一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于小分子检测领域，具体地，涉及一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，以及一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒。

背景技术

抗微生物药有助于动物生长，所以经常被添加在动物饲料中进而残留在食物中。随着养殖业的发展，抗微生物药滥用问题尤为凸显。例如，磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗微生物药都是常见的食品污染物，通常会同时残留在鸡蛋、牛奶、蜂蜜等食物中协同威胁人体健康。过量的抗微生物药通过食物在人体内蓄积，使人体肠道菌群失调，引起过敏和变态反应，导致细菌耐药性增加，甚至引起各种组织器官癌变。因此，同时检测多种抗微生物药对于环境和食品安全监控的意义重大。

目前，实现同时检测的主要挑战在于简化检测步骤的同时提高灵敏度。酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)是一种十分常见的免疫测定方法，能较好地实现多种目标物的同时检测。相较于大型仪器方法，如HPLC，GC，HPLC-MS联用等，ELISA法操作简单且不需要复杂的前处理过程，常用于食品分析、环境监测和临床诊断。传统的ELISA，借助酶与底物产生颜色反应进行定量测定。目前的ELISA试剂盒已经很成熟且商品化，但它们的灵敏度均有待提高，因此不适用于分析低浓度靶标。很多研究者对ELISA进行改进以提高灵敏度，比如亲和素-生物素复合ELISA(Avidinbiotincomplex-ELISA，ABC-ELISA)和结合等温扩增进行信号放大的ELISA。还有将ELISA与各种荧光分子或纳米材料结合，以荧光作为信号输出，提高检测灵敏度。常见的有量子点、金纳米颗粒、荧光染料等，但这些荧光ELISA仍存在易受光漂白影响、量子产率低、背景值高、荧光寿命不足等局限性。为了解决上述问题，上转换纳米颗粒被考虑作为一个良好的荧光信号输出元件。

发明内容

针对现有技术的上述缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、稳定性强、操作步骤简便的检测试剂盒和方法，以实现食品中磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)三种抗微生物药的同时检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，包括以下步骤：

S1.上转换纳米颗粒修饰生物素：将UCNPs-COOH与EDC和NHS混合反应，以实现对羧基的活化，然后，向活化后的UCNPs-COOH分散液中加入Biotin-PEG-NH

S2.ABC-UCNPs复合物的制备：将UCNPs-bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC-UCNPs复合物；

S3.包被：将多种小分子的完全抗原包被于黑色96孔板中，并进行封闭处理；

S4.单抗和小分子竞争：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)处理后的黑色96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后进行洗涤；

S5.添加ABC-UCNPs复合物，并避光孵育，孵育后进行洗涤；

S6.读数：采用酶标仪读取荧光值。

本发明检测过程原理图如图1所示。

本发明检测原理是基于亲和素-生物素-上转换复合物的双重放大，实现对多种小分子，如SM2、SAR和TC三种抗微生物药的同时检测。首先，将UCNPs-bio与SA一起孵育，通过Bio与SA之间高亲合力的牢固结合形成ABC-UCNPs作为信号输出。如图1所示，在96孔黑色酶联板上分别包被三种目标物的完全抗原，然后让待测目标物和包被的Aa竞争结合Bio-Ab。洗板后与抗原结合的生物素化抗体留在了酶联板上，再加入图1中合成好的ABC-UCNPs复合物进行孵育，抗体上的生物素和ABC-UCNPs复合物的链霉亲和素结合形成ABC放大，而未结合的ABC-UCNPs复合物则通过洗板除去，最后在808nm激发下发出545nm的绿光。目标物浓度越低，与抗原结合留在酶联板上的抗体越多，导致能结合的ABC-UCNPs复合物越多，荧光越强。因此UCNPs荧光信号的强度会随着加入的目标抗微生物药浓度的升高而降低，根据这个规律可以定量检测目标物。借助ELISA平台将UCNPs的荧光优势搭配ABC放大系统可以实现对目标物的多靶标高灵敏检测。

根据本发明，优选地，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S6的方法，检测一系列已知浓度的多种小分子的标准溶液，测得多组荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到多种小分子的标准曲线。

根据本发明，优选地，步骤S6还包括：基于标准曲线，计算待检测样品中多种小分子的含量。

本发明中，“多种小分子”指三种以上的小分子，本发明的方法原则上可以检测任何能满足上述检测要求的小分子，根据本发明一种优选实施方式，所述多种小分子为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)。

根据本发明，优选地，步骤S1包括：取0.8-1.2mg/mL UCNPs-COOH与8-12mg/mL的EDC和8-12mg/mL的NHS混合，在37℃的条件下振荡反应0.5-1.5h以实现对羧基的活化，待反应结束后用缓冲液离心洗涤三次；然后，在活化后的1-3mg/mL的UCNPs-COOH的分散液中加入4-6mg/mL的Biotin-PEG-NH

根据本发明，优选地，步骤S2包括：首先取1-3mg/mL的UCNPs-bio分散在含0.04％-0.06％Tween-20的PBS缓冲液中超声分散1-5min，再加入1-3mg/mL的链霉亲和素，其中UCNPs-bio与链霉亲和素的体积比为2：2-5；将上述溶液在37℃条件下避光振荡孵育20-40min；得到反应产物ABC-UCNPs复合物，存放于4℃备用。

根据本发明，优选地，步骤S3包括：用包被缓冲液将多种小分子的完全抗原按1:3000稀释，按照80-120μL/孔加入黑色96孔板中，置于4℃包被8-16h；将包被的96孔板取出，弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次；按照100-150μL/孔加入封闭液并置于37℃孵育0.8-1.2h进行封闭。

根据本发明，优选地，步骤S4包括：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)的黑色96孔板中并在37℃培养箱中孵育1-3h，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次。

根据本发明，优选地，步骤S5包括：每孔加入80-120μL ABC-UCNPs复合物，在37℃避光孵育20-40min；孵育后弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次。

根据本发明，优选地，步骤S6中，设置酶标仪的激发波长为808nm，发射波长为545nm。

上述各步骤中所用到的溶液均可通过本领域常规方法制得，例如，a.包被缓冲液：准确称取1.59g的Na

本发明的第二方面提供一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒，包括以下组分：

(1)生物素修饰的上转换纳米颗粒；

(2)链霉亲和素；

(3)生物素化的多种小分子的单抗；

(4)多种小分子的完全抗原；

其中，组分(1)和(2)可共同以复合物的形式提供。

所述多种小分子优选为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)。

本发明的方法和试剂盒可检测的实际样品包括但不限于猪肉、蜂蜜和鸡蛋。

本发明利用双重信号放大的多靶标高灵敏传感技术，实现了对三种目标物的同时检测。首次对经典的ABC系统进行改进，用UCNPs代替普通的HRP，进一步提高ABC的放大能力。利用成熟的ABC实验技术(链霉亲和素和生物素结合)合成UCNPs复合探针，并以同样的方式桥接抗体和复合探针，用于高灵敏测定。在简化操作步骤的同时实现了高灵敏的检测。SMZ、SAR和TC三种目标物的检测范围分别为0.2-40ng/mL，0.04-20ng/mL，0.08-80ng/mL。结合96孔板实现在一次运行中从一个样品中多重和同时检测SMZ、SAR和TC，并具有良好的重现性。在提高灵敏度的同时简化操作步骤是趋势，更有利于将检测方法应用到实际检测中。随着荧光酶标仪的便携化，这套方法完全可以实现现场的即时检测。ABC-ULISA技术也适用于其他类型的目标物检测，为需要多靶标高灵敏的定量分析提供了一种新的思路，对于各种危害物质的检测拥有巨大潜力。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明检测方法原理图。

图2为本发明实施例中上转换纳米颗粒和上转换纳米颗粒-亲和素-生物素复合物的透射电镜图和粒径统计分析图。

图3为本发明实施例中检测三种目标物的检测标准曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

以下实施例中，所有的抗体、抗原和目标物购买自北京维德维康公司；氨基化生物素购买自上海魅罗科技公司；链霉亲和素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基、碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购买自美国Sigma-Aldrich公司；羧基化上转换纳米颗粒购买自西安瑞禧生物科技公司。

本实施例用于说明本发明的三种抗微生物药同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒及检测方法。具体实施步骤如下：

1)上转换纳米颗粒修饰生物素：取2mL的UCNPs-COOH(1mg/mL)与50μL的EDC(10mg/mL)和25μL的NHS(10mg/mL)混合，在37℃的条件下振荡反应1h以实现对羧基的活化，待反应结束后用缓冲液离心洗涤三次。然后，在上述活化后的UCNPs-COOH(2mg/mL，500μL)的分散液中加入500μL的Biotin-PEG-NH

2)ABC-UCNPs复合物的制备：ABC-UCNPs复合物主要通过Bio和SA之间的作用连接形成。首先取2mg/mL的UCNPs-bio分散在含0.05％Tween-20的PBS中超声分散3min，再分别按2:5，1:2，2:3，1:1和2:1的体积比加入2mg/mL的链霉亲和素。将上述溶液在37℃条件下避光振荡孵育30min。最后将反应产物(ABC-UCNPs复合物)存放于4℃备用。ABC-UCNPs复合物的透射电镜图和粒径统计分析图如图2中的b和d所示。

3)配制主要溶液：a.包被缓冲液：准确称取1.59g的Na

4)包被：提前找到目标物小分子的完全抗原即包被时使用的包被原，包被前5分钟取出，室温自然融化。然后用包被缓冲液将抗原按1:3000稀释。取出干净的黑色96孔板，按照100μL/孔加入稀释好的包被原，置于4℃包被12h。

5)洗涤：将包被12h的96孔板取出，一次性大力将孔内液体甩掉，注意甩的方向与地面垂直，防止液体窜孔。准备好吸水纸，将板子快速用力拍打在吸水纸上，注意垫厚一些，防止液体窜孔，拍打数次，直至孔内液体拍净。按200μL/孔加入PBST，洗涤3次，每次3min(洗涤时拍板同上所述)。

6)封闭：按照120μL/孔加入封闭液并置于37℃孵育1h进行封闭，封闭液现用现配。

7)洗涤：步骤同5)。

8)单抗和小分子竞争：将生物素化的单抗从-20℃冰箱取出，室温融化后按比例稀释，即Bio-Ab of SMZ、Bio-Ab of SAR和Bio-Ab of TC分别按1:32000、1:256000和1:128000的比例稀释。每孔加入相应体积的稀释后的生物素化单抗(阴性和空白对应的孔不加)和50μL各种浓度的小分子目标物在37℃培养箱中孵育2h，使小分子和包被的Aa竞争结合Bio-Ab。

9)洗涤：步骤同5)。

10)添加ABC-UCNPs复合物：每孔加入100μL之前配制好的ABC-UCNPs复合物，在37℃避光孵育30min。

11)洗涤：步骤同5)。

12)读数：将酶标板放在仪器检测框内，设置激发波长为808nm，发射波长为545nm，按软件的START键，振荡混匀，得到酶标仪测得的荧光值。根据上述方法测定已知浓度的磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)三种抗微生物药的标准溶液，并制作标准曲线，如图3所示。

本实施例用于说明猪肉中三种抗微生物药同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，具体包括以下步骤：

1)猪肉样品前处理：取切碎的猪肉于均质机以10000r/min均质1min；将均质后的猪肉(1.0g)和乙腈(4mL)一起混合振荡5min；离心取1.25mL上清并用N

2)包被：提前找到目标物小分子的完全抗原即包被时使用的包被原，包被前5分钟取出，室温自然融化。然后用包被缓冲液将抗原按1:3000稀释。取出干净的黑色96孔板，按照100μL/孔加入稀释好的包被原，置于4℃包被12h。

3)洗涤：将包被12h的96孔板取出，一次性大力将孔内液体甩掉，注意甩的方向与地面垂直，防止液体窜孔。准备好吸水纸，将板子快速用力拍打在吸水纸上，注意垫厚一些，防止液体窜孔，拍打数次，直至孔内液体拍净。按200μL/孔加入PBST，洗涤3次，每次3min(洗涤时拍板同上所述)。

4)封闭：按照120μL/孔加入封闭液并置于37℃孵育1h进行封闭，封闭液现用现配。

5)洗涤：步骤同3)。

6)单抗和小分子竞争：将生物素化的单抗从-20℃冰箱取出，室温融化后按比例稀释，即Bio-Ab of SMZ、Bio-Ab of SAR和Bio-Ab of TC分别按1:32000、1:256000和1:128000的比例稀释。每孔加入相应体积的稀释后的生物素化单抗(阴性和空白对应的孔不加)和50μL各种浓度的小分子目标物在37℃培养箱中孵育2h，使小分子和包被的Aa竞争结合Bio-Ab。

7)洗涤：步骤同3)。

8)添加ABC-UCNPs复合物：每孔加入100μL之前配制好的ABC-UCNPs复合物，在37℃避光孵育30min。

9)洗涤：步骤同3)。

10)读数：将酶标板放在仪器检测框内，设置激发波长为808nm，发射波长为545nm，按软件的START键，振荡混匀，得到酶标仪测得的荧光值。

11)将步骤10)读取的数值代入实施例1制作的标准曲线，计算猪肉样品中三种抗微生物药的含量。

表1

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。