一种秋葵栽培种与野生黄葵远缘杂交的胚拯救方法

技术领域

本发明属于蔬菜生物技术育种领域，特别涉及一种秋葵栽培种与野生黄葵远缘杂交的胚拯救方法。

背景技术

秋葵（学名：

秋葵作为一种具有较高营养价值的多功能新型蔬菜，有很大的应用价值和开发潜力。许多国家都加大了秋葵育种相关研究工作，且推出了许多优良的新品种。而国内秋葵的栽培育种起步与国外相比较晚，商品化种植的一些优良品种几乎都是从国外引进，这极不利于我国秋葵产业的长远发展。

丰富的秋葵种质资源是筛选出良好品种的重要基础，同时也是进行有性杂交育种的基本保证。我国地域辽阔，所分布秋葵属植物相对丰富，除了作为蔬菜的栽培秋葵以外，还有木里秋葵、长毛黄葵、黄葵、箭叶秋葵等野生种资源。这些资源蕴含着很多有潜在利用价值的基因，如抗逆、抗病、富含某些特殊成分等，可以为改良栽培品种的各种农艺性状提供了丰富的育种材料。但秋葵栽培种与野生种之间属于远缘杂交，往往因存在严重的生殖障碍而难以成功。其中，除因亲本不育、杂交不亲和及受精失败等因素所致的受精前生殖障碍影响较大外，由于杂种胚与胚乳组织发育的不协调等所致的胚降解或败育或杂种不育而引起的杂种崩溃等受精后障碍，往往是导致远缘杂交失败的关键因素。

自从1904年 Ehanning进行幼胚离体培养首获成功之后，幼胚拯救作为一种克服受精后障碍中胚胎败育非常有效的技术，已经在花卉、蔬菜、果树等植物的远缘杂交育种领域得到了十分广泛的应用。根据培养对象的不同，幼胚拯救又可分为子房培养、胚珠培养和幼胚培养。一般来说，胚龄及体型越小，诱导越困难，尤其是发育早期，还在异养阶段的幼胚，离体培养较难成功。多半植物的幼胚必需在胚乳中长到子叶原基及器官等开始形成时，离体挽救才可能成功。幼胚拯救技术在作物杂交育种中对克服远缘杂交的胚败育、缩短杂交育种世代周期、加快育种速度是一种重要的技术手段，在秋葵新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力。

在幼胚拯救过程中影响胚培养的因素有很多，研究者主要关注于胚龄及接种时期、基本培养基、植物激素、外源添加物、培养条件、预处理方式等方面。从授粉开始到剥离胚培养的时间称为胚龄，不同植物种类胚的发育期不同，胚的成熟程度及剥离前是否已经发育或者死亡，均可意接影响胚培养的成功率。组织培养中培养的外植体不同，所用的培养基类型也不同，因此选择合适的培养基也是幼胚拯救成功的关键环节。除了上述重要因素外，胚拯救技术还受环境条件的影响，如光照、温度等。

目前国内外关于秋葵属植物远缘杂交幼胚拯救的研究，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种秋葵栽培种与野生黄葵远缘杂交的胚拯救方法，通过对培养体系中的培养基种类、植物激素、外源添加物、接种时期、低温预处理等因素进行了优化分析，以期建立良好高效的秋葵远缘杂交种胚培养体系。

为了实现上述目的，本发明是采用以下技术方案实现：

一种秋葵栽培种与野生黄葵远缘杂交的胚拯救方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）远缘杂交：以秋葵栽培种为母本，以野生黄葵为父本，在母本开花前1~2d进行人工去雄并套袋，待母本柱头完全成熟可以分泌黏性物质时，利用收集的父本花粉进行授粉，授粉结束后及时套袋；

2）胚珠发育培养：远缘杂交授粉9~11d后从母本植株上摘取子房，先放入4℃冰箱进行低温处理 3~5d，然后进行消毒处理，在无菌条件下剥离出胚珠接种到发育培养基上，置于培养温度23~27℃、光照强度1500~2000lx、每日光照10~12h的条件下培养至胚珠发育；

3）幼胚萌发培养：将发育的胚珠进行横切，再转接至萌发培养基上，置于培养温度23~27℃、光照强度2000~3000lx、每日光照14~16h的条件下培养至幼胚萌发成具有子叶和胚根的胚；

4）幼胚成苗培养：将萌发的胚转接至成苗培养基上，置于培养温度23~27℃、光照强度3000~4000lx、每日光照14~16h的条件下培养直至胚长成完整试管苗；

5）炼苗及移栽：待试管苗生长稳定健壮时将其从瓶中取出，用清水洗除其根部残留的培养基，移栽到装有基质的营养钵中，放入温室，用透明塑料杯遮盖试管苗，逐步揭盖至完全揭开，使其完全适应外界环境，1周左右后带基质移栽到温室土壤中，正常栽培管理。

所述步骤1）中，授粉的时间为8:00-10:00，同一花蕾初次授粉2d后重复授粉1次。

所述步骤2）中，消毒处理的方法为：将子房用清水冲洗干净后放入超净工作台内，用75%酒精浸泡30s，并不断晃动，然后用无菌水漂洗1次，再放入0.1%氯化汞中浸泡10min并不断晃动，再用无菌水漂洗3次。

所述步骤2）中，发育培养基的配方为：MS+IAA1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L +多效唑0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+硝酸银8.0mg/L。

所述步骤2）中，胚珠发育是指胚珠转绿、膨大。

所述步骤3）中，萌发培养基的配方为：KNO

所述步骤4）中，成苗培养基的配方为：1/2MS+IBA0.5mg/L+活性炭1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。

所述步骤5）中，基质成分为：泥炭∶珍珠岩∶蛭石=1∶1∶1。

所述步骤5）中，温室的温度保持在25~30℃，相对湿度保持在85~95%。

由表1可以看出，低温处理对胚珠发育以及幼胚的萌发都具有促进作用，并呈现一定的规律性。在低温处理3d时，胚珠发育率最高，达80.3%，低温处理5d时，胚萌发率最高，达54.5%，随着处理时间的延长，胚珠发育率及胚萌发率降低，可见，低温处理3~5d对胚拯救效果最好。

实施例3不同浓度5-氨基乙酰丙酸对幼胚萌发的影响

按照实施例1中的方法，将发育的胚珠进行横切，再转接至添加不同浓度5-氨基乙酰丙酸的萌发培养基上培养，5-氨基乙酰丙酸浓度设计为 0mg/L、1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L共5个浓度，统计胚萌发率，结果见下表2。

由表2可以看出，与对照相比添加0.5~10.0mg/L的5-氨基乙酰丙酸均能提高胚萌发率，当5-氨基乙酰丙酸的浓度为5.0mg/L时胚萌发率最高，为55.9%，其次是浓度为1.0mg/L时，胚萌发率为50.0%，而浓度提高到10.0mg/L时胚萌发率反而降低，这说明添加较低浓度的5-氨基乙酰丙酸对促进幼胚萌发有更好的效果，5.0mg/L是5-氨基乙酰丙酸的最佳浓度。

实施例4不同浓度环烷酸钠对胚萌发的影响

按照实施例1中的方法，将发育的胚珠进行横切，再转接至添加不同浓度环烷酸钠的萌发培养基上培养，环烷酸钠浓度设计为 0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L共5个浓度，统计胚萌发率，结果见下表3。

由表3可以看出，当环烷酸钠浓度小于1.0mg/L时，胚萌发率随环烷酸钠浓度的增大而提高，当环烷酸钠浓度为1.0mg/L时，幼胚萌发效果最好，胚萌发率达52.3%，当环烷酸钠浓度为2.0mg/L时，则胚萌发率明显下降，低于对照，说明高浓度的环烷酸钠可能抑制幼胚的萌发。因此1.0mg/L是环烷酸钠的最佳浓度。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。