTTTCGTGTTGTCTTACTTCGAAAAAGAAATCAAGAAGATCGAAAACCGGTCTTCCGGTTATCCAAACTCCTCCGGTGGTCTCCAAAGAGATCAGAGAAGTGAGAGTTGAGCATGTCTCAGCTAGTAACTTTGCTCCTGGTGAAGGCATTCTTCTAACAATTCAGGACAAAAATAACAAAGACTCAGAAAAAGTCATGGTTCATTTGGATATGAGGAAGAAGAGAAGTAGTAGTGGCCGGTCAGGGTCGTTTCATCATTTAGAGATCATAGATAAACATTCTGACTCTGCTGAAGAAGTTTCTGCTTCTTCATCATTGTATAATATTGCAACTCCATCTCCATTGTCTGGTTTGCCTGAATCTCACCTTGGTTGGGGACACTGGTTTACTTTGAGAGATCTTGAAACAGCAACTAACAGATTCTCTAAAGAGAATGTTATAGGTGAAGGCGGTTACGGTGTTGTCTACAGAGGAGAGTTAATGAATGGAACTCCTGTTGCAGTTAAAAAGATTCTTAACCAGTTGGGACAAGCTGAGAAAGAGTTTCGAGTCGAGGTTGATGCTATCGGTCATGTGCGGCACAAGAACTTGGTTCGGCTTCTTGGTTACTGCATTGAAGGCACACACAGGATATTGGTTTACGAATATGTGAATAATGGAAACTTAGAACAATGGCTTCATGGAGCAATGAGACAACATGGATATCTAACTTGGGAAGCAAGGATGAAGGTTCTGATCGGCACATCAAAAGCTCTTGCATATCTGCATGAAGCAATTGAGCCAAAAGTAGTGCATAGAGACATCAAGTCAAGCAACATTCTGATCAATGACGAATTCAACGCAAAGGTTTCAGATTTTGGCCTTGCTAAGTTGCTTGGTGCTGGAAAAAGCCATGTGACAACTCGAGTGATGGGAACATTTGGGTACGTTGCTCCTGAATATGCAAACTCAGGGTTGTTAAATGAAAAGAGTGATGTCTACAGCTTTGGTGTTGTTCTCTTAGAAGCAATCACAGGACGAGACCCTGTGGATTACGGACGTCCTGCTCATGAGGTGAATCTAGTGGACTGGTTGAAGATGATGGTTGGGACAAGACGATCAGAGGAAGTAGTGGATCCAAACATAGAAGTGAAGCCACCAACAAGGTCACTGAAACGAGCTCTTTTGACGGCTCTAAGATGTGTTGATCCAGATTCGGATAAGCGGCCGAAGATGAGCCAAGTTGTACGTATGCTTGAGTCTGAAGAATACCCCATTCCAAGAGAGGACCGAAGGCGTTCTAGAACGCGAGAAGGGAGTATGGAGATAAACTCAGACACTGACATGAGTACTCCAGTTTCAAGATCACAGAGCAAGAGACAATAA-3'。

本发明所述负调控PICKs基因优选通过降低所述PICKs基因在植物中的表达或降低PICKs基因编码的蛋白实现。

本发明还提供了降低植物中PICKs基因表达或降低植物中PICKs基因编码的蛋白含量的生物材料在降低植物中植酸含量中的应用；所述PICKs基因包括PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6中的至少四种，进一步优选包括PICK1、PICK2、PICK3和PICK4，或PICK1、PICK2、PICK3、PICK4和PICK5，或PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6，更优选为PICK1、PICK2、PICK3、PICK4和PICK5；所述PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示。

在本发明中，所述生物材料优选为下述A1～A10中的至少一种：A1：用于敲除上述技术方案所述应用中PICKs基因的核酸分子；A2：含有A1所述核酸分子的重组表达载体；A3：含有A1所述核酸分子的重组微生物；A4：含有A2所述重组表达载体的重组微生物；A5：含有A1所述核酸分子的转基因植物细胞系；A6：含有A2所述重组表达载体的转基因植物细胞系；A7：含有A1所述核酸分子的转基因植物组织；A8：含有A2所述重组表达载体的转基因植物组织；A9：含有A1所述核酸分子的转基因植物器官；A10：含有A2所述重组表达载体的转基因植物器官。

在本发明中，用于敲除上述技术方案所述PICKs基因的核酸分子优选包括用于CRISPR敲除上述技术方案所述PICKs基因的核酸分子和T-DNA序列中的多种，更优选为用于CRISPR敲除上述技术方案所述PICKs基因的核酸分子和T-DNA序列。本发明所述用于CRISPR敲除上述技术方案所述PICKs基因的核酸分子优选包括用于敲除PICK5的核酸分子和用于敲除PICK6的核酸分子；所述用于敲除PICK5的核酸分子和用于敲除PICK6的核酸分子的核苷酸序列分别优选如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，具体分别为5'-TTGTCAACCTTCATTCATAGAGG-3'和3'-CAGCACCAAGCAACTTAGCAAGG-5'。本发明对所述T-DNA序列没有特殊限定，按照本领域中的常规操作手段设计的能够达到敲除PICKs基因的T-DNA序列均属于本发明的保护范围，如本发明实施例中购买得到的四个T-DNA插入突变体pick1(SALK_047485C)，pick2(SAIL_916_B10)，pick3(SALK_026210C)和pick4(SAIL_913_F05)则是通过在目的植物拟南芥中插入T-DNA序列获得，具体插入位置如图1所示。

在本发明中，用于CRISPR敲除PICK5的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别优选如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，具体分别为5'-GATTGTTGTCAACCTTCATTCATAGAGG-3'和5'-AAACCCTCTATGAATGAAGGTTGACAAC-3'；用于CRISPR敲除PICK6的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别优选如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，具体分别为5'-GGTCACAGCACCAAGCAACTTAGCAAGG-3'和5'-AAACCCTTGCTAAGTTGCTTGGTGCTGT-3'。本发明所述用于CRISPR敲除PICK5和PICK6的引物的退火条件优选为：37℃，30min；95℃，5min；25℃，6min，下降速率为0.2℃/s。

在本发明中，降低植物中PICKs基因表达或降低植物中PICKs基因编码的蛋白含量的生物材料在降低植物中植酸含量的方法优选包括：向敲除PICK1、PICK2、PICK3和PICK4基因的四突突变体T-4m中导入敲除所述PICK5基因的核酸分子和敲除所述PICK6基因的核酸分子。本发明所述四突突变体T-4m的获得方法优选为：将突变体pick1(SALK_047485C)，pick2(SAIL_916_B10)，pick3(SALK_026210C)和pick4(SAIL_913_F05)进行杂交获得，本发明所述突变体pick1(SAL K_047485C)，pick2(SAIL_916_B10)，pick3(SALK_026210C)和pick4(SAIL_913_F05)购买于拟南芥种子资源中心(http://abrc.osu.edu)。本发明所述杂交方法优选为人工授粉，具体为：选择拟南芥植株花粉活力旺盛的时间，用镊子将已盛开的父本花朵小心剥去花萼和花瓣，露出雄蕊。另外选择母本露白但未盛开的花朵用镊子去除花瓣及雄蕊，露出花柱。最后将父本的雄蕊在母本的花柱上反复涂抹数次，完成杂交。

本发明所述重组表达载体优选含有敲除所述PICK5基因的核酸分子和敲除所述PICK6基因的核酸分子；所述重组表达载体的初始载体优选包括Cas9质粒，进一步优选为pEx-pAtUBQ-Cas9；所述敲除所述PICK5基因的核酸分子和敲除所述PICK6基因的核酸分子优选插入到所述pEx-pAt UBQ-Cas9的Hind III和Xba I酶切位点之间，所述敲除所述PICK5基因的核酸分子和敲除所述PICK6基因的核酸分子通过Xho I酶切位点进行连接。本发明对所述重组表达载体的构建步骤没有特殊限定，按照本领域中常规操作步骤进行即可。

本发明所述重组微生物中的初始微生物优选包括农杆菌，进一步优选为GV3101。

本发明所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。本发明所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均优选通过将所述重组微生物转入目的植物中获得。本发明对将所述重组微生物转入目的植物的方法没有特殊限定，采用本领域中常规转基因的方法即可，如本发明实施例中采用的是抽真空转化法。

在本发明中，所述PICKs基因编码的蛋白优选包括PICK1-PICK6基因编码的蛋白，分别由494、512、466、493、467和484个氨基酸组成，具体分别优选为SEQ ID NO:13～18所示，具体如下：

SEQ ID NO:13：MTSQLKRTLTKRYGVLELWEIIVIALFAAFIVILVLSVWLSFRKKSKRSNATTLPVTQSPRFTEEIKEISVDHGSSNNNGTSYQTLDEKFVEDIENGDKFSGSLEKKPLVGSHLPPSTPSTTAPSPLLGLPEVSHIGWGHWFTLRDLQLATNHFSKESIIGDGGYGVVYHGTLTNKTPVAVKKLLNNPGQADKDFRVEVEAIGHVRHKNLVRLLGYCVEGTHRMLVYEYMNNGNLEQWLHGDMIHKGHLTWEARIKVLVGTAKALAYLHEAIEPKVVHRDIKSSNILMDDNFDAKLSDFGLAKLLGADSNYVSTRVMGTFGYVAPEYANSGLLNEKSDVYSYGVVLLEAITGRYPVDYARPKEEVHMVEWLKLMVQQKQFEEVVDKELEIKPTTSELKRALLTALRCVDPDADKRPKMSQVARMLESDEYPVMPREERRRRRNQNAETHRESTDTNKDNDITTDAKI；

SEQ ID NO:14：MGSGLNDTLSRNYNGLELWEIIVIVLSAIFVVVLAISLWLTFRRKTSRSSSNLIPVSRQIPPSVPEEIKEIRVDEVSSSNGGNGYPSISEKFGDKEPEKGIKAESENGDSSRSGSFNHLEKKDGSSVSSANPLTAPSPLSGLPEFSHLGWGHWFTLRDLQMATNQFSRDNIIGDGGYGVVYRGNLVNGTPVAVKKLLNNLGQADKDFRVEVEAIGHVRHKNLVRLLGYCMEGTQRMLVYEYVNNGNLEQWLRGDNQNHEYLTWEARVKILIGTAKALAYLHEAIEPKVVHRDIKSSNILIDDKFNSKISDFGLAKLLGADKSFITTRVMGTFGYVAPEYANSGLLNEKSDVYSFGVVLLEAITGRYPVDYARPPPEVHLVEWLKMMVQQRRSEEVVDPNLETKPSTSALKRTLLTALRCVDPMSEKRPRMSQVARMLESEEYPIAREDRRRRRSQNGTTRDSDPPRNSTDTDKSEYHDLKPEGG；

SEQ ID NO:15：MPPESSLNAEMSKKISFFGLKGLKLWVWVCLVVGVFIVMILCILSLWITFRRKSRRSSSKFPFNQIPHVSKDIRVDRAGFQNPHPESLYIEMNDKSTGKTMMSHLGRTKSSDNDTLSQCSSVNHHERACSSHSGEEGGFGSAGRQYGGGPVTASPLVGLPEISHLGWGHWFTLRDLELATNRFAPVNVLGEGGYGVVYRGKLVNGTEVAVKKLLNNLGQAEKEFRVEVEAIGHVRHKNLVRLLGYCIEGVHRMLVYEYVNSGNLEQWLHGAMRQHGNLTWEARMKIITGTAQALAYLHEAIEPKVVHRDIKASNILIDDEFNAKLSDFGLAKLLDSGESHITTRVMGTFGYVAPEYANTGLLNEKSDIYSFGVLLLEAITGRDPVDYGRPANEVNLVEWLKMMVGTRRAEEVVDPRLEPRPSKSALKRALLVSLRCVDPEAEKRPRMSQVARMLESDEHPFHKERRNKRSKTAGMEIVETKDESLGPSGSETKP；

SEQ ID NO:16：MSSESSLSADMSKKVSFLGLKGMKLWVLICLVVGTFVVLVFCILSLWIAFRRKSRRSSHKLLPFSQIPRVAKDIRVDDRVGFQNHNENLSITNADKSSDRNSGKMMSYLGRTKSSDNDSISQCSSVHHHERACSSHSGEDGSFGAAWRQNSLSQGGLVTASPLVGLPEISHLGWGHWFTLRDLQLATNRFAAENVIGEGGYGVVYKGRLINGNDVAVKKLLNNLGQAEKEFRVEVEAIGHVRHKNLVRLLGYCIEGVNRMLVYEYVNSGNLEQWLHGAMGKQSTLTWEARMKILVGTAQALAYLHEAIEPKVVHRDIKASNILIDDDFNAKLSDFGLAKLLDSGESHITTRVMGTFGYVAPEYANTGLLNEKSDIYSFGVLLLETITGRDPVDYERPANEVNLVEWLKMMVGTRRAEEVVDSRIEPPPATRALKRALLVALRCVDPEAQKRPKMSQVVRMLESDEHPFREERRNRKSRTASMEIVETTEESADTSKGPGHSENTTKPEKTHV；

SEQ ID NO:17：MAGLKIWQAIFITIALIIIVVLSVLSFCLIWKKKSRRSKTLSLPIIQTPVVSKEIKEVRIEHVVSTSSNFDPQDENNNESDKFLLNLEMEKNRENGLSSSRSGSGKEGYLCVANRSTSSLYEMATPSPSPLSGLPESHLGWGHWFTLRDLEIATNRFSKENVIGEGGYGVVYRGELVNGSLVAVKKILNHLGQAEKEFRVEVDAIGHVRHKNLVRLLGYCIEGTNRILVYEYMNNGNLEEWLHGAMKHHGYLTWEARMKVLTGTSKALAYLHEAIEPKVVHRDIKSSNILIDDRFNAKISDFGLAKLLGDGKSHVTTRVMGTFGYVAPEYANTGLLNEKSDVYSFGVLVLEAITGRDPVDYARPANEVNLVEWLKMMVGSKRLEEVIDPNIAVRPATRALKRVLLTALRCIDPDSEKRPKMSQVVRMLESEEYPVPREERRVRRTQEENSDTDRSRPVSRSQSKRL。

SEQ ID NO:18：MGGDLKSQLSRESHVFGLKVWEVIGIAVALLIIAILSVLSCCLTSKKKSRRSKTGLPVIQTPPVVSKEIREVRVEHVSASNFAPGEGILLTIQDKNNKDSEKVMVHLDMRKKRSSSGRSGSFHHLEIIDKHSDSAEEVSASSSLYNIATPSPLSGLPESHLGWGHWFTLRDLETATNRFSKENVIGEGGYGVVYRGELMNGTPVAVKKILNQLGQAEKEFRVEVDAIGHVRHKNLVRLLGYCIEGTHRILVYEYVNNGNLEQWLHGAMRQHGYLTWEARMKVLIGTSKALAYLHEAIEPKVVHRDIKSSNILINDEFNAKVSDFGLAKLLGAGKSHVTTRVMGTFGYVAPEYANSGLLNEKSDVYSFGVVLLEAITGRDPVDYGRPAHEVNLVDWLKMMVGTRRSEEVVDPNIEVKPPTRSLKRALLTALRCVDPDSDKRPKMSQVVRMLESEEYPIPREDRRRSRTREGSMEINSDTDMSTPVSRSQSKRQ。

在本发明中，所述植物优选包括拟南芥，更优选包括拟南芥种子。

本发明还提供了一种培育低植酸植物的方法，包括：降低目的植物中PICKs基因的表达，或降低目的植物中所述PICKs基因编码蛋白的含量，得到所述低植酸植物。本发明所述植物优选包括拟南芥。本发明所述PICKs基因的核苷酸序列以及所述PICKs基因编码的蛋白的氨基酸序列在上述技术方案中已进行记载，不再进行赘述。

本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为为下述A1～A4中的至少一种：A1：用于敲除权利要求1所述应用中PICKs基因的核酸分子；A2：含有A1所述核酸分子的重组表达载体；A3：含有A1所述核酸分子的重组微生物；A4：含有A2所述重组表达载体的重组微生物。本发明所述生物材料已在上述技术方案中进行了具体限定和描述，不再进行赘述。

本发明所述低植酸植物是通过向所述目的植物中导入敲除所述PICKs基因的核酸分子得到的植物。本发明所述敲除所述PICKs基因的核酸分子优选包括用于敲除PICK5的核酸分子、用于敲除PICK6的核酸分子和T-DNA序列中的多种，更优选为用于敲除PICK5的核酸分子、用于敲除PICK6的核酸分子和T-DNA序列。在本发明中，所述低植酸植物是优选通过向敲除PICK1、PICK2、PICK3和PICK4基因的四突突变体T-4m中导入敲除所述PICK5基因的核酸分子和敲除所述PICK6基因的核酸分子得到的植物。本发明所述四突突变体T-4m的获得方法优选为：将突变体pick1(SALK_047485C)，pick2(SAIL_916_B10)，pick3(SALK_026210C)和pick4(SAIL_913_F05)进行杂交获得，本发明所述突变体pick1(SALK_047485C)，pick2(SAIL_916_B10)，pick3(SALK_026210C)和pick4(SAIL_913_F05)购买于拟南芥种子资源中心(http://abrc.osu.edu)。本发明所述杂交方法优选为人工授粉。本发明对所述导入的方式没有特殊限定，采用本领域中常规的转基因步骤即可。

本发明通过敲除植物中的PICKs基因，即敲除目的植物中的PICK1、PICK2、PICK3、PICK4、PICK5和PICK6基因中的至少四种，降低PICKs基因在植物中的表达量或直接影响编码蛋白的功能，使植物中尤其是植物种子中的植酸含量显著减少，得到低植酸植物种质，为低植酸植物的育种提供重要的技术支持。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

T-DNA插入突变体picks纯合性鉴定及四突突变体T-4m的构建：

从拟南芥种子资源中心(http://abrc.osu.edu)购买获得四个T-DNA插入单突突变体pick1(SALK_047485C)，pick2(SAIL_916_B10)，pick3(SALK_026210C)和pick4(SAIL_913_F05)，插入位置信息如图1所示，并且通过三引物法进行T-DNA插入突变体纯合性鉴定，PCR鉴定体系参考诺唯赞(Vazyme)高保真酶说明书，鉴定结果表明均纯合，如图2所示，其中LB，LP指的是三引物鉴定法所设计的上游引物，RP指的是下游引物，LP+RP扩增得到的条带大小均为800-900bp左右，LB+RP扩增得到的条带大小均为500bp左右。

所述鉴定引物为：

PICK1-LP:5'-AAGACCGAAATCAGATAACTTTGC-3'(SEQ ID NO:19)；

PICK1-RP:5'-TCCTCTTTCCACTGATCTTTTAGG-3'(SEQ ID NO:20)；

PICK2-LP:5'-AACCAAGCCGCCTAACTAGAC-3'(SEQ ID NO:21)；

PICK2-RP:5'-TTCAGTTCTCAGACCAAACGC-3'(SEQ ID NO:22)；

PICK3-LP:5'-TTTAGGCTACCTCATTAGCTGGAC-3'(SEQ ID NO:23)；

PICK3-RP:5'-TAGTTCTCACTCTGGTGAAGATGG-3'(SEQ ID NO:24)；

PICK4-LP:5'-TTCCCAAGTGAGATTTCCATG-3'(SEQ ID NO:25)；

PICK4-RP:5'-CCATTGCTTCTACGCTTTCTG-3'(SEQ ID NO:26)。

野生型Col-0(哥伦比亚野生型)和pick1-pick4突变体植株的幼嫩全株小苗取样提取RNA，经逆转录，采用TOYOBO公司SYBR Green Realtime PCRMasterMix进行荧光实时定量PCR检测，以Actin2基因作为内参；检测体系和所用引物如下：

所用荧光实时定量PCR反应引物为：

qPICK1-F：5'-AAAGCCCTCGCTTTACCGAA-3'(SEQ ID NO:27)；

qPICK1-R：5'-CGCCATTCTCGATGTCCTCA-3'(SEQ ID NO:28)；

qPICK2-F：5'-ATGGCTCCGTGGAGACAATC-3'(SEQ ID NO:29)；

qPICK2-R：5'-CTTTTGGCTCAATCGCCTCG-3'(SEQ ID NO:30)；

qPICK3-F：5'-CGCAGGCGCTTGCTTATTTA-3'(SEQ ID NO:31)；

qPICK3-R：5'-AGCATATTCGGGTGCGACAT-3'(SEQ ID NO:32)；

qPICK4-F：5'-CTCACTTGGGAAGCACGGAT-3'(SEQ ID NO:33)；

qPICK4-R：5'-ACTCTCACCCGAGTCCAAGA-3'(SEQ ID NO:34)；

qActin2-F:5'-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3'(SEQ ID NO:35)；

qActin2-R:5'-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3'(SEQ ID NO:36)。

荧光实时定量PCR的反应程序如下：

预变性：95℃，1min；PCR循环：95℃，15秒；60℃，15秒；72℃，45秒(40个循环)。

荧光实时定量PCR的反应体系(10μL)为：

SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5μL，qPICKs-F(10μM)0.1μL，qPICKs-R(10μM)0.1μL，超纯水4.6μL，反转产物(1000ng)0.2μL。

检测后发现，相比野生型，各T-DNA插入突变体体内相应目标基因的表达量显著受到抑制，如图3所示。

进一步通过人工授粉及纯合性鉴定获得纯合T-DNA插入四突突变体，命名为T-4m。

人工授粉的具体过程为：选择拟南芥植株花粉活力旺盛的时间，用镊子将已盛开的父本花朵小心剥去花萼和花瓣，露出雄蕊。另外选择母本露白但未盛开的花朵用镊子去除花瓣及雄蕊，露出花柱。最后将父本的雄蕊在母本的花柱上反复涂抹数次，完成杂交。

通过将pick1和pick2单突变体杂交以及pick3和pick4单突变体杂交先分别构建双突变体(pick1 pick2和pick3 pick4)，再通过将这两个纯合的双突变体再次进行杂交，最终获得四突变体T-4m。

实施例2

参与调控植物种子植酸合成调控基因PICK5和PICK6基因的CRISPR载体构建：

在线设计靶点引物，将引物进行退火，退火条件为：37℃，30min；95℃，5min；25℃，6min，下降速率为0.2℃/s。

靶点上下游引物分别为：

PICK5上游引物：5'-GATTGTTGTCAACCTTCATTCATAGAGG-3'(SEQ ID No:9)；

PICK5下游引物：5'-AAACCCTCTATGAATGAAGGTTGACAAC-3'(SEQ ID No:10)；

PICK6上游引物：5'-GGTCACAGCACCAAGCAACTTAGCAAGG-3'(SEQ ID No:11)；

PICK6下游引物：5'-AAACCCTTGCTAAGTTGCTTGGTGCTGT-3'(SEQ ID No:12)。

18T-pAtU6chim(载体图谱见图4)，18T-U3bchim(载体图谱见图5)载体分别通过Bbs I酶切，酶切体系参考Thermo FastDigest说明书，之后进行胶回收，回收步骤参考MAGEN的琼脂糖凝胶DN A回收试剂盒说明书(HiPure Gel Pure DNA Mini Kit)，获得酶切后的线性载体。将退过火的引物与酶切后的线性载体通过T4连接酶(NEB，反应体系条件参考说明书)连接(PICK5与18T-pAt U6chim连接；PICK6与18T-U3bchim连接)，连接产物通过热激法转化到大肠杆菌DH5α中，并均匀涂抹在含有50mg/L氨苄青霉素(Amp)的抗性板上，37℃过夜培养，次日挑取单克隆进行测序验证。以带有目标靶标序列的重组18T-pAtU6chim，18T-U3bchim质粒为模板，用M13F/R引物对分别进行PCR(M13F/R引物具体为：M13F：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'(SEQ ID No:37)；M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'(SEQ ID No:38))，扩增出带有靶点的目标序列，扩增体系参考Vazyme高保真酶说明书(2×Phanta MaxMaster Mix)，胶回收产物用相应的限制性内切酶对目标序列进行酶切回收(Hind III和Xho I酶切以18T-pAtU6chim为模板的回收产物；Xho I和Xba I酶切以18T-U3bchim为模板的回收产物)。pEx-pAtUBQ-Cas9空载质粒(图谱见图6)通过Hind III和Xba I酶切回收获得线性载体，并与上一步获得的2种酶切回收产物进行T4连接。连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α中，并均匀涂抹在含有50mg/L卡纳霉素(Kana)的抗性板上，37℃过夜培养，次日挑取单克隆进行测序验证。最终获得带有PICK5和PICK6靶标序列的Cas9敲除质粒。

实施例3

拟南芥的转化方法

将0.5μg实施例2制备的Cas9敲除质粒转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系GV3101感受态细胞中，依次冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min和冰浴5min后，加入无抗LB液体培养基于28℃摇床中活化1h，得含有双元质粒载体的农杆菌菌株。用制备的含有双元质粒载体的GV3101菌株来转化拟南芥，具体步骤如下：

将含有双元质粒载体的GV3101菌株在含有50mg/L的卡那霉素(Kan)和50mg/L的利福平(Rif)的LB培养基中，28℃振荡过夜培养至OD600时吸光值为1.0，在4000rpm条件下离心15min收集菌体，并用含有50g/L蔗糖的1/2MS培养基重悬。并选取已经抽薹并部分完成开花的T-4m突变体拟南芥作为转基因材料，减去已成熟的荚果，保留花和花苞，采用抽真空转化法，将拟南芥地上部分浸染到上述制备的菌液中，真空抽取5min后，在黑暗、23℃条件下培养24h后，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选1周后获得抗性苗，移栽土壤培养后收获转基因一代(T1代)种子。T1代种子通过在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上再筛选一代后得到纯合的转基因T2代材料。

实施例4

目的基因敲除情况检测方法

野生型和敲除转基因植株的幼嫩全株小苗取样提取DNA，进行PCR扩增，测序鉴定目标基因突变情况，PCR体系和测序所用引物如下：

所用PCR扩增反应引物为：

PICK5-PCR-F：5'-GTGTAATATAAAAGATCGGACAGT-3'(SEQ ID NO:39)；PICK5-PCR-R：5'-TATCCTGTTTGTGCCTTCAATGCAG-3'(SEQ ID NO:40)；PICK6-PCR-F：5'-TGTTCTGAATAATGTAATTGACTA-3'(SEQ ID NO:41)；PICK6-PCR-R：5'-AGAACAACACCAAAGCTGTAGACA-3'(SEQ ID NO:42)。

PCR扩增反应程序如下：

使用扩增体系参考Vazyme高保真酶说明书(2×PhantaMaxMaster Mix)，PCR扩增的反应程序为：预变性：94℃，2min；变性：98℃，10s，退火58℃，30s，延伸72℃，1min(34个循环)；终延伸：72℃，7min。

测序后发现，相比野生型株系，在CRISPR敲除转基因植株中PICK5基因的CDS区在142-143bp之间插入碱基C/G，如图7所示，但PICK6无法获得纯合的突变位点，进一步观察发现六突突变体纯合胚胎致死，因此只获得五突纯合突变体，命名为C-5m，说明PICK1-6不仅影响植酸合成，而且对于植物的正常发育也十分重要。

实施例5

PICKs基因确实参与了植物种子植酸合成通路，如下的对比实验：

种子植酸含量的检测：

称取0.1g干燥种子，用研钵加入液氮研磨后迅速加入5mL事先预冷过的1M高氯酸溶液，将溶液收集于50mL离心管，水平放置于冰盒，并在摇床上孵育15min，接着12000g，4℃离心10min，转移上清到一新的50mL离心管，用0.45μm过滤器过滤至事先装有30mg TiO

配制33.3％浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶(5.285mL40％甲肼，635μL 10×TBE(108gTris，55g硼酸，7.44g EDTA-Na2，超声溶解)，367μL ddH

结果表明，T-DNA插入四突突变体T-4m种子中植酸含量较野生型显著降低，且CRISPR敲除获得的五突突变体C-5m种子中的植酸含量较T-4m进一步下降。具体见图8(其中C-5m-1和C-5m-2分别表示两个生物学重复)，说明基因PICKs确实参与了植物种子植酸含量的调控。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。