一种基于凝胶微球的3D打印生物墨水及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于凝胶微球的3D打印生物墨水及其应用，属于组织工程和生物制造技术领域。

背景技术

生物3D打印技术通过将含细胞的生物墨水按照预定义路径，层层堆积形成具有复杂结构的3D组织与器官，在复杂组织和器官的构建方面具有巨大的优势。生物3D打印技术按照构筑单元的维度，通常可以分为三种：基于微滴(零维)的打印方法，基于微丝(一维)的微挤出打印方法，和基于面成形(二维)的光固化打印方法。其中，微挤出式生物3D打印技术具有成形制造复杂组织结构的潜力，成为目前主流的打印工艺。这种工艺将粘性生物墨水通过微型喷嘴时，在机械力或气压的驱动下受到挤压从而形成载细胞的微纤维。

微挤出式3D打印工艺要求生物墨水材料具备合适的粘度和流变性能，因而极大限制了可供打印的材料来源和浓度范围。一方面，生物墨水粘度范围要求在0.03～5×10

因此，针对微挤出式3D打印工艺中现有生物墨水的材料、粘度限制和力学性能较差等不足，提供一种新型生物墨水开发策略以拓展现有技术不足甚为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型基于凝胶微球的3D打印生物墨水，其具有剪切变稀和自愈合特性，能够提高3D打印结构的力学强度和稳定性，从而极大拓展生物墨水的材料来源和打印能力，克服了现有3D打印生物墨水面临材料粘度限制和力学性能较差等不足。

本发明提供的基于凝胶微球的3D打印生物墨水，由已交联的载细胞的凝胶微球形成，或由已交联的载细胞的凝胶微球与一种或多种未交联的凝胶材料混合得到；

当包括两种材料时，所述载细胞的凝胶微球作为分散相，所述凝胶材料作为连续相。

所述生物墨水经3D打印完成后，通过作为所述连续相的凝胶材料的二次交联，以提高打印结构的力学强度和稳定性；

可采用下述方式对所述凝胶材料进行二次交联：光照交联、温度交联、离子交联、酶交联和共价交联方式中至少一种。

其中，所述载细胞的凝胶微球可按照下述方法制备：

悬滴法培养、超低附着性培养板、磁力悬浮培养、动态旋转培养和微流控技术中至少一种。

上述的3D打印生物墨水中，所述凝胶微球内细胞密度可为10

所述载细胞的凝胶微球内凝胶材料的质量-体积浓度可为10～100mg/mL，如20～50mg/mL。

上述的3D打印生物墨水中，所述载细胞的凝胶微球的直径可为50μm～1000μm，如可为200μm～250μm、250μm～300μm或350μm～400μm；

所述载细胞的凝胶微球在所述3D打印生物墨水中的体积含量可为40％～100％，如60％～80％、60％、80％或100％，当为100％时即仅由所述载细胞的凝胶微球形成所述3D打印生物墨水；

上述的3D打印生物墨水中，作为所述连续相的所述凝胶材料的质量-体积浓度可为1～100mg/mL，如4～25mg/mL；

作为所述连续相的所述凝胶材料可载有细胞；

所述凝胶材料内细胞密度可为10

上述的3D打印生物墨水中，所述载细胞的凝胶微球采用的凝胶与所述凝胶材料均为天然高分子水凝胶和/或合成高分子水凝胶；

具体地，所述天然高分子水凝胶材料可为海藻酸钠、明胶、胶原、Matrigel、壳聚糖、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、硫酸软骨素、白蛋白以及它们的甲基丙烯酰化产物(如甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化海藻酸钠(AlgMA)等)中的至少一种；

所述合成高分子水凝胶材料可为聚乙二醇(PEG)、聚丙烯醇(PVA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚丙烯酸(PAA)、聚磷腈(PAMPS)、聚N-异丙基丙烯酰胺类水凝胶(PNIPAAm)以及它们的甲基丙烯酰化产物(如凹臂聚乙二醇丙烯酸酯(4-arm-PEG-AC)、甲基丙烯酰化聚乙烯醇(PVAMA)等)至少一种。

本发明3D打印生物墨水中，所述载细胞的凝胶微球内的细胞、所述凝胶材料内的细胞均为原代干细胞或多能干细胞来源的实质细胞、肿瘤细胞、基质细胞和内皮细胞中至少一种；

所述实质细胞对应的组织/器官包括心脏、肝脏、肾脏、胰腺和脑结构中至少一种。

本发明3D打印生物墨水(包括连续相时)能够多级悬浮3D打印具有复杂血管通道和/或异质细胞结构的组织/器官模型，可用于病损组织器官修复、药物开发与筛选和病理研究模型等；

所述组织/器官结构包括心脏、肝脏、肾脏、胰腺和脑结构中至少一种；

所述组织/器官结构的尺寸为500μm～100mm。

本发明提供的含载细胞凝胶微球或以含载细胞凝胶微球作为分散相和凝胶材料作为连续相的3D打印生物墨水，相比于现有的生物墨水，具有以下优点及突出性效果，体现如下：

(1)本发明新型基于凝胶微球的3D打印生物墨水，具有剪切变稀和自愈合特性，可以在不添加流变改性剂的条件下直接3D打印低浓度或低粘度凝胶材料，从而实现常规凝胶材料在超低浓度下的三维打印，并赋予难打印水凝胶材料优异的打印性，极大地扩充了生物墨水库；

(2)凝胶微球作为细胞载体，可以为细胞生长、增殖和分化等活动提供定制微环境，同时可以保护细胞免受3D打印工艺中剪切应力的损伤，有助3D打印组织器官的功能成熟，极大促进生物3D打印技术在复杂组织/器官构建方面的应用。

附图说明

图1为本发明基于凝胶微球的3D打印生物墨水的示意图，图中，1表示载细胞的凝胶微球，2表示凝胶微球周围的连续相凝胶材料，3表示作为连续相的凝胶材料内细胞。

图2为本发明实施例1制备的微球墨水打印的圆环结构和显微观察结果。

图3为本发明实施例1制备的基于凝胶微球的3D打印生物墨水的流变学性能表征，图中，图3a为粘度随剪切速率的变化曲线，图3b为剪切应力、储存模量和损耗模量随剪切应变的变化曲线，图3c为在交替高低应变下的储能模量变化曲线。

图4为本发明实施例2制备的微球墨水打印的支气管结构和显微观察结果。

图5为本发明实施例3制备的微球墨水打印的网格和双环结构和显微观察结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、制备载心肌细胞的GelMA凝胶微球生物墨水

从刚出生乳鼠心脏提取心肌细胞，采用可光交联的甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)作为微球载体材料，配置质量体积分数为5.0％的GelMA溶液，其中含有心肌细胞的密度为1×10

采用本实施例制备的GelMA凝胶微球墨水在室温下打印直径为10mm、高度为5mm的圆环结构(图2a)，打印速度为5mm/s，挤出速度为0.24mm

进一步，通过流变学测试，可以发现本实施例制备的GelMA凝胶微球墨水除了表现出剪切变稀(图3a，图3b)，还具有自愈合的特性(图3c)。其中，自愈合特性是常规GelMA凝胶生物墨水所不具备的。需要说明的是，已有研究通常能实现的GelMA打印最低浓度一般为75mg/mL，本发明提供的基于凝胶微球的3D打印生物墨水，能够实现浓度在50mg/mL及更低浓度，可以满足特殊细胞对超软基质环境的要求。

实施例2、制备载成肌细胞的纤维蛋白原/Matrigel/胶原凝胶微球墨水

采用商业购买的成肌细胞系C2C12细胞进行体外培养，配置质量分数为2.0％的纤维蛋白原溶液与体积分数为40％的Matrigel溶液，并混合C2C12细胞，最终细胞密度为5×10

在室温下将载C2C12细胞的纤维蛋白原/Matrigel凝胶微球通过离心(1000转每分钟，5分钟)去油，通过用50U/mL的凝血酶溶液对微球进行再次交联，然后在用PBS缓冲溶液进行清洗，按1：1的体积比混合I型鼠尾胶原和Matrigel溶液得到纤维蛋白原/Matrigel/胶原凝胶微球墨水，其中，凝胶微球墨水中凝胶微球的体积含量为80％，作为连续相的胶原的质量-体积浓度为4mg/mL。

将本实施例制备的凝胶微球墨水载入3D打印设备的喷头内，直接进行打印支气管结构，打印温度为22℃，打印速度为2mm/s，挤出速度为0.5mm

实施例3、制备载成肌细胞的纯GelMA凝胶微球墨水

采用商业购买的成肌细胞系C2C12细胞进行体外培养，采用可光交联的甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)作为微球载体材料，配置质量体积分数为7.5％的GelMA溶液，并混合C2C12细胞，最终细胞密度为7.5×10

将本实施例制备的凝胶微球墨水载入3D打印设备的喷头内直接进行打印网格结构(图5a)，打印温度为27℃，打印速度为4mm/s，挤出速度为2.5mm

进一步，打印径为15mm、高度为2mm的双环结构(图5c)，打印速度为2.5mm/s，挤出速度为0.20mm