一种衍生MSCs来源外泌体制备方法及制备的外泌体和应用

技术领域

本发明涉及细胞外泌体制备技术领域，具体涉及一种衍生MSCs来源外泌体制备方法及制备的外泌体和应用。

背景技术

外泌体(Exosomes，Exo)是一种天然细胞来源的双层小泡，因其免疫原性低、天然细胞来源、可以穿透血脑屏障、体内稳定性高等特性，近年来已作为理想的药物载体被运用于肿瘤治疗研究中。由于Exo由细胞分泌产生，带有来源细胞的相应细胞成分，故根据来源细胞的不同，不同的Exo具有不同的特性。间充质干细胞(MSCs)由于其具有一定的肿瘤趋向性和不断增殖的干细胞特性，在肿瘤治疗领域中，是Exo来源细胞的最好选择。除此之外，MSC s来源Exo的抗肿瘤治疗应用还可以规避细胞治疗所带来的不利影响，在被注射到体内后，不会发展为癌细胞，可以作为干细胞治疗的代替策略，安全性更高，更适合于临床应用。

MSCs来源外泌体在肿瘤治疗领域具有令人兴奋的优势，但如何建立一个稳定的且无限生产MSCs-Exo平台至关重要。目前MSCs主要通过人骨髓或脂肪组织提取分离获得，但该方法获得的MSCs会随着体外培养时间的延长以及生长代次的增加，细胞增殖能力和分化潜能逐渐下降，这为推向肿瘤治疗的临床应用带来了不确定性，所以一个安全且稳定的MSCs来源迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种衍生MSCs来源外泌体制备方法及制备的外泌体和应用，以解决现有技术获得的MSCs会随着体外培养时间的延长以及生长代次的增加，使得细胞增殖能力和分化潜能逐渐下降的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种衍生MSCs来源外泌体制备方法，包括如下步骤：

(1)同源重组连接构建mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL打靶载体，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示；

(2)mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL核转人iPSCs后，经过G418药物连续筛选6～7天，获得阳性克隆AT-iPSCs细胞，扩增培养备用；

(3)将扩增所得AT-iPSCs细胞定向分化成AT-iMSCs细胞；

(4)培养AT-iMSCs细胞，联合连续离心、超滤浓缩和聚合物沉淀法从细胞上清中提取得到外泌体AT-iMSCs-Exo。

SEQ ID NO:1：gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgatcgcggttctattttgttggttttcggaactgaggccatgattaagagggacggccgggggcattcgtattgcgccgctagaggtgaaattcttggaccggcgcaagacggaccagagcgaaagcatttgccaagaatgttttcattaatcaagaacgaaagtcggaggttcgaagacgatcagataccgtcgtagttccgaccataaacgatgccgaccggcgatgcggcggcgttattcccatgacccgccgggcagcttccgggaaaccaaagtctttgggttccggggggagtatggttgcaaagctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaacctcacccggcccggacacggacaggattgacagattgatagctctttctcgattccgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctggttaattccgataacgaacgagactctggcatgctaactagttacgcgacccccgagcggtcggcgtcccccaacttcttagagggacaagtggcgttcagccacccgagattgagcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtccggggctgcacgcgcgctacactgactggctcagcgtgtgcctaccctacgccggcaggcgcgggtaacccgttgaaccccattcgtgatggggatcggggattgcaattattccccatgaacgagggaattcccgagtaagtgcgggtcataagcttgcgttgattaagtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattggatggtttagtgaggccctcggatcggccccgccggggtcggcccacggccctggcggagcgctgagaagacggtcgaacttgactatctagtgctagaccggtcttaagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttataattcccccctctccctccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatccatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgctagggctagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccccgcggttaattaaatggggcgagtgcagctcttcgagatcagcctgagccacggccgcgtcgtctacagccccggggagccgttggctgggaccgtgcgcgtgcgcctgggggcaccgctgccgttccgagccatccgggtgacctgcataggttcctgcggggtctccaacaaggctaatgacacagcgtgggtagtggaggagggttacttcaacagttccctgtcgctggcagacaaggggagcctgcccgctggagagcacagcttccccttccagttcctgcttcctgccactgcacccacgtcctttgagggtcctttcgggaagatcgtgcaccaggtgagggccgccatccacacgccacggttttccaaggatcacaagtgcagcctcgtgttctatatcttgagccccttgaacctgaacagcatcccagacattgagcaacccaacgtggcctctgccaccaagaagttctcctacaagctggtgaagacgggcagcgtggtcctcacagccagcactgatctccgcggctatgtggtggggcaggcactgcagctgcatgccgacgttgagaaccagtcaggcaaggacaccagccctgtggtggccagtctgctgcagaaagtgtcctataaggccaagcgctggatccacgacgtacggaccattgcggaggtggagggtgcgggcgtcaaggcctggcggcgggcgcagtggcacgagcagatcctggtgcctgccttgccccagtcggccctgccgggctgcagcctcatccacatcgactactacttacaggtctctctgaaggcgccggaagctactgtgaccctcccggtcttcattggcaatattgctgtgaaccatgccccagtgagcccccggccaggcctggggctgcctcctggggccccacccctggtggtgccttccgcaccaccccaggaggaggctgaggctgaggctgcggctggcggcccccacttcttggaccccgtcttcctctccaccaagagccattcgcagcggcagcccctgctggccaccttgagttctgtgcctggtgcgccggagccctgccctcaggatggcagccctgcctcacacccgctgcaccctcccttgtgcatttcaacaggtgccactgtcccctactttgcagagggctccggggggccagtgcccactaccagcaccttgattcttcctccagagtacagttcttggggctacccctatggtgagtcgacagccagggcttggcagggaggggacgccaagagccccacgcagaccctgctttcttcccgcagaggccccaccgtcttaatggctatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaacaattgaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgctctagaggatccctagcactagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaacggagcccggagggcgaggcccgcggcggcgccgccgccgccgcgcgcttccctccgcacacccacccccccaccgcgacgcggcgcgtgcgcgggcggggcccgcgtgcccgttcgttcgctcgctcgttcgttcgccgcccggccccgccggccgcgagagccggagaactcgggagggagacggggagagagagagagagagagagagagagaaagaagggcgtgtcgttggtgtgcgcgtgtcgtggggccggcgggcggcggggagcggtccccggccgcggccccgacgacgtgggtgtcggcgggcgcgggggcggttctcggcggcgtcgcggcgggtctgggggggtctcggtgccctcctccccgccggggcccgtcgtccggccccgccgcgccggctccccgtcttcggggccggccggattcccgtcgcctccgccgcgccgctccgcgccgccgggcacggccccgctcgctctccccggccttcccgctagggcgtctcgagggtcatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactata。

更优地，步骤(1)中mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL打靶载体的构建过程为：

a.以HEK293T的cDNA为模板，以如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的1-AR-F/2-ZAR-R为引物，进行PCR扩增，得到带有PacI酶切位点的ARRDC1序列片段；

SEQ ID NO:2：5'-ccgggatccccgcggttaattaaatggggcgagtgcag-3'；

SEQ ID NO:3：5'-ctcctccacctaagacggtggggcctctgcgggaagaa-3'；

b.通过化学合成如SEQ ID NO:4所示的Linker-ILZ，并将其连接至pEGM-T载体中，获得了ILZ-T载体；以ILZ-T载体为模板，以如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的3-ARZ-F/4-TRZ-R为引物，进行PCR扩增，得到可以与ARRDC1和TRAIL相互融合的Linker-ILZ序列片段；

SEQ ID NO:4：ggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgatgaagcagatcgaggacaaaatt gaggaaatcctgtccaagatttaccacatcgagaacgagatcgcccggattaagaaactcattggcgagagggaa；

SEQ ID NO:5：5'-cgtcttaggtggaggaggctctgg-3'；

SEQ ID NO:6：5'-atagccatttccctctcgccaatgagttt-3'；

c.以HEK293T的cDNA为模板，以如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示5-ZTR-F/6-TR-R为引物，进行PCR扩增，得到带有MfeI酶切位点的TRAIL基因序列片段；

SEQ ID NO:7：5’-agagggaaatggctatgatggaggtc-3’；

SEQ ID NO:8：5’-tgcaataaacaagttcaattgttagccaactaaaaaggcccc-3’；

d.将PacI酶和MfeI酶双酶切线性化的minipHrn载体与以上三个可以依次融合连接的片段：ARRDC1、Linker-ILZ、TRAIL进行同源重组连接，即构建成：minipHrn-ARRDC1-TRAIL载体。

更进一步地，步骤d采用Vazyme公司ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组克隆试剂盒进行同源重组连接。

更优地，步骤(2)核转使用的核转试剂盒为LONZA公司的Amaxa Human Stem CellNucleofector Starter Kit核转试剂盒。

更优地，步骤(3)定向分化使用的试剂盒为STEM CELL公司的STE Mdiff

上述的衍生MSCs来源外泌体制备方法制备的外泌体。

所述的外泌体在制备肿瘤细胞体外抑制药物中的应用。

综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

本发明通过构建携带ARRDC1-TRAIL融合基因的rDNA区打靶载体mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL，并将融合基因定点整合至人iPSCs的rDNA区，随后将经基因编辑的iPSCs向iMSCs诱导分化，验证该iMSCs的细胞特性，并检测外源基因在iMSCs中的表达情况，最终发现能够以AT-iMSCs为细胞基础，大量获取AT-iMSCs来源Exo，大大提高了外泌体的产量；探究Exo体外抗肿瘤作用发现AT-iMSCs来源的Exo不仅保留了MSCs来源Exo的特性，还能表达TRAIL蛋白，使其具有广谱抗肿瘤作用。

附图说明

图1为mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体的构建图，其中，A为mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体结构示意图；B为mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体ARRDC1-TRAIL融合序列PCR鉴定图；C为mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体测序结果图。

图2为qRT-PCR检测外源ARRDC1-TRAIL的相对表达图，通过qRT-PCR在瞬转不同质粒的293T(TRAIL，ARRDC1-TRAIL)的细胞和Exo中检测外源基因的mRNA转录水平。以TRAIL组作为对照，瞬转ARRDC1-TRAIL的293T外泌体中外源基因的转录水平显著高于细胞中的外源基因转录水平(每组n＝3，*p<0.05，**p<0.01，t tests)；

图3为Western Blot检测外源ARRDC1-TRAIL蛋白的相对表达图，通过WesternBlot检测瞬转不同质粒的293T(SITE空质粒，TRAIL，ARRDC1-TRAIL)的细胞(A)和Exo(B)裂解液中ARRDC1-TRAIL蛋白表达情况；细胞蛋白和Exo蛋白上样量均为10ug；

图4为NTA检测Exo的相对浓度图，纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量了瞬转不同质粒的293T(SITE空质粒，TRAIL，ARRDC1-TRAIL)产生的Exo的大小和浓度，瞬转ARTR的293T-Exo相对于TR-293T-Exo浓度明显上升(每组n＝3，*p<0.05,**p<0.01,One-way AN OVA)；

图5为质粒转导H1299细胞形态图，分别将SITE空质粒、TRAIL、ARRDC1-TRAIL质粒转染H1299肿瘤细胞，转染48h后观察肿瘤细胞形态图；

图6为minipHrn-ARRDC1-TRAIL质粒体外诱导肿瘤细胞凋亡，分别将SITE空质粒、TRAI L、ARRDC1-TRAIL质粒转染H1299肿瘤细胞，转染48h后流式检测肿瘤细胞凋亡情况；

图7为minipHrn-ARRDC1-TRAIL定点靶入策略示意图，白色框显示LHA左侧同源臂(Gen Bank U13369:4533–5467)和RHA右侧同源臂(GenBank U13369:5468–6064)，载体包括两个表达框，分别是筛选基因新霉素磷酸转移酶(Neo)表达框和由CMV启动子驱动的ARRDC1-TRAIL表达框。筛选基因Neo表达框由来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV-IRES)、NEO基因编码序列和SV40 polyA多聚腺苷酸信号共同组成，依靠核糖体基因自身的启动子来驱动其表达；

图8为阳性iPSCs克隆的PCR鉴定结果图，其中，A为阳性克隆跨上下游同源臂区PCR扩增结果；B为阳性克隆PCR产物测序结果；

图9为定点整合前后iPSCs核型检测图，染色体核型分析结果显示，正常iPSCs(左)与ARRDC1-TRAIL定点整合iPSCs克隆(右)的核型一致。

图10为qRT-PCR检测外源iPSCs标志基因的相对表达图，qRT-PCR检测hiPSCs和ARRD C1-TRAIL-iPSCs中hTERT、Nanog、Oct-4和Sox-2的mRNA转录水平(每组n＝3，two-wayANOVA)；

图11为qRT-PCR检测外源ARRDC1-TRAIL的相对表达图，利用RT-qPCR检测对照iPSCs和阳性iPSCs(AT5-1、AT5-3、AT5-5、AT5-9、AT5-11、AT5-16、AT5-17、AT5-18、AT5-20)中ARRDC1-TRAIL的mRNA转录水平。AT-iPSCs中ARRDC1-TRAIL的转录水平显著高于对照iPSCs(每组n＝3；*p<0.05,**p<0.01,****<0.0001,One-way ANOVA)；

图12为Western Blot检测外源ARRDC1-TRAIL的相对表达图，利用Western Blot检测对照iPSCs和定点整合iPSCs(AT5-1、AT5-3、AT5-5、AT5-9、AT5-11、AT5-16、AT5-17、AT5-18、AT5-20)中ARRDC1-TRAIL的蛋白翻译水平。定点整合iPSCs的ARRDC1-TRAIL蛋白条带明显，且部分颗粒TRAIL的翻译水平显著高于对照iPSCs；

图13为AT-iPSCs-Exo体外诱导肿瘤细胞凋亡形态图；

图14为H1299细胞中ARRDC1-TRAIL的表达情况图，20mL对照hiPSCs及定点整合AT-iPSCs上清提取Exo，与H1299肿瘤细胞共孵育，48h后检测肿瘤细胞中ARRDC1-TRAIL蛋白携带情况；

图15为iPSCs向MSCs诱导分化各时期细胞形态图，A为iPSCs生长汇合时细胞形态图；B为诱导早期中胚层细胞形态图；C为间充质祖细胞的衍生传代第二次形态图；D为呈成纤维细胞样于MSC培养基培养的细胞形态图；

图16A和16B为流式分析iPSCs来源MSCs表面标记结果图；

图17为ARRDC1-TRAIL-iMSCs和iMSCs的成骨、成脂，成软骨细胞分化潜能分析图，iMSCs成骨分化细胞用茜素红染色可见钙沉积；iMSCs成脂分化细胞用油红O染色可见深紫色脂滴颗粒物；iMSCs成软骨分化细胞用阿利辛蓝染色可见蓝色细胞球体；

图18为外源基因在B6-iMSCs、AT5-5-iMSCs中的相对表达检测结果图，其中，A为qRT-PCR检测B6-iMSCs、AT5-5-iMSCs中ARRDC1-TRAIL的mRNA转录水平；(每组n＝3，**p<0.01,t tests)；B和C为对照B6-iMSCs和AT5-5-iMSCs细胞裂解液的Western Blot分析；AT5-5-iMSCs中TRAIL的表达水平比对照B6-iMSCs高1.8倍(每组n＝3，*p<0.05，t tests)；

图19为iMSCs-Exo的表征结果图，其中，A为外泌体TEM图像；B为外泌体NTA粒径分析图像；C.为外泌体标志蛋白CD63、TSG101、CD9 Westerm blotting分析；

图20为外源基因在B6-iMSCs-Exo、AT5-5-iMSCs-Exo中的相对表达检测结果图，Western Blot检测对照B6-iMSCs-Exo和AT5-5-iMSCs-Exo细胞裂解液中外源基因的表达情况。AT5-5-iMSCs-Exo中TRAIL的表达水平明显高于比对照B6-iMSCs；

图21为H1299肿瘤细胞体外摄取外泌体的CLSM图。

图22为CCK-8法检测到AT-iMSCs-Exo对MCF-7细胞增殖具有抑制作用图(每组n＝3，*p<0.05，t tests)；

图23为流式分析AT-iMSCs-Exo体外诱导肿瘤细胞H1299凋亡实验图；流式分析结果显示与AT-iMSCs-Exo共孵育的H1299细胞凋亡率为10.73％；与B6-iMSCsExo共孵育的H1299细胞凋亡率为4.95％；H1299自身凋亡率为4.36％。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及各实施例和验证例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和验证例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本法实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明公开的内容。

除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明中的其它未特别注明的原材料、试剂、试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常使用的原材料和试剂，以及通常采用的实验方法和技术手段。

以下实施例的相关试剂和仪器，除自制的外，均为市购。

下面实施例用到的引物序列见表1：

表1引物及其序列

实施例1

本实施例提供的如下方案，构建一种衍生MSCs来源外泌体制备方法：

1、mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体的构建，并验证相关结论

a.以HEK293T的cDNA为模板，以如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的1-AR-F/2-ZAR-R为引物，进行PCR扩增，得到带有PacI酶切位点的ARRDC1序列片段；

SEQ ID NO:2：5'-ccgggatccccgcggttaattaaatggggcgagtgcag-3'；

SEQ ID NO:3：5'-ctcctccacctaagacggtggggcctctgcgggaagaa-3'；

b.通过化学合成如SEQ ID NO:4所示的Linker-ILZ，并将其连接至pEGM-T载体中，获得了ILZ-T载体；以ILZ-T载体为模板，以如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的3-ARZ-F/4-TRZ-R为引物，进行PCR扩增，得到可以与ARRDC1和TRAIL相互融合的Linker-ILZ序列片段；

SEQ ID NO:4：ggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgatgaagcagatcgaggacaaaatt gaggaaatcctgtccaagatttaccacatcgagaacgagatcgcccggattaagaaactcattggcgagagggaa；

SEQ ID NO:5：5'-cgtcttaggtggaggaggctctgg-3'；

SEQ ID NO:6：5'-atagccatttccctctcgccaatgagttt-3'；

c.以HEK293T的cDNA为模板，以如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示5-ZTR-F/6-TR-R为引物，进行PCR扩增，得到带有MfeI酶切位点的TRAIL基因序列片段；

SEQ ID NO:7：5’-agagggaaatggctatgatggaggtc-3’；

SEQ ID NO:8：5’-tgcaataaacaagttcaattgttagccaactaaaaaggcccc-3’；

d.将PacI酶和MfeI酶双酶切线性化的minipHrn载体与以上三个可以依次融合连接的片段：ARRDC1、Linker-ILZ、TRAIL进行同源重组连接，即构建成：minipHrn-ARRDC1-TRAIL载体。

上述PCR扩增的具体操作如下：

采用Vazyme公司的高保真DNA聚合酶2×

PCR循环条件：

琼脂糖凝胶电泳：称取0.6g琼脂糖粉于锥形瓶中；量取60mL0.5×TBE，倒入瓶中，混匀后，放入微波炉中加热3min至液体沸腾，且溶液清澈透亮物明显颗粒，取出室温冷却，配置成1％浓度的琼脂糖凝胶；待胶冷却至不烫手时，加入2uL GelRed核酸染料，摇匀后倒入胶板中，插上宽梳齿；30min后，琼脂糖胶凝固好，拔出梳齿；将配置好的胶放入加满0.5×TBE的电泳槽中，将PCR产物与5×loading混匀，点样，插上电极，主要以正负极对应正确位置，打开电泳仪，180V恒压电泳30min。经过琼脂糖凝胶电泳验证片段大小无误；

PCR产物胶回收：本实验采用Magen公司的HiPure Gel Pure Micro Kit对目的片段进行胶回收，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，最后添加35μL ddH2O洗脱溶解目的DNA片段。

步骤d中，采用pac I酶和Mfe I酶双酶切mini-pHrn载体得到线性化mini-pHrn载体，在37℃酶切8h，酶切体系为：

同源重组连接：将双酶切后线性化的mini-pHrn载体与三个胶回收纯化后的infusion片段连接。采用Vazyme公司ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组克隆试剂盒进行同源重组连接。

反应体系：

用移液器轻轻吸打混匀，瞬离后，将配置好的连接体系置于PCR仪中37℃孵育30min后，立即将其置于冰上冷却。经琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序验证ARTR表达载体大小和序列(如图1所示)。结果证实携带人ARRDC1-TRAIL的非病毒rDNA区打靶载体mini-pHrn-AR RDC1-TRAIL构建成功。

为了确定外源ARRDC1-TRAIL融合基因是否能在细胞系中表达，以及是否能发挥相应的功能，本研究将mini-pHrn-TRAIL载体以及mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体分别瞬转至293T细胞系中，48h后收集细胞和细胞上清，通过试剂盒沉淀法提取上清中的外泌体，使用实时定量PCR和Western Blot分析细胞和外泌体中外源基因的mRNA表达水平以及蛋白表达情况。包括如下实验：

A.将mini-pHrn-TRAIL载体以及mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体分别瞬转至293T细胞系中，准备的材料：Lipofectamine2000，灭菌的1.5mL EP管，OPTI-MEM，HEK293T细胞培养基，灭菌的大、中、小tip，带转染的质粒或DNA，6孔板培养皿，无菌室用的1.5mL EP管架。具体操作如下：

①转染前一天晚上，将HEK293T细胞消化后，以1：4接种于6孔板中，本次实验一共需要4个孔细胞；

②温箱培养过夜，观察细胞，待其汇合度大于30％，可进行转染；

③转染时，取6个灭菌好的EP管，做好标记，其中每管均加入250μL OPTI-MEM培基，将6个管分为A、B两组；

④A组1-3管分别加入2μg转染质粒(mini-pHrn、mini-pHrn-TRAIL、mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL)，分别记为空载组(site)、TR组、ARTR组，混匀，瞬离后，静置5min；

⑤B组1-3管分别加入5μL Lipofectamine2000，混匀瞬离后，静置5min；

⑥将A组混合溶液加入B组EP管中，用移液器抽吸均匀，静置20min；

⑦将B组1-3号EP管分别滴加至3个长有细胞的6孔板的孔洞中，标记为Site、TR、ARTR，对照组细胞加入500μL OPTI-MEM培养基作为对照。

⑧将细胞置于37℃、5％ CO2、饱和湿度温箱培养；

⑨转染后4-6h，进行细胞换液，用大tip吸净剩余的培养基，沿壁加入新鲜的不含Exo的HEK293T细胞培养基，每孔2mL；

⑩转染48h后，收集细胞和细胞上清，用于后续实验鉴定。

B.细胞蛋白的提取，准备材料：2×SDS细胞裂解液，PMSF，Proteinase inhibitorCockt ail，EP管，EP管架，1mL、100μL、10μL移液器，干式恒温仪，1×DPBS。具体操作如下：

①将6孔板中的细胞培养基弃去，用1×DPBS洗2次；

②加入适量的0.05％ Trypsin-EDTA，室温消化至细胞变圆脱落，加入培养基重悬细胞，并转移至1.5mL EP管中，1500g离心5min；

③小心的弃去上清，加入500mL DPBS重悬清洗细胞，1500g离心5min；

④小心的弃去上清，在每个EP管中加入100μL 2×SDS细胞裂解液，添加1/100的PMSF，1/100的Proteinase inhibitor Cocktail，裂解细胞5-10min；

⑤100℃煮10min，使蛋白变性；

⑥12000g离心5min，小心吸取上清，并转移至新的1.5mL EP管中，做好标记，-20℃保存。

C.蛋白BCA定量，准备材料：ddH2O，200μL PCR小管，PCR管架，BCA定量试剂盒，EP管，EP管架，1mL、100μL、10μL移液器，大、中、小三种tip，计时器，干式恒温仪，酶标板或96孔板，酶标仪，5×loading buffer。具体操作如下：

①取出热变性后的蛋白样品，涡旋振荡器片刻振荡混匀，瞬离，取4个200μLPCR小管，往管内加15μL样品和30μL ddH2O中，按1:3稀释成蛋白稀释液；

②取5个200μL PCR小管，在每个PCR小管中加入45μL，在第1个PCR小管中加入45μLBSA标准品(蛋白浓度2mg/mL)，混匀后，吸取45μL混匀后的溶液加至第2个小管中，再次混匀后，吸取45μL混匀后的溶液加入第3个小管中，依次类推，按梯度稀释标准瓶，获得浓度为1mg/mL，0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.125mg/mL，0mg/mL的标准品稀释液，加上初始的2mg/mL蛋白标准品，一共有6个梯度；

③计算总样品数(包括标准品与待检测样品)，取A液(总样品数×2个复孔×200μL)与B液(样品数×2个复孔×200μL/50)，按照50:1的比例混合，混匀后，在酶标板(或96孔板)每个孔中加入200μL；将配好的标准品和待检测样品加入到对应的孔中，每个样品两个复孔，每孔加入20μL样品。

④将酶标板置于37℃隔水式培养温箱中孵育25min；

⑤用酶标仪在吸收光为570nm的波长下检测蛋白的吸光值，根据标准品绘制标准曲线获得标准曲线公式，计算待检测样品的蛋白浓度。

⑥将蛋白样品统一稀释到同一浓度，稀释液用ddH2O，用5×loading buffer按1:4比例与蛋白样品混匀；

⑦100℃煮10min，瞬离后-20℃保存。

D.Western blotting，具体操作如下：

①用清洁剂清洗玻璃板，蒸馏水冲洗。将配制的分离胶上下颠倒摇匀，用微量移液器缓慢加入两玻璃板之间，约加入7mL分离胶，再加入适量ddH2O压平液面，静置1h待分离胶凝固，倒出ddH2O，并用吸水纸吸干液体。配制浓缩胶并混匀，将浓缩胶加至液面与矮玻璃板齐平，将15孔梳齿插入，30min后凝固，将胶放入装有1×Running buffer的电泳槽中，垂直拔取下梳齿；

②根据设计的加样位置，分别向点样孔中等量均匀的加入10μg蛋白样品及5μL蛋白ma rker；

③恒压60V，电泳40min，待marker各条带分离，恒压120V，电泳100min至溴酚蓝跑到分离胶底部时，关闭电源；

④将0.45μm孔径PVDF膜切成5×8cm大小，将转膜用物品全部浸泡至转膜液中，取出凝胶片切除多余胶，按照黑板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板的顺序放入夹子中，去除旗袍，将以上装置，按照白对红，黑对黑的方向放入湿转槽中。放置冰盒，加入转膜液，290mA恒流转膜90min；

⑤将膜放在5％脱脂牛奶封闭液在摇床上封闭处理1h；

⑥俺1:1000稀释比例配置TRAIL一抗稀释液，将膜正面朝上放入抗体稀释液中，4℃，摇床孵育过夜；

⑦回收一抗溶液，将膜用1×TBST清洗三次，每次10min，加入用5％脱脂牛奶配制的兔二抗溶液，室温，摇床孵育90min，将膜用1×TBST清洗三次，每次10min；

⑧1:1配制显影液，在膜上均匀滴加显影液，上机显影；

⑨显影之后，取出PVDF膜加入适量Stripping Buffer室温脱色摇床缓慢摇荡洗膜15min以上；弃去Stripping Buffer，1×TBST洗膜5次，每次均在脱色摇床上快速摇荡，每次5min；再将膜放在5％脱脂牛奶封闭液在摇床上封闭处理1h；封闭后，1:1000的稀释比例配制内参β-actin一抗，摇床孵育过夜；重复⑦⑧步骤，显影内参。

E.细胞RNA的提取，准备材料：0.1％DEPC水配置75％的乙醇，RNA用的大、中、小三种tip，异丙醇，氯仿，TRIzol Reagent细胞裂解液，RNA专用的EP管，1×DPBS，RNase-Free水，1mL、100μL、10μL移液器。具体操作如下：

①将RNA用的大、中、小三种tip，RNA专用的EP管，1×DPBS，EP管架，1mL、100μL、10μL移液器，异丙醇，氯仿放入超净工作台中，紫外灭菌15min；

②将待抽提RNA的12孔板细胞的培养基弃去，用1×DPBS洗一次，加入消化液消化细胞至变圆，弃消化液，培养基重悬至1.5mL EP管，1500g离心5min，弃上清DPBS洗一遍，1500g离心5min，弃干净剩余的DPBS，加入1mL TRIzol Reagent细胞裂解液；

③室温静置5min，加入0.25mL氯仿，用力颠倒混匀十次左右，室温静置5min，室温12000g离心10min；

④收集上层水相转移至新的EP管中，加入0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置10min，室温12000g离心10min；

⑤离心的同时将低温高速离心机预冷到4℃；

⑥小心的弃去上清，加入0.5mL 75％乙醇，轻轻颠倒混匀，4℃12000g离心5min；

⑦小心的弃去上清，并用中tip吸尽残液，放入超净工作台中，风干；

⑧加入50μL的DEPC水溶解30min；

⑨吸取2μL测浓度后，取部分RNA将其稀释成30ng/μL，冻存于-80℃。

F.细胞RNA逆转录，准备材料：RNA用的中和小两种tip，RNA专用的EP管，EP管架，PCR仪，100μL和10μL移液器，200μL PCR小管，PCR管架，

①将RNA用的中和小两种tip，RNA专用的EP管，EP管架，100μL和10μL移液器，PCR管架，放入超净工作台中，紫外灭菌15min；

②去除基因组DNA反应体系为：

③混匀后，42℃2min；

④逆转录反应体系：

⑤逆转录反应条件：37℃15min→85℃5s

⑥将逆转录好的产物直接进行qPCR或储存于-20℃。

G.qPCR，准备材料：RNA用的中和小两种tip，RNA专用的EP管，EP管架，PCR仪，100μL和10μL移液器，Bio-rad CFX96专用的96孔PCR板、膜，PCR管架，Taq Pro Universal SYBRqPCR Master Mix。具体操作如下：

①将RNA用的中和小两种tip，RNA专用的EP管，EP管架，100μL和10μL移液器，PCR管架，Bio-rad CFX96专用的96孔PCR板、膜，放入超净工作台中，紫外灭菌15min；

②将2.3.3.6的逆转录产物用RNase free ddH2O稀释5倍，qPCR反应体系为：

体系中F:qTR-F，qAR-F，qARLT-F，qmGH-F；R:qTR-R，qAR-R，qARLT-R，qmGH-R。

③用Bio-rad CFX96 Touch

④选择设置好板布局即可运行。

H.外泌体的提取，具体操作如下：

①当细胞汇合度达70％以上时，吸弃原培养基，DPBS洗1遍，加入浓度为10％不含Exo的FBS配置的细胞培养基，将细胞置于37℃，5％CO2饱和湿度温箱中培养；

②24h后，收集细胞条件培养基，在4℃300g离心10min，以去除死细胞，后3000g离心10min去除细胞碎片；

③取上清，用0.22μm的针式过滤器过滤，以去除直径大于200nm的大囊泡和其他杂质；

④将滤液加入100kDa超滤离心管，在4℃3000g条件下离心20min，将条件培养基浓缩至100～500μL体积；

⑤在步骤④得到的超滤液中加入适量DPBS，混匀，在4℃2000g离心20min，以清洗浓缩液中的其他杂质；

⑥重复步骤⑤，进一步洗涤浓缩液；

⑦将步骤⑥得到的超滤液吸至无菌EP管中，加入50～100μL的ExoQuick-TC外泌体沉淀剂，轻弹EP管使其混匀，4℃静置过夜；

⑧第二天4℃1500g离心30min，外泌体沉淀位于EP管底部，小心弃去多余的上清，加入适量DPBS重悬外泌体，将外泌体悬液保存至-80℃冰箱；同时DPBS清洗超滤管，并在超滤管内添加适量25％酒精浸泡保存。

I.外泌体蛋白的提取，取10μL外泌体悬液，加入90μL带有1％ PMSF和1％Proteinase inhibitor Cocktail的2×SDS裂解液中，混匀瞬离静置5-10min，100℃煮10min，使蛋白变性；12000g离心5min，小心吸取上清，并转移至新的1.5mL EP管中，做好标记，-20℃保存。

J.外泌体RNA的提取，取50ul外泌体悬液，加入700ul的QIAZOL Lysis Reagent，本实验采用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit对外泌体RNA进行提取，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，最后添加30ul DEPC水至mini柱，洗脱溶解RNA。

结论：

我们使用TRIzol手工抽提收集的两组293T细胞和相应的外泌体中的RNA，并用逆转试剂盒处理RNA样品以消除gDNA的干扰并将RNA逆转为cDNA。随后，通过设计引物qTR-F/R，在Bio-Rad CFX96 touch qPCR系统上进行PCR扩增，以检测外源基因的转录水平。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为扩增的内参基因。统计结果显示，mini-pHrn-ARRDC1-TRAI L载体可以在细胞系中正常转录表达，且以mini-pHrn-TRAIL载体组外源基因在细胞和外泌体中的转录水平作为归一化标准，瞬转mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体组外泌体中的外源基因的转录水平显著高于细胞中外源基因的转录水平，说明相对于单独的TRAIL基因，ARRDC1-TRAIL融合基因的构建有助于外源基因在外泌体中的富集(如图2所示)。

通过Western Blot检测瞬转不同载体的293T细胞培养上清液中外泌体裂解液和细胞裂解液中ARRDC1-TRAIL蛋白的表达水平。结果显示minipHrn-ARRDC1-TRAIL载体可以在细胞系中表达融合蛋白，在细胞裂解液中，ARRDC1-TRAIL融合蛋白显示为一条85kDa大小条带，与预测大小一致。而在外泌体裂解液中，ARRDC1-TRAIL融合蛋白条带很浅，而在70kDa大小位置检测到一条很亮的条带，猜测为TRAIL蛋白的二聚体形式(如图3所示)。这些数据表明，外源基因在293T细胞系中能有效的表达融合蛋白，在外泌体中可能由于蛋白的泛素化，导致融合蛋白断裂，大部分蛋白以TRAIL的二聚体形式存在，少部分以融合蛋白二聚体形式存在，蛋白大小在180kDa左右。

将minipHrn载体、minipHrn-TRAIL载体以及minipHrn-ARRDC1-TRAIL载体分别瞬转至293T细胞系中，48h后对细胞进行计数，并收集细胞上清，提取外泌体进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)，以细胞数作为归一化标准，探究转染不同质粒的293T细胞释放外泌体的相对数量水平。NTA结果显示相对于空载以及TRAIL载体组，转染了ARRDC1-TRAIL基因的293T细胞释放更多的外泌体，具有显著性差异，而转染TRAIL基因的293T与空载组相比，外泌体的释放量没有显著性差异(如图4所示)。

同样的操作，将minipHrn载体、minipHrn-TRAIL载体以及minipHrn-ARRDC1-TRAIL载体分别瞬转至293T细胞系中，H1299肿瘤细胞系中，48h后在显微镜下观察细胞形态，发现相对于空载对照组，TRAIL组和ARRDC1-TRAIL组均出现了明显的细胞死亡形态(如图5所示)。对细胞进行计数，并收集细胞进行流式凋亡检测，结果显示相对于空载对照组，TRAIL组和ARRDC1-TRAIL组均有明显的肿瘤细胞凋亡情况发生(如图6所示)，说明ARRDC1-TRAIL融合基因的表达保留了TRAIL基因的抗肿瘤效果。

2、将mini-pHrn-ARRDC1-TRAIL载体靶入iPSCs的rDNA区，并验证相关结论

(1)iPSCs单细胞核转

使用LONZA公司的Amaxa Human Stem Cell Nucleofector Starter Kit核转试剂盒对iPS Cs进行单细胞核转。

准备材料：mTeSR1培养基、TrypLE Select酶、DPBS，大、中、小枪和tip，EP管架，1.5mL EP管，15mL离心管，铺基质胶，核转试剂盒，核转杯，一次性塑料吸头，红细胞计数板和盖玻片，Y27632。具体操作如下：

①ipsc传代至6孔板，cell长至80％汇合率左右时，准备打靶；

②更换mTeSR1培养基，并以1:1000的比例添加Y27632，另外准备一个6孔板，铺Matrigel；

③2h后，配制核转液，在1.5ml EP管中加入82μL Solution2和18μL Supplement1，混匀，室温静置15min；

④等待期间，吸弃mTeSR1培养基，用1×DPBS洗涤细胞3～5次，加入0.5mL TrypL ESelect酶消化细胞，温箱消化5分钟，轻轻拍打6孔板，在镜下观察发现细胞变圆并逐渐脱落时，加入2mL mTesR1培养基终止消化，用大Tip将脱落的细胞吹下并重悬成单细胞悬液，转移至15mL离心管中；

⑤细胞计数，取10uL细胞悬液稀释5倍，混匀后，取10uL细胞稀释液，用红细胞计数板对细胞进行计数，通常核转的细胞量需大于106个；

⑥15min到后，将5μg的打靶质粒和5μg核酸工具酶质粒(上、下游)加入其中混匀，室温静置5min以上；

⑦175g离心5min；

⑧准备核转杯和一次性塑料吸头，大tip吸弃离心管中上清，中tip吸干净，用中tip将含有混合质粒的核转液重悬iPSCs，并将其转移至LONZA核转杯中，注意用中tip轻轻重悬细胞，沿着核转杯的壁加，核转杯轻轻敲击桌面以去除气泡，转移时在杯中尽量避免产生气泡，按电源键，打开核转仪器，按下方的左右键，调剂核转程序至B-016，将核转杯放入核转仪中，注意突出的一面对应核转仪中凹进去的一面，按2次X键进行核转，核转大概1-2s完成，核转完成后，立即将500μL mTesR1培养基加入核转杯中，室温静置5min；

⑨吸弃Matrigel，往铺了Matrigel的六孔板中加入1.7mL mTesR1培养基，用一次性塑料吸头轻柔混匀以中和细胞，将核转后的细胞悬液逐滴接种至两个铺了Matrigel的六孔板中，并加入终浓度为10μM的Y27632；

⑩十字摇匀后放至温箱中培养，核转12-16h对细胞换液，并添加终浓度为10μM的Y27632。

(2)G418筛选抗性克隆

①核转24-36h后观察细胞汇合率，当细胞长至汇合率30％左右时，加含Y的培养基对细胞进行换液，并添加终浓度为50ng/mL的G418(厂家:Sigma)进行筛选；

②每天换液，经过G418药物连续筛选约6-7天后，非抗性细胞克隆经过药物的筛选会逐渐脱落死亡，只有抗性克隆可以存活下来；

③停止加药后，待细胞长至50％时，进行单细胞接种；

④iPSCs单细胞接种：取500ul的TrypLE Select温箱消化抗性克隆5min，吸弃消化液，加入2mL mTeSR1培养基终止消化，轻轻吹打细胞将其重悬成单细胞悬液状态，细胞计数后于室温175g离心5min；

⑤梯度稀释，接种1000个细胞至含有3mL 10％cloneR浓度的mTesR培养基6cmdish中，十字摇匀放入温箱中；

⑥接种当天记为d0，d2全换液，即添加3mL含cloneR的mTesR，换液的时候不要吹打cell，动作轻柔；

⑦d4往后每天全换液，不用加cloneR；

⑧培养约12d，可以看到单克隆团长至10倍镜半个视野大小，准备挑克隆；

⑨挑克隆：在包被了Matrigel的48孔板装好300uL mTesR培养基，在显微镜下打开6cm dish，压下小枪的气压量程，显微镜下通过小Tip轻轻前后戳动克隆团，放开气压量程，将克隆团吸起，转移至48孔板中，抽吸几下，确保克隆团转移至48孔板中，标记序号；

⑩待细胞扩增后，对其进行传代，并用于后续鉴定实验。

(3)苯酚-氯仿法抽提iPSCs细胞gDNA，具体操作如下：

准备的材料：0.5mM EDTA，1×细胞核裂解液，RNase，蛋白酶K，10％的SDS，1.5mLEP管，Tris饱和酚，氯仿，-20℃预冷的无水乙醇与70％的乙醇，含Ca2+、Mg2+的PBS(或1×DPBS)将细胞轻轻吹下。

①当iPSCs汇合度达到70％以上时，用0.5mM的EDTA润洗一次后，再添加适量的EDTA 37℃消化4min，吸弃EDTA，加1mL适量DPBS将细胞轻轻吹下，转入1.5mL EP管中；

②395g室温离心5min；

③弃去DPBS，加0.5mL 1×细胞核裂解液，同时添加终浓度为20μg/mL RNase，200μg/mL蛋白酶K，振荡重悬，再加70μL 10％的SDS，颠倒混匀，可见粘稠透明状液体；7℃90rpm的摇床上消化过夜；

④第二天加等体积Tris饱和酚，轻轻颠倒混匀至少100次，至形成乳浊液体，13,000g，室温离心10min；

⑤将上层液体转移至新的1.5mL EP管中，加入等体积的Tris饱和酚：氯仿(1:1)混合物，轻轻颠倒混匀至少100次，至形成乳浊状液体，13,000g，室温离心10min。同时预冷低温高速离心机至4℃；

⑥将上层液体转移至另一新的1.5mL EP管中，加至少2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，此时可见DNA沉淀析出；

⑦13,000g 4℃离心10min，弃上清，加500μL-20℃预冷的70％酒精将沉淀重悬；

⑧13,000g 4℃离心5min，弃上清，置于超净工作台风干烘干；

⑨加适量的ddH2O溶解3h以上，测量浓度，-20℃保存。

(4)PCR检测阳性克隆

设计两段引物进行PCR扩增鉴定：Screen-F1/R1和Screen-F2/R2，它们分别跨上游同源臂区和跨下游同源臂区。以苯酚/氯仿法抽提的G418抗性克隆的gDNA为模板，Screen-F1/R1和Screen-F2/R2为引物，使用TaKaRa公司的LA

PCR体系为：

PCR循环条件：

(5)iPSCs细胞核型检测

①细胞核型检测前更换新鲜mTeSR培养基，加入适量秋水仙素使其终浓度为0.6μg/mL处理细胞3h；

②吸弃培养基，用1×DPBS洗涤细胞2次；

③加入适量0.25％trypsin-EDTA于37℃消化细胞3min，待细胞变圆并逐渐脱落时，加入3倍体积ES培养基终止消化，吹下脱落细胞并将悬液收集至15ml离心管中，于室温1500rpm离心10min；

④吸弃上清，加入37℃预温的0.075M KCl 7mL，用吸管猛烈吹打100次后，置于37℃恒温水浴箱中低渗20min；

⑤加入1.5mL由甲醇和乙酸按3∶1比例混合的现配固定剂轻柔混匀悬液，于37℃水浴预固定5min，室温1500rpm离心10min；

⑥吸弃上清，加入8mL固定剂轻柔混匀悬液，于37℃水浴固定5min后室温1500rpm离心10min。随后，再重复固定1次；

⑦加入适量固定剂重悬后，用-20℃预冷的玻片进行滴片。每片2滴，共滴6张。随后，置于烤箱中75℃烤片3h；

⑧G显带：在立式染缸中加入30mL 0.85％生理盐水和30mL由0.02％ EDTA溶液与0.5mL2.5％trypsin配制的trypsin-EDTA溶液。将配好的trypsin-EDTA溶液pH调至7.0-7.2，于37℃预温5min。将烤好的染色体标本片，放入trypsin-EDTA溶液中轻柔摇动消化20-120s后，立即于生理盐水中终止消化并漂洗2次。再用Giemsa染色3-5min，以自来水冲洗并晾干；

⑨于显微镜下进行30个染色体分裂相数目分析和5个分裂相结构分析。

(6)iPSCs标志基因RNA qPCR鉴定，设计引物Oct4-rtF/R、Sox2-rtF/R、Nanog-rtF/R、hTERT-rtF/R、HPRT-rtF/R检测打靶后的AT-iPSCs与hiPSCs干性标志基因RNA表达水平是否有差异。

(7)Western Blot检测iPSCs外源基因的蛋白表达

①待细胞汇合度达70％以上，吸弃培养基，EDTA润洗一次；

②EDTA消化收集细胞至1.5mL EP管内，使用带有蛋白酶抑制剂的2×SDS裂解细胞，提取细胞蛋白；

③12000g离心10min，将离心后的上清转移到新的EP管中，然后利用Thermo公司的Pierce

④细胞定量至1ug/uL，加5×loading 100℃煮蛋白，用于后续Western Blot实验检测ARRDC1-TRAIL表达情况。

(8)hiPSCs-Exo与H1299共孵育后肿瘤细胞蛋白的提取与鉴定

①待肿瘤细胞汇合度达70％以上，用0.05％胰酶消化，收集贴壁细胞，在12孔板中加入5×104个肿瘤细胞。将12孔板置于37℃，5％CO2培养24h；

②分别加入hiPSCs-Exo和AT-hiPSCs-Exo，并设置空白组；

③将培养板在37℃，5％CO2孵育48h；

④收细胞前使用显微镜拍照，记录共孵育后的细胞形态；

⑤弃上清，DPBS洗一遍，用TrypLE Select消化细胞，终止消化后收集细胞至1.5mLEP管中，500g离心5min，弃上清，DPBS洗一遍后弃上清；

⑥向EP管中的肿瘤细胞加入100μL的2×SDS裂解液(含1μL蛋白酶抑制剂)，提取肿瘤细胞蛋白；

⑦BCA蛋白定量至浓度为1ug/uL，加5×loading 100℃煮蛋白，用于后续WesternBlot检测。

结论：

如图7所示，利用非病毒rDNA区打靶载体minipHrn-ARRDC1-TRAIL对iPSCs进行单细胞核转)。在核转实验中，每次核转1×106个iPSC,minipHrn-ARRDC1-TRAIL的质粒用量为5μg。在对核转细胞进行培养和G418筛选后，没有NEO基因整合表达的细胞逐渐脱落，随后将筛选后的细胞单细胞化接种1000个至6cm dish中，待细胞克隆团长至适当大小，挑取出G418抗性克隆，置于Matrigel包被的48孔板培养皿中用mTeSR1培养基进行培养。

在单细胞核转实验中，我们挑取了48个G418阳性克隆。随后，我们分别扩增培养了这48个细胞克隆，并通过苯酚/氯仿萃取法抽提该细胞的基因组DNA(gDNA)。为了鉴定外源基因的是否定点整合入iPSCs的rDNA区，我们针对阳性克隆的gDNA定点整合区域，分别设计了从rDNA区4533位点之前到IRES片段内的跨上游同源臂区PCR引物Screen-F1/R1和从ARRDC1-TRAIL表达框SV40 polyA片段到rDNA区6064位点之后的跨下游同源臂区PCR引物Screen-F2/R2。若该细胞克隆发生定点整合，经过PCR扩增后跨上游同源臂区和跨下游同源臂区产物片段大小分别1651bp和1477bp(如图8所示)。然后，收集两对引物都能扩出正确长度片段的克隆的PCR产物送测序公司测序，筛选出没有碱基突变的细胞克隆，用于后续外源基因表达量分析。在这次打靶实验中，我们通过PCR扩增鉴定出9个阳性克隆，并且在产物测序后鉴定出这9个阳性克隆均没有碱基突变且插入至rDNA目标区域。

获得rDNA区ARRDC1-TRAIL整合iPSCs克隆后，为了检测打靶前后细胞在染色体水平的变化情况，我们通过基因核型分析来鉴定阳性iPSCs克隆G显带的染色体核型。结果显示经过打靶之后，AT-iPSCs细胞核型仍然与hiPSCs一致，为46，XY(如图9所示)。由此表明，核糖体基因区的打靶并未引起细胞染色体的重排。

为了评估多能性因子在iPSCs中的表达，本研究提取AT-iPSCs和hiPSCs细胞RNA，逆转录后，通过qPCR检测了5个基因：GAPDH、hTERT、Nanog、Oct-4和Sox-2，其中以GAPDH作为内参，hTERT作为对照，Nanog、Oct-4和Sox-2作为多能性标记。研究结果显示，AT-iPSCs的干性基因表达水平与hiPSCs没有差异(如图10所示)，说明基因编辑后的iPSCs细胞任具有干性。

为了检测外源ARRDC1-TRAIL基因能否在AT-iPSCs中正常表达，我们采用qPCR分析外源ARRDC1-TRAIL基因的mRNA水平。手工抽提9个AT-iPSCs克隆和正常iPSCs细胞的RNA，利用试剂盒去除残留的gDNA，逆转录后进行分析。通过设计引物qTR-F/R检测ARRDC1-TRAIL基因的转录水平。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为扩增的内参基因。结果显示，AT-iPSCs中ARRDC1-TRAIL的转录水平显著高于对照iPSCs中TRAIL的转录水平(如图11所示)。

为了检测阳性AT-iPSCs克隆外源ARRDC1-TRAIL蛋白的相对表达水平，我们通过Western Blot检测AT-iPSCs和对照iPSCs的细胞裂解液，分析它们ARRDC1-TRAIL蛋白的相对表达情况。分析结果显示，定点整合iPSCs中ARRDC1-TRAIL蛋白表示为一条大小约为85kDa的条带，且其部分克隆TRAIL蛋白表达水平高于对照iPSCs(如图12所示)。这说明外源ARRDC1-TRAIL基因在定点整合iPSCs中能高效表达。

分别加入AT-iPSCs-Exo和hiPSCs-Exo与H1299共培养，并设置未处理H1299作为空白组，48h后显微镜下观察到与AT-iPSCs-Exo共培养的H1299细胞出现明显的细胞凋亡细胞形态和抑制增殖现象(如图13所示)。提取3组细胞蛋白，利用Western blotting检测ARRDC1-TRAIL蛋白的表达情况。蛋白印迹实验结果显示AT-iPSCs-Exo共培养的H1299细胞被检测出表达ARRDC1-TRAIL(如图14所示)。

3、AT-iPSCs细胞定向分化成AT-iMSCs细胞，制备外泌体，并验证相关结论

诱导分化试剂盒为STEM CELL公司的STE Mdiff

从之前获得的ARRDC1-TRAIL定点整合iPSCs克隆中选出ARRDC1-TRAIL融合蛋白和TRAIL蛋白表达均上调的一株AT5-5-iPSCs克隆用于后续的MSCs诱导分化，并将正常B6-iPSCs作为对照组，按照试剂盒说明书进行诱导分化，先使用试剂盒中的STE Mdiff

为了鉴定诱导分化而来的iMSCs细胞特性是否与组织来源的MSCs一致。我们对正常B6-hiPSCs、AT5-5-iPSCs诱导分化而来B6-iMSCs和AT5-5-iMSCs进行细胞表面标记物的鉴定，以hiPSCs为阴性对照，流式细胞术分析结果显示，B6-iMSCs和AT5-5-iMSCs表面标志物表达均为CD34、CD45、HLR-DR阴性，以及CD44、CD73、CD90、CD105阳性，这与组织来源MSCs的特征一致(如图16A和16B所示)。

为了鉴定iPSCs分化而来的iMSCs是否和其他组织来源MSC具有一样的分化潜能，我们将AT5-5-iMSCs和B6-iMSCs向成骨、成脂肪和成软骨细胞进行分化。经过14～21天的分化后，对其进行染色鉴定，结果显示：使用成骨分化试剂盒分化14天的iMSCs在茜素红染色后，呈现红色钙沉积；使用成脂肪分化试剂盒分化21天的iMSCs在油红O染色后，呈现深紫色脂滴颗粒物；使用成软骨分化试剂盒分化21天的iMSCs在阿利辛蓝染色后，由于细胞外基质中的蛋白聚糖与染料反应，呈现蓝色细胞球体状。以上结果说明iPSCs诱导分化而来的iMSCs具有成功分化为成骨、成脂和软骨细胞的多潜能性(如图17所示)。

为了检测iPSCs来源的iMSCs的外源ARRDC1-TRAIL融合基因能否正常表达。我们通过qPCR和Western Blot检测技术分别检测了MSCs细胞内ARRDC1-TRAIL基因的mRNA转录水平和ARRDC1-TRAIL蛋白表达翻译情况。RT-qPCR统计结果显示，AT5-5-iMSCs中外源基因的mRNA转录水平显著高于对照iMSCs(如图18所示)。Western Blot结果显示，AT5-5-iMSCs细胞裂解液中，TRAIL蛋白水平显著高于对照iMSCs，而ARRDC1-TRAIL融合蛋白没有检测出来，具体原因有待进一步探究。

为了获得iMSCs来源Exo，我们收集了iMSCs的条件培养基，通过连续离心并过0.22um滤膜的方法去除大于220nm的杂质，后通过超滤进行浓缩，最后使用沉淀法提取得到iMSC来源Exo。为了鉴定我们最终获得的产物是Exo，我们通过Western Blot分析鉴定Exo的表面标志蛋白CD63、TSG101、CD9；纳米颗粒跟踪分析(NTA)Exo的直径大小和浓度、电镜鉴定Exo的形态特征。结果显示，提取得到的Exo在透射电镜下，显示为直径约为100nm的杯托状小泡(如图19所示)，其形态与已有文献报道相似。NTA粒径分析结果显示Exo的粒径主要集中在50～150nm之间，尺寸分布均匀，Exo浓度为3.2×1010Particles/mL。最后通过Westernblot技术在Exo蛋白裂解物中检测出了外泌体标志蛋白CD9、CD63和TSG101。以上结果说明，本研究方法提取得到的产物是iMSCs来源外泌体。

为了检测AT-iMSCs-Exo中是否携带了外源ARRDC1-TRAIL融合基因的表达产物。我们通过Western Blot检测技术分别检测AT-iMSCs-Exo和iMSCs-Exo裂解物中的ARRDC1-TRAIL蛋白携带情况。结果显示，AT5-5-iMSCs-Exo裂解液中，TRAIL蛋白以二聚体形式存在，表现为两条70kDa大小位置相近的条带，且其TRAIL蛋白水平显著高于对照iMSCs，而ARRDC1-TRAIL融合蛋白没有检测出来，结果与293T-Exo结果相似，具体原因有待进一步探究(如图20所示)。

将DiI标记的Exo与H1299细胞共孵育24h后，制片并用激光共聚焦荧光显微镜观察，细胞免疫荧光结果显示，小部分Exo吸附在H1299细胞膜表面，大部分Exo被H1299细胞摄取，聚集于细胞质中，呈点状分布(如图21所示)。

为了研究AT-iMSCs-Exo对MCF-7肿瘤细胞增殖是否会产生影响。我们将6.4×108Particles/mL的AT-iMSCs-Exo和iMSCs-Exo加入到MCF-7细胞培养液中共培养48h，利用CCK-8法检测不同Exo对MCF-7细胞增殖生长活性的影响。实验结果表明，相对于对照iMSCs-Exo，AT-iMSCs-Exo具有一个更加显著的肿瘤细胞抑制效率，约为41.3％(如图22所示)。

为了探究AT-iMSCs-Exo在体外是否诱导肿瘤细胞凋亡，我们将6.4×108Particles/mL的AT-iMSCs-Exo和iMSCs-Exo与H1299细胞共培养，48h后收集细胞利用AnnexinV-FITC/PI对H1299细胞进行凋亡流式检测。结果显示AT-iMSCs-Exo可以在体外促进H1299细胞凋亡，凋亡比率为10.73％。相比于空白组，iMSCs-Exo对B16F10细胞凋亡几乎没有影响(如图23所示)。

综上所述，AT-iPSCs可以正常的诱导分化为iMSCs，并保留MSC细胞特性。在探究iMSCs外源基因表达情况时，我们发现外源基因的表达情况由于细胞类型的变化，相应的发生了一定改变，AT5-5-iMSCs外源基因mRNA转录水平相较于iPSCs时期降低了4倍，从iPSCs的194倍降低至iMSCs的49倍；ARRDC1-TRAIL融合蛋白的翻译情况也发生了变化，在AT-iMSCs细胞中没有检测到融合蛋白相应大小条带，而TRAIL蛋白翻译水平相对于对照iMSCs细胞出现了1.8倍的表达差异。针对以上结果，我们猜测ARRRDC1-TRAIL融合基因在AT-iMSCs细胞中翻译过程出现了断裂，或者由于ARRDC1基因特性和MSCs细胞带有的强大旁分泌功能，使得融合蛋白被全部包裹至Exo中，并快速被分泌至细胞外。在探究AT-iMSCs-Exo的融合蛋白携带情况时，我们发现大部分融合蛋白以TRAIL二聚体形式存在，与293T-Exo蛋白装载形式相似。综上，我们猜测ARRDC1-TRAIL融合基因在翻译成融合蛋白后发挥了ARRDC1的外泌体生成功能，被直接传送表达至Exo膜上，并最终以Exo形式通过MSCs旁分泌功能被分泌至细胞培养上清中，后融合蛋白中的ARRDC1结构在Exo中发生泛素化，使得融合蛋白断裂，以TRAIL蛋白形式存在，由于Exo膜流动性使得TRAIL单体以寡聚体形式聚集于Exo膜上，最终Western blot检测以TRAIL二聚体大小条带形式存在，具体外源基因表达机制有待进一步探究。在探究AT-iMSCs-Exo的体外抗肿瘤作用时，我们通过摄取实验，发现AT-iMSCs-Exo可以被肿瘤细胞摄取，标记Exo的Dil染料主要分布在肿瘤细胞膜上和细胞质内。由此可知，AT-iMSCs-Exo主要以膜融合和细胞内吞作用方式进入肿瘤细胞内，具体摄取机制有待进一步探究。体外抗肿瘤实验结果表明，6.4×108Particles/mL浓度的AT-iMSCs-Exo对MCF-7细胞的增殖具有抑制作用，且对H1299细胞具有一定的诱导凋亡能力。在此基础上，我们可以通过提高AT-iMSCs-Exo的浓度来增强Exo对肿瘤的杀伤作用。这为进一步的体内抗肿瘤实验奠定了基础。

以上施例和验证例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。