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一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法

文献发布时间：2023-06-19 11:22:42

技术领域

本发明涉及动物检验检疫技术领域，尤其涉及一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。

背景技术

布鲁氏菌病，简称布病，是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病，以发热和流产为主要特征，流行于170多个国家和地区，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁，我国将其列为二类动物疫病。布病国内传染源主要为羊，其次为牛和猪。

布鲁氏菌病的发病原因主要由环境因素和人为因素组成：

环境因素：在牛羊养殖过程中，动物的生长环境对其自身健康安全有重要影响。倘若养殖场的养殖条件不适合动物生长习性，且禽畜本身适应性较低时，会损害动物的健康，甚至会降低养殖场户的养殖效益。除此之外，当外界天气恶化亦或空气中湿度高达60％～90％时，湿热环境很容易滋生各种霉菌，导致牛羊自身处于亚健康状态，使免疫力不断下降，为动物疾病的发生和传播创造了条件。

人为因素：在牛羊养殖过程中，极易感染布病，如：病畜接生、剥牛羊皮、剪打羊毛、挤乳、切病毒肉、屠宰病畜、儿童玩羊等均可受染，病菌从接触处的破损皮肤进入人体；实验室工作人员常可由皮肤、黏膜感染细菌；进食染菌的生乳、乳制品和未煮沸病畜肉类时，病菌可自消化道进入体内。此外，病菌也可通过呼吸道黏膜、眼结膜和性器官黏膜而发生感染。因此，随着养殖场建设规模和建设数量的持续增加，需重视动物疾病预防和控制，建立完善的养殖设施和消毒设备，否则会增加疾病的发生率，给企业带来难以预估的经济损失。

2019年中国布鲁氏菌病发病数量为44036例，死亡人数为1人；2020年1-8月中国布鲁氏菌病发病数量为35112例，死亡人数为1人。我国曾设立21个检测点，对573032位职业人群展开调查，血清学检测196636人，检出阳性39190例，平均阳性率为18.11％。检测点菌164株，结合部分送检菌株，在全部276株菌种，羊布鲁氏菌占74％，还有16％菌株待鉴定，说明引起我国布鲁氏菌病疫情的优势菌株是羊布鲁氏菌。

布鲁氏菌病的诊断是布鲁氏菌病的研究重点和难点，目前，我国针对羊布鲁氏病，采取的检测方法主要有：RBPT(虎红平板凝集试验法)、CFT(补体结合试验法)、SAT(试管凝集试验法)、ELISA(酶联免疫法)、多重PCR等，其中RBPT用于初次筛选，而CFT和SAT主要用于诊断定性，SAT易有假阴性和假阳性，会给诊断带来影响，而CFT操作起来比较复杂，其要求检测者要具备一定的能力，不利于布病净化，ELISA一般多用于检测抗体，且灵敏度不高，而PCR灵敏度高，但操作繁琐，设备贵，反应时间长，不利于快检。因此，研究一种快速、特异、灵敏的检测方法应用到布鲁氏菌病的诊断中是非常迫切的。

发明内容

本申请的目的是克服现有技术的缺陷，提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本申请提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及两条环引物LB-1和LF-1；所述的引物序列如下：

外引物F3-1的序列为：TGGCGTTCCTTGTACAGC；

外引物B3-1的序列为：GCCATTATGGTGACTGTCCG；

内引物FIP-1的序列为：

CTCAAGGCAACGGCTCAGATCACTCCAGTCGATTGTTGGGAC；

内引物BIP-1的序列为：

GTGATCGGCATCATAGGCTGCATTCTATCCGGCTTGAAGGGT；

环引物LB-1的序列为：TCAGCAATGACATGCCCCA；

环引物LF-1的序列为：TCAATCCAACACGTTCCAGT。

为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2；所述的引物序列如下：

外引物F3-2的序列为：AATGACATGCCCCACACC；

外引物B3-2的序列为：TCGAAAGTCCACGCAGATG；

内引物FIP-2的序列为：

TCGGCCTACCGCTGCGAATAACTTGAAGCTTGCGGACAGT；

内引物BIP-2的序列为：

ACAGCATGCAGCTTGGTCGTGCAAAAGGGGGGCTGAAG。

为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF-3；所述的引物序列如下：

外引物F3-3的序列为：TTGTACAGCCTCCAGTCGA；

外引物B3-3的序列为：CATTATGGTGACTGTCCGCA；

内引物FIP-3的序列为：

GGCCTTCATTGCCAGCAATCTCTGTTGGGACACTGGAACGT；

内引物BIP-3的序列为：

AGTGATCGGCATCATAGGCTGCTCTATCCGGCTTGAAGGGT；

环引物LB-3的序列为：ATCAGCAATGACATGCCCCA；

环引物LF-3的序列为：CTCAGATCAAGGTCAATCCAAC。

为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的扩增反应液，所述反应液包括上述所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物。

作为本申请的进一步改进，所述扩增反应液还包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl

为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及8联排检测管，所述检测管设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液、核酸染料和稳定液，所述阴性对照溶液为0.9％的生理盐水，所述阳性对照溶液中含有羊布鲁氏菌基因非传染DNA片段，所述扩增反应液为上述所述的扩增反应液。

作为本申请的进一步改进，所述洗涤液为0.9％的生理盐水。

作为本申请的进一步改进，所述核酸染料为SYBR Green。

作为本申请的进一步改进，所述裂解液为TRIZOL。

为实现上述目的，本申请还提供了一种应用上述所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含模板DNA的样本溶液；S3、加样反应：取若干检测管分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本测样管，依次将阴性对照溶液、阳性对照溶液以及步骤S2中的样本溶液分别加入阴性对照管、阳性对照管和样本测样管中，并使各所述检测管中的溶液充分混合均匀，离心使液体集中到各所述检测管的底部，再将检测管置于60℃～65℃条件下保温30min～60min，最后使所述检测管中的扩增反应液、核酸染料充分混匀并离心，使充分反应的溶液聚集于所述检测管的底部；S4、结果判读。

本申请的有益效果在于，通过提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法，可以快速、准确的检测出动物组织样本中的羊布鲁氏菌病毒，成本低，可推广性高，市场应用前景广阔。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本申请的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

为了高效、快速、低成本的检测羊布鲁氏菌，提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP(环介导等温扩增技术)检测的引物：包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP；作为进一步优选的实施方案，还可包括两条环引物LB和LF；本申请提供了三个用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物实施例，如实施例1～实施例3。

实施例1

一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及两条环引物LB-1和LF-1；该引物的序列如表一所示，

表1 LAMP第一组引物序列表

实施例2

一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2；该引物的序列如表二所示，

表2 LAMP第二组引物序列表

实施例3

一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF-3；该引物的序列如表三所示，

表3 LAMP第三组引物序列表

本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的扩增反应液，所述扩增反应液包括但不仅仅限于实施例1～实施例3所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物。作为本申请优选的实施方案，所述扩增反应液还包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl

实施例4

一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的扩增反应液，扩增反应液由以下组份组成：引物以及其他组分，其他组分包括：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各0.8mmol/L～2.0mmol/L，MgCl

本申请中，还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及8联排检测管，所述检测管设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液、核酸染料和稳定液，所述阴性对照溶液为0.9％的生理盐水，所述阳性对照溶液中含有羊布鲁氏菌基因非传染DNA片段，所述扩增反应液为上述所述的扩增反应液，优选实施例4所述的扩增反应液。作为优选的实施方案，所述洗涤液为0.9％的生理盐水；所述核酸染料为SYBR Green；所述裂解液为TRIZOL；所述稳定液为石蜡油。进一步优选的，所述核酸染料预先粘附于检测管的管盖内侧中央位置或检测管的管壁内侧上方。

实施例5

一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有0.9％的生理盐水的离心管、含有TRIZOL的离心管、含有0.9％的生理盐水的阴性对照管、含有羊布鲁氏菌基因非传染DNA片段的阳性对照管以及8联排检测管，8联排检测管包括8个检测离心管，每个检测离心管内预先设有扩增反应液和SYBR Green，且所述扩增反应液为实施例4中的扩增反应液。

为实现上述目的，本申请提供了一种应用羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含模板DNA的样本溶液；S3、加样反应：取若干检测管分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本测样管，依次将阴性对照溶液、阳性对照溶液以及步骤S2中的样本溶液分别加入阴性对照管、阳性对照管和样本测样管中，并使各所述检测管中的溶液充分混合均匀，离心使液体集中到各所述检测管的底部，再将检测管置于60℃～65℃条件下保温30min～60min，最后使所述检测管中的扩增反应液、核酸染料充分混匀并离心，使充分反应的溶液聚集于所述检测管的底部；S4、结果判读：肉眼观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则表示该样本的检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样本的检测结果为阴性。也可以将反应管放置在本司配套恒温扩增仪器内，读取荧光值，定量确定样本中羊布鲁氏菌病毒的核酸量。其中阴性对照孔以及阳性对照孔内的实验步骤起监控实验的作用，如果阴性对照孔内的扩增反应液未呈现橙黄色或阳性对照孔内的扩增反应液未呈现绿色，则表明该批样品的检测失效，需重新操作实验，直到阴性对照孔内的扩增反应液呈现橙黄色和阳性对照孔内的扩增反应液呈现绿色，表明整批样品测试有效。

为验证本申请技术方案具有优异的技术效果，提供了以下实施例对本申请作进一步说明。

实施例6

应用实施例5的试剂盒对某1岁龄成年公羊为检测对象，按如下步骤进行检测：

S1、取检测对象1ml血清样本，置于离心管中，于12000r/min的转速下离心5min，去除上清液收集沉淀，再加入1mL生理盐水洗涤沉淀，洗涤，再于12000r/min离心5min，反复洗涤离心3次后，收集沉淀；

S2、核酸提取，用100μl商用化TRIzol DNA提取液重悬步骤S1中的沉淀，混匀，100℃温浴裂解10min，立即置于冰上2min，然后10000r/min离心2min，取上清液即为含模板DNA的样品溶液；

S3、加样反应，取出若干检测管，分别标记阴性对照管、样品检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性对照溶液、步骤S2的样品溶液和阳性对照溶液各2μl，盖紧检测管管盖，充分混匀，瞬离使液体集中在检测管底部，转移到检测区，恒温扩增63℃条件下保温40min；作为优选的实施方案，如进行荧光定量PCR仪反应，则将反应程序设置为63℃15s、65℃45s，40次循环；

S4、染料混合，上述步骤完成后，将上述阴性对照管、样品检测管和阳性对照管向下甩动，使管中的扩增反应液与染料充分混合，离心使混合后的液体聚集于管底部；

S5、结果判读：肉眼直接观察阴性对照管、样品检测管和阳性对照管，阴性对照管扩增反应液显示为橙黄色，阳性对照管扩增反应液显示为绿色，该实验有效，样品检测管中的扩增反应液呈现绿色，表示样本的检测结果为阳性，经判定该1岁龄成年公羊含羊布鲁氏菌病毒。

实施例7

应用实施例5的试剂盒分别对已感染布鲁氏杆菌的某1岁龄母猪、某1岁龄公牛和某1岁龄母犬为检测对象，按如下步骤进行检测：

S1、分别取各检测对象1ml血清样本，分别置于单独的离心管中，并分别于12000r/min的转速下离心5min，去除上清液收集沉淀，再加入1mL生理盐水洗涤沉淀，洗涤，再于12000r/min离心5min，反复洗涤离心3次后，分别收集沉淀；

S2、分别进行核酸提取，用100μl商用化TRIzol DNA提取液重悬步骤S1中的沉淀，混匀，100℃温浴裂解10min，立即置于冰上2min，然后10000r/min离心2min，取上清液即为含模板DNA的样品溶液；

S3、分别进行加样反应，取出若干检测管，分别标记阴性对照管、样品检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性对照溶液、步骤S2的各样品溶液和阳性对照溶液各2μl，盖紧检测管管盖，充分混匀，瞬离使液体集中在检测管底部，转移到检测区，恒温扩增63℃条件下保温40min；作为优选的实施方案，如进行荧光定量PCR仪反应，则将反应程序设置为63℃15s、65℃45s，40次循环；

S5、结果判读：肉眼直接观察阴性对照管、样品检测管和阳性对照管，阴性对照管扩增反应液显示为橙黄色，阳性对照管扩增反应液显示为绿色，该实验有效，各样品检测管中的扩增反应液均呈现绿色，表示样本的检测结果为阳性，经判定某1岁龄母猪、某1岁龄公牛和某1岁龄母犬均含羊布鲁氏菌病毒。

实施例8

应用市面上常规的PCR检测试剂盒及实施例5的试剂盒分别对浓度为10

PCR检测中：PCR引物采用本方法反应中的外引物F3和B3；PCR体系为25μl体系，反应液由以下组份组成：10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/L dNTPs 2μl，引物F3和B3各1ul，Taq酶0.15μl(5U/μl)，模板DNA 2μl，最后用灭菌水补至25μl体积；反应程序设置：95℃预变性5min；95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，30个循环；72℃延伸3min；PCR产物取10μl与1％琼脂糖凝胶电泳，100V电压30min，观察结果。

PCR检测结果：PCR检测方法检测样本浓度为10

LAMP扩增灵敏度检测结果：

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，10

由以上两种方法比较可以看出，本发明的核酸快速检测试剂盒灵敏度可达到10

本申请试剂盒的反应原理主要是利用恒温扩增技术，选取样羊布鲁氏菌病毒基因保守区的六个不同的区域，设计4条引物，结合具有链置换功能的DNA聚合酶，实现核酸恒温扩增。扩增产物与核酸染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增曲线判读结果，从而实现对样本中羊布鲁氏菌病毒的测定。本申请中由NCBI基因库检索获得羊布鲁氏菌病毒的核苷酸序列，通过Blast软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再应用Primer5.0软件设计羊布鲁氏菌病毒特异性引物具体序列。

综上所述，该检测方法可以准确区分含有羊布鲁氏菌病毒与不含羊布鲁氏菌病毒的样本，即进行LAMP特异性检测后，表明设计引物的特异性良好，能准确区分含有羊布鲁氏菌病毒与不含羊布鲁氏菌病毒的样本。本申请的试剂盒及检测方法能快速、准确的检测出羊布鲁氏菌病毒，通过目测或仪器观察结果，数据处理简单，成本低，对临床检测有重要意义。本发明检测通量高，在样本数量多的情况下比其他检测方法效率更高，检测所需要的仪器也简单，整个实验只需要荧光PCR仪即可完成检测，有较强的经济效益，特别适合畜牧场使用，检测实惠，可大量推广。

本发明的关键技术是LAMP恒温扩增法检测羊布鲁氏杆菌试剂盒尤其是针对羊布鲁氏杆菌设计的引物序列，本申请中的引物序列是经过大量实验筛选出，更有利于检测，敏感性更高，特异性更强；本申请涉及的扩增反应体系，有利于检测实验开展，降低污染率，检测结果更准确，同时稳定性更好，有利于长期保存；本申请所提供的试剂盒可肉眼判读结果也可借助扩增仪读取数据，准确测定样本中是否含有羊布鲁氏杆菌病毒，从而对后续治疗提出建议，适合养殖单位和进出口检疫部门使用，实验流程简单，适合普通从业人员使用。

虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本申请的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本申请的保护范围，凡未脱离本申请技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 爱若维生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA