一种裸体方格星虫多糖的制备方法和应用

【技术领域】

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种裸体方格星虫多糖的制备方法和应用。

【背景技术】

裸体方格星虫(Sipunculus nudus L.)，也称方格星虫，俗称沙虫，素有“海洋冬虫夏草”之称，不仅味道鲜美，营养价值丰富，也是重要的药食同源海产品。其药用价值被我国多种本草记载：《中国药用动物志》记载其健脾，主治夜尿症；《海洋药物与效方》记载其清肺热，祛痰咳；《南海海洋药用生物》记载其清肺，治牙肿痛，可代替中药冬虫夏草用；《中国药用海洋生物》记录其滋阴降火，用于骨蒸潮热，阴虚盗汗，肺痨咳嗽，胸闷痰多等症；《北海民间常用中草药手册》记载其可治年久不愈的。《中华海洋本草》收录其多种生物活性，称其味咸，性寒。归肺、肾经，具有清肺止咳健脾，滋阴降火，镇痛。主治阴虚盗汗，骨蒸潮热，肺痨咳嗽，胸闷痰多，慢性痢疾，夜尿症等。

目前市场上方格星虫产品主要是其干制品，需要进一步加工和烹调才能食用，不仅需要一定的烹饪技巧，而且需要花费大量的时间，极为不方便。方格星虫蛋白纤维较为丰富，因此有咀嚼障碍的人群不能有效吸收其营养。不能因此开发一种方便、口感好并保留其营养价值并具有药用功效的即食食品极具市场需求。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种裸体方格星虫多糖的制备方法和应用，本发明发掘了方格星虫多糖的新用途，并将其制作成方便携带和食用的泡腾片，提高方格星虫的附加值，且其工艺简单，适合大规模生产。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种裸体方格星虫多糖的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)取新鲜的裸体方格星虫，去除泥沙及内脏并清洗，接着进行匀浆得到匀浆液；

(2)在步骤(1)所得匀浆液中加入95-105℃的去离子水，提取4.5-5.5h，过滤去除不溶性成分，接着将滤液真空浓缩至原体积的1/4，再向滤液中加入占滤液4倍体积的无水乙醇，静置过夜，然后在温度为4-6℃，转速为6500-7500rpm的条件下，离心4-6min，倾出上清液并收集沉淀；

(3)将步骤(3)所得沉淀用无水乙醇洗涤2-3次，再离心，收集洗涤后的沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解，再加入萃取剂氯仿－正丁醇萃取出游离蛋白质；

(4)将步骤(3)所得粗糖提取液过DEAE-Sepharose离子交换柱(2.0×40cm)，用流速0.5mL/min ddH

目前多糖的纯度为40％-60％，但是本发明中方格星虫多糖的多糖纯度超过92％，该方格星虫多糖具有降血糖的作用；可作降血糖药物食用，且最佳剂量为100mg/kg体重。

本发明中，进一步地，所述步骤(1)中所选取的方格星虫单体体重为10-15g。

本发明中，进一步地，所述步骤(2)中的匀浆液与去离子水的体积比为1:2-3。

本发明还提供裸体方格星虫多糖的应用，所述方格星虫多糖作为原料制备速溶泡腾片，该速溶泡腾片由以下重量份的原料组成：方格星虫多糖8-10、方格星虫提取物20-25份、姜黄粉0.5-2份、碳酸氢钠20-25份、柠檬酸18-23份、麦芽糊精8-10份、润滑剂1-2份和粘合剂3-4份。

本发明中，进一步地，所述速溶泡腾片的制备方法如下：

1)制备方格星虫提取物：将去除内脏并清洗后的裸体方格星虫体壁在55-60℃真空干燥箱中放置3-5h，然后取出，将样品粉碎过50-70目筛，过筛后的方格星虫粉末加入10倍体积蒸馏水在沸水浴中热回流提取2-4次，每次85-95min，抽滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥后粉碎，过110-130目筛，得到方格星虫提取物备用；

2)制备姜黄粉：取新鲜姜黄，清洗后榨汁，旋转蒸发浓缩至原有体积1/5，将浓缩液冷冻干燥后粉碎，过115-125目筛，得姜黄粉备用；

3)制备泡腾片：将柠檬酸、碳酸氢钠分别在55-65℃的条件烘干2-2.5h，取方格星虫多糖、方格星虫提取物、姜黄粉和碳酸氢钠干混，再加粘合剂进行湿混，制的碱性颗粒；接着取柠檬酸和填充剂麦芽糊精干混，加入粘合剂湿混，制得酸性颗粒；将碱性颗粒和酸性颗粒分别在40-50℃下烘干至含水量小于3％，接着将碱性颗粒和酸性颗粒混合，并在混合颗粒中加入润滑剂，再进行混匀、压片，即得所述泡腾片。

本发明中，进一步地，所述粘合剂是由体积分数为3％的PVP和体积分数为75％的乙醇溶液按照质量比为1:2-3的比例混合所得。

上述，所制得的泡腾片为速溶泡腾片，该泡腾片总重2.5g，食用方式为：以冲调比1：100(片剂：饮用水)饮用。

泡腾片感官指标：成品色泽为乳黄色，组织形态为圆形,表面光滑,外形整齐；无腥味及苦涩味，香气和滋味为稍有沙虫的香气，酸甜适口、口感柔和、硬度适中；

泡腾片片剂之间质量差异：随机取样品20片，称取总质量，计算出平均质量，单片质量差异限度≤5％；

泡腾片理化指标：含水分≤2.0％；pH值5.2～6.2；崩解时限：随机取样品6片，分别加入200mL的常温蒸馏水，迅速产生大量气泡，气泡消失完全后，泡腾片溶散彻底无残留。崩解时间≤200s；吸湿性≤1.5％；硬度：用片剂硬度仪检测泡腾片硬度，硬度52-60N。

本发明至少具有如下有益效果：

1、本发明所制备得到的方格星虫多糖，通过体外酶抑制活性和动物实验分析结果显示该方格星虫多糖具有明显的降血糖功效，对动物实验结果显示，方格星虫多糖降血糖效果最佳剂量为100mg/kg体重，其降血糖效果明显优于阳性对照药物二甲双胍。此外，该方法制得的多糖纯度超过92％，纯度远高于常规方法制备所获取的多糖。

2、本发明利用方格星虫、姜黄为原料，并添加粘合剂等原料，制成新型的保健泡腾片，不仅携带及食用方便，而且具有口感好、生理功效和营养价值高的特点。泡腾片具有体积小、便于携带、速溶性好、饮用方便、易于吸收等优点，将方格星虫多糖和方格星虫粉添加至泡腾片中，不仅保留了方格星虫的营养价值，而且提高了营养成分的生物利用率，不但具有较好的市场发展前景，而且丰富了泡腾片的种类。

【附图说明】

图1为方格星虫多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的影响柱形图；

图2为方格星虫多糖对糖尿病小鼠空腹血糖的影响折线图；

图3为方格星虫多糖对糖尿病小鼠血清甘油三酯的影响折线图；

图4为方格星虫多糖对糖尿病小鼠血清总胆固醇的影响折线图；

图5为方格星虫多糖对糖尿病小鼠血清胰岛素的影响折线图；

图6为方格星虫多糖对糖尿病小鼠血清胰高血糖素的影响柱形图；

图7为方格星虫多糖对糖尿病小鼠血清肾上腺素的影响柱形图；

图8为方格星虫多糖对糖尿病小鼠肝糖元含量的影响柱形图；

图9为方格星虫多糖对糖尿病小鼠肌糖元含量的影响柱形图；

图10为方格星虫多糖对糖尿病小鼠体重的影响柱形图；

图11为方格星虫多糖对糖尿病小鼠器官体比指数的影响柱形图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

本实施例提供一种裸体方格星虫多糖的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)取新鲜的裸体方格星虫，选取的方格星虫单体体重为15g，去除泥沙及内脏并清洗，接着进行匀浆得到匀浆液；

(2)在步骤(1)所得匀浆液中加入105℃的去离子水，匀浆液与去离子水的体积比为1:3，提取5.5h，过滤去除不溶性成分，接着将滤液真空浓缩至原体积的1/4，再向滤液中加入占滤液4倍体积的无水乙醇，静置过夜，然后在温度为6℃，转速为7500rpm的条件下，离心6min，倾出上清液并收集沉淀；

(3)将步骤(2)所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，再离心，收集洗涤后的沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解，再加入萃取剂氯仿－正丁醇萃取除去游离蛋白质，得到粗糖提取液备用；

(4)将步骤(3)所得粗糖提取液过DEAE-Sepharose离子交换柱(2.0×40cm)，用流速0.5mL/min ddH

实施例2

本实施例提供一种裸体方格星虫多糖的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)取新鲜的裸体方格星虫，选取的方格星虫单体体重为12g，去除泥沙及内脏并清洗，接着进行匀浆得到匀浆液；

(2)在步骤(1)所得匀浆液中加入100℃的去离子水，匀浆液与去离子水的体积比为1:2，提取5.0h，过滤去除不溶性成分，接着将滤液真空浓缩至原体积的1/4，再向滤液中加入占滤液4倍体积的无水乙醇，静置过夜，然后在温度为5℃，转速为7000rpm的条件下，离心5min，倾出上清液并收集沉淀；

(3)将步骤(2)所得沉淀用无水乙醇洗涤2-3次，再离心，收集洗涤后的沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解，再加入萃取剂氯仿－正丁醇萃取除去游离蛋白质，得到粗糖提取液备用；

(4)将步骤(3)所得粗糖提取液过DEAE-Sepharose离子交换柱(2.0×40cm)，用流速0.5mL/min ddH

实施例3

本实施例提供一种裸体方格星虫多糖的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)取新鲜的裸体方格星虫，选取的方格星虫单体体重为10-15g，去除泥沙及内脏并清洗，接着进行匀浆得到匀浆液；

(2)在步骤(1)所得匀浆液中加入95℃的去离子水，匀浆液与去离子水的体积比为1:2，提取4.5h，过滤去除不溶性成分，接着将滤液真空浓缩至原体积的1/4，再向滤液中加入占滤液4倍体积的无水乙醇，静置过夜，然后在温度为4-6℃，转速为6500rpm的条件下，离心4min，倾出上清液并收集沉淀；

(3)将步骤(2)所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，再离心，收集洗涤后的沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解，再加入萃取剂氯仿－正丁醇萃取除去游离蛋白质，得到粗糖提取液备用；

(4)将步骤(3)所得粗糖提取液过DEAE-Sepharose离子交换柱(2.0×40cm)，用流速0.5mL/min ddH

实施例4

本实施例提供一种速溶泡腾片，该速溶泡腾片由以下重量份的原料组成：方格星虫多糖8份、方格星虫提取物20份、姜黄粉0.5份、碳酸氢钠20份、柠檬酸18份、麦芽糊精8份、润滑剂1份和粘合剂3份；其中方格星虫多糖为实施例2中所制得的方格星虫多糖；

上述速溶泡腾片的制备方法，包括如下步骤：

1)制备方格星虫提取物：将去除内脏并清洗后的裸体方格星虫体壁在55℃真空干燥箱中放置3h，然后取出，将样品粉碎过50目筛，过筛后的方格星虫粉末加入10倍体积蒸馏水在沸水浴中热回流提取2次，每次85min，抽滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥后粉碎，过110目筛，得到方格星虫提取物备用；

2)制备姜黄粉：取新鲜姜黄，清洗后榨汁，旋转蒸发浓缩至原有体积1/5，将浓缩液冷冻干燥后粉碎，过115目筛，得姜黄粉备用；

3)制备泡腾片：将柠檬酸、碳酸氢钠分别在55℃的条件烘干2h，取方格星虫多糖、方格星虫提取物、姜黄粉和碳酸氢钠干混，再加粘合剂进行湿混，制的碱性颗粒；接着取柠檬酸和填充剂麦芽糊精干混，加入粘合剂湿混，制得酸性颗粒；将碱性颗粒和酸性颗粒分别在40℃下烘干至含水量小于3％，接着将碱性颗粒和酸性颗粒混合，并在混合颗粒中加入润滑剂，再进行混匀、压片，即得所述泡腾片；粘合剂是由体积分数为3％的PVP和体积分数为75％的乙醇溶液按照质量比为1:2的比例混合所得。

实施例5

本实施例提供一种速溶泡腾片，该速溶泡腾片由以下重量份的原料组成：方格星虫多糖10份、方格星虫提取物25份、姜黄粉2份、碳酸氢钠25份、柠檬酸23份、麦芽糊精10份、润滑剂2份和粘合剂4份；其中方格星虫多糖为实施例2中所制得的方格星虫多糖；

上述速溶泡腾片的制备方法，包括如下步骤：

1)制备方格星虫提取物：将去除内脏并清洗后的裸体方格星虫体壁在60℃真空干燥箱中放置5h，然后取出，将样品粉碎过70目筛，过筛后的方格星虫粉末加入10倍体积蒸馏水在沸水浴中热回流提取4次，每次95min，抽滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥后粉碎，过130目筛，得到方格星虫提取物备用；

2)制备姜黄粉：取新鲜姜黄，清洗后榨汁，旋转蒸发浓缩至原有体积1/5，将浓缩液冷冻干燥后粉碎，过125目筛，得姜黄粉备用；

3)制备泡腾片：将柠檬酸、碳酸氢钠分别在65℃的条件烘干2.5h，取方格星虫多糖、方格星虫提取物、姜黄粉和碳酸氢钠干混，再加粘合剂进行湿混，制的碱性颗粒；接着取柠檬酸和填充剂麦芽糊精干混，加入粘合剂湿混，制得酸性颗粒；将碱性颗粒和酸性颗粒分别在50℃下烘干至含水量小于3％，接着将碱性颗粒和酸性颗粒混合，并在混合颗粒中加入润滑剂，再进行混匀、压片，即得所述泡腾片；粘合剂是由体积分数为3％的PVP和体积分数为75％的乙醇溶液按照质量比为1:3的比例混合所得。

试验例

对本申请实施例1-3所制得的方格星虫多糖降血糖作用的研究

1.对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

方法：阿卡波糖作为阳性对照。将多糖样品用PBS缓冲液进行稀释，配置一系列浓度为0.2～1.0mg/mL的不同多糖溶液。取100μL不同质量浓度的多糖样品加入试管中，分别加入100μL的α-淀粉酶溶液(比酶活＝1U/mL)，再加入1％淀粉溶液200μL，振荡混匀。37℃恒温水浴10min，加入1mL DNS试剂终止反应，100℃水浴10min，加入7.5mL冰蒸馏水稀释，于520nm处测吸光度。样品对照管用等量磷酸缓冲液代替酶溶液，空白对照管用等量磷酸盐缓冲液代替样品溶液，空白管为PBS缓冲溶液。

α-淀粉酶抑制率＝(1-((A样品+酶-A样品+PBS)/(APBS+酶-APBS)))×100％；

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：取200μL不同质量浓度的多糖样品加入试管中，分别加入200μL的α-葡萄糖苷酶溶液(比酶活＝1U/mL)，振荡混匀后，再加入100μL pNPG溶液(5mmol/L，pH 6.8PBS缓冲液配制)振荡混匀。37℃水浴30min，再加入200μL Na2CO3终止反应，于400nm测定吸光度。样品对照管用PBS缓冲液代替酶溶液，空白对照管用PBS缓冲液代替多糖溶液，空白管为PBS缓冲溶液。IC50值为达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。

α-葡萄糖苷酶抑制率＝(1-((A样品+酶-A样品+PBS)/(APBS+酶-APBS)))×100％

实验结果如图1所示，方格星虫多糖在0.2～0.6mg/mL的浓度范围内，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率呈浓度依赖性增加(p＜0.05，n＝3)。而当多糖浓度从0.6增加至1.0mg/mL时，抑制率变化较小且趋于稳定。在多糖浓度为1.0mg/mL时，方格星虫多糖和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为(80.25±0.95)％和(89.06±0.72)％。对α-淀粉酶抑制率分别为(75.27±1.09)％和(82.15±1.09)％，可见方格星虫多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用。阿卡波糖是一种治疗餐后高血糖症的临床药物，但阿卡波糖治疗经常伴随着副作用，如腹胀和腹泻。

2.利用链脲佐菌素构建的糖尿病小鼠模型，分析方格星虫多糖降血糖作用。

实验用小鼠：SPF级C57BL/6小鼠，雌性，体重18-22g。通过腹膜内注射新制备的链脲佐菌素溶液以80mg/kg体重的剂量诱导实验小鼠。注射链脲佐菌素溶液处理小鼠72h后，在小鼠尾部静脉取血，测量每只小鼠空腹血糖值。选取血糖值高于11.1低于21mmol/L的小鼠作为实验组，视为糖尿病小鼠模型。

阳性对照组用化学药物二甲双胍以200mg/kg体重的剂量处理，方格星虫多糖以低、中和高剂量给予治疗，分别为低剂量组：50mg/kg；中剂量组：100mg/kg；高剂量组：200mg/kg体重。在实验期间，每天都在固定时间灌胃一次。尾静脉取血测定各组小鼠的空腹血糖值(FBG)。给药后一周开始测定，测定4周。

实验分组如下：

1-Con(正常组)，以普通饲料喂养；

2-Dia(模型组):糖尿病小鼠；

3-Pos(阳性对照组)：200mg/kg二甲双胍；

4-方格星虫多糖低剂量组：50mg/kg；

5-方格星虫多糖中剂量组：100mg/kg；

6-方格星虫多糖高剂量组：200mg/kg。

方格星虫多糖对糖尿病小鼠空腹血糖的影响见图2。尿病小鼠给予方格星虫多糖和二甲双胍干预治疗4周后，糖尿病小鼠的空腹血糖水平得到了有效抑制。方格星虫多糖中剂量组(100mg/kg)在治疗第三周后血糖值趋于稳定，比糖尿病模型组下降了8.12±1.78mmol/L。

完成空腹血糖值的测定后，尾部取血0.5mL，4℃条件下4000r/min，离心10min，离心后取上层血清，血清中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)值，结果如图3-4。方格星虫多糖组能有效降低甘三酯、胆固醇水平，在第四周，方格星虫多糖剂量组甘三酯、胆固醇值接近正常组水平，优于阳性二甲双胍对照组。

给药后第4周测定小鼠血清中胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素含量。实验结果如图5-7。方格星虫多糖能显著提高胰岛素水平，效果优于阳性二甲双胍对照组。糖尿病模型组的胰高血糖素显著增高，阳性二甲双胍组和方格星虫多糖组能够抑制胰高血糖素浓度，方格星虫多糖中高剂量组胰高血糖素浓度与正常组相当。阳性二甲双胍组和方格星虫多糖组均能够抑制肾上腺素浓度，降低血糖浓度，但是方格星虫多糖组效果明显优于阳性对照组。

3.对肝糖元、肌糖元含量影响的测定

肝糖元和肌糖原主要贮存在肝和肌肉中作为备用能量，是由葡萄糖单位构成的高分子多糖，肝脏和肌肉组织中分别含有约4％和2％糖原。机体产生高血糖的主要原因之一是肝脏和肌肉组织不能储存糖元，组织无法利用葡萄糖为机体提供能量。实验结果如图8-9。糖尿病模型组小鼠肌糖原和肝糖原含量显著低于正常对照组小鼠肝糖原和肌糖原含量，(p<0.05)。经过药物二甲双胍和方格星虫多糖给药治疗四周后，肝糖原和肌糖原的含量与糖尿病模型组相比显著升高(p<0.05)，方格星虫多糖组效果显著优于阳性对照组，其中中剂量组对提高肝糖原含量效果最好，中高剂量组对提高肌糖原含量效果相当。

4.对糖尿病小鼠体重和器官体重比的影响

体重减轻和相对器官体重比数增加被认为是糖尿病的典型特征，这是与葡萄糖代谢缺陷和组织蛋白过度分解有关。实验结果如图10-11所示。与正常组的小鼠相对比，糖尿病组小鼠体重显著降低。给药4周后，方格星虫多糖可以显著增加糖尿病小鼠体重，其能力显著优于二甲双胍。在多糖的三种剂量中，中剂量组增加糖尿病小鼠体重的效果最明显。

糖尿病小鼠的肝脏、脾脏、肾脏体比指数比正常小鼠显著提高，给药4周后，阳性二甲双胍对照组与糖尿病模型组小鼠的体比相当，没有缓解。方格星虫多糖能显著降低糖尿病小鼠器官体比，中剂量组器官体比指数接近于正常小鼠组。

通过体外酶抑制活性和动物实验分析结果显示方格星虫多糖具有明显的降血糖功效。对动物实验结果显示，方格星虫多糖降血糖效果最佳剂量为100mg/kg体重。其降血糖效果明显优于阳性对照药物二甲双胍。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。