一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒、染色方法及应用

技术领域

本发明属于临床病理检测技术领域，具体涉及一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒、染色方法及应用。

背景技术

免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)又称免疫细胞化学染色，简称免疫组化，是病理学诊断、鉴别诊断、肿瘤特异性分子靶标筛选、鉴定的最重要平台性技术。

目前，最常规的免疫组化显色方式是基于辣根过氧化物酶(HRP)系统，显色底物为二氨基联苯胺(DAB)的检测系统。在病理科的日常免疫组化检测工作中，存在一部分病理组织，这些组织中含有与DAB显色颗粒颜色近似的色素或者其他物质，如黑素瘤中的黑色素、肺癌组织中的碳颗粒等。这些物质大量的分布在组织细胞上，遮盖了组织细胞的形态结构，在采用传统的免疫组化显色方法时，DAB呈现的棕褐色或者棕褐色与这些物质的色彩难以区分，严重影响其免疫组化结果的判读。

解决办法一般有两种，一种方法是在进行免疫组化试验前，对组织进行去黑素处理，采用强氧化剂去除色素，但是黑色素表现稳定，强烈的氧化处理容易导致组织切片中的部分抗原丢失和试验过程中的组织脱片问题，同时，碳颗粒等其他物质用强氧化剂也无法去除，该方法存在很多的局限性；另外一种方法是采用基于AP酶标系统，显色底物为FASTRED的检测系统进行这类组织的检测，该显色系统的阳性颗粒为红色，可以和色素有明显的区分。

目前，病理诊断医师通常需要通过多种检测方法来对病理组织进行综合判断和评估，例如将免疫组化检测指标与特殊染色指标联合来对病理组织染色后进行诊断。因此，需要准备多张切片，分别进行不同种类肿瘤标志物的免疫组化染色及特殊染色(如弹性纤维染色等)；并在染色后在显微镜下反复对照组织位置，结合免疫组化指标和特殊染色结果来做出综合判断。这不仅需要多张连续组织切片，即使连续切片也可能存在较大差异；另外针对一些穿刺组织，本来样本量有限，难以获得足够数量的切片用于各种染色或是多指标检测。因此，在标本或片子量有限的情况下，如能在同一张组织玻片上实现多重指标的检测，呈现更多信息量成为本领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，该试剂盒能够在同一张组织切片上同时进行特定肿瘤标志物的免疫组化染色(红染)和弹性纤维特殊染色(蓝染)，染色色彩对比鲜明直观。

本发明的第二个目的在于提供免疫组化联合弹性纤维双重染色方法。

本发明的第三个目的在于提供上述免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒、染色方法的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，包括如下组分：抗原修复液、维多利亚蓝染液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、碱性磷酸酶标二抗聚合物、碱性磷酸酶系统红染底物、与红染底物匹配的红染缓冲液；所述一抗试剂为AP标记的TTF-1抗体、AP标记的CK20抗体或AP标记的Her-2抗体。

优选的，所述碱性磷酸酶标二抗聚合物包括碱性磷酸酶标-抗鼠聚合物和/或碱性磷酸酶标-抗兔聚合物。

优选的，所述碱性磷酸酶标二抗聚合物包括碱性磷酸酶标-抗鼠聚合物、碱性磷酸酶标-抗兔聚合物、蛋白保护剂和抑菌剂。

优选的，所述碱性磷酸酶系统红染底物以坚牢红(fast red，快红)为色原，所述红染缓冲液中包括萘酚磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷。

优选的，所述抗原修复液为柠檬酸修复液(pH6.0)或EDTA修复液(pH9.0)。

优选的，所述维多利亚蓝染液主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。具体配制方法如下：

维多利亚蓝2.0g(aladdin，货号V108746)，糊精0.5g(北京奥博星生物20060408)，间苯二酚4.0g(aladdin，货号R111662)，蒸馏水200ml。混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。再将30％三氯化铁(天津永大，货号20190514)水溶液25ml煮沸后加入上述混合液中，继续煮沸3min，要不断搅拌，搅拌棒上会出现胶样物质。然后终止加热，冷却后过滤。将滤纸上的物质连同滤纸放入60℃恒温箱中烤干。再将烤干的蓝色粉末连同滤纸溶于400ml 70％乙醇中。最后加浓盐酸4ml，苯酚5g，苯酚不能溶解时可略加温溶解。放置成熟后使用。

优选的，所述过氧化物酶封闭剂购自赛诺特生物技术有限公司，货号SD8003。

优选的，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)。

本发明提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色方法，为方法一或方法二，方法一包括如下步骤：

(1)抗原修复；

(2)取待检测的含色素组织切片滴加过氧化物酶封闭剂，进行内源性过氧化物酶的封闭；

(3)使用一抗试剂对组织切片进行孵育，然后使用碱磷酸酶标二抗聚合物进行孵育，所述一抗试剂为AP标记的一抗；

(4)使用红染显色液对组织切片于常温孵育染色5-10min；所述红染显色液中包括：基于碱性磷酸酶系统的红染底物和与红染底物匹配的红染缓冲液；

(5)使用维多利亚蓝染液对组织切片进行弹力纤维染色；

方法二包括如下步骤：

(1)抗原修复；

(2)取待检测的含色素组织切片使用维多利亚蓝染液进行弹力纤维染色；

(3)对组织玻片滴加过氧化物酶封闭剂，进行内源性过氧化物酶的封闭；

(4)使用一抗试剂对组织切片进行孵育，然后使用碱磷酸酶标二抗聚合物进行孵育，所述一抗试剂为AP标记的一抗；

(5)使用红染显色液对组织切片于常温孵育染色5-10min，所述红染显色液中包括：基于碱性磷酸酶系统的红染底物和与红染底物匹配的红染缓冲液。

优选的，所述抗原修复采用高压修复法或微沸修复法。

进一步优选的，所述高压修复法包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉；所述微沸修复法包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。

本发明还提供了上述免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒或染色方法在病理组织染色中的应用。

本发明取得的有益效果：

本发明提供的试剂盒首次将免疫组化染色和弹性纤维染色有机结合，能够在同一张组织切片上同时进行特定肿瘤标志物的免疫组化染色(红染)和弹性纤维特殊染色的双重染色。与分别进行免疫组化染色、弹性纤维染色相比，对组织样本的需求量显著降低，染色色彩对比鲜明直观，无需在显微镜下反复对照不同切片的组织位置，所提供的信息量显著优于传统单染。

本发明还提供了免疫组化联合弹性纤维双重染色方法，该方法并非简单的将传统免疫组化和弹性纤维染色方法叠加。传统的弹性纤维染色需要经过高锰酸钾氧化和草酸溶液漂白后，才能进行后续的维多利亚蓝染色。本发明经过对染色步骤的设计调整与大量实验验证，将免疫组化染色和弹性纤维染色有机结合，在组织进行免疫组化快红显色后，再进行弹性纤维染色或是先进行弹力纤维染色再进行免疫组化红染色，省去了高锰酸钾的氧化和草酸溶液漂白两个步骤，简化染色程序，提高检测效率。

附图说明

图1为试验例1染色结果图；

该图为肺组织，进行高锰酸钾氧化后弹性纤维染色(弹性纤维被染成蓝色)。

图2为试验例2染色结果图；

该图为肺组织，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色。

图3为试验例3染色结果图；

该图为肺组织，进行免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色。

图4为试验例4染色结果图；

该图为肺组织，免疫组化高压修复，进行免疫组化TTF-1红染染色。

图5为试验例5染色结果图；

该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行免疫组化TTF-1红染染色，再进行弹性纤维TTF-1红染染色。

图6为试验例6染色结果图；

该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行免疫组化TTF-1红染染色。

图7为试验例7染色结果图。

该图为肠组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行免疫组化CK20红染染色，再进行弹性纤维染色。

图8为试验例8染色结果图。

该图为乳腺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行免疫组化Her2红染染色，再进行弹性纤维染色。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的各类试剂和仪器若无特殊说明均为市售商品。

实施例1 免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1

该实施例提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，包括如下组分：

1)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)；

2)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法如下：

维多利亚蓝2.0g(aladdin，货号V108746)，糊精0.5g(北京奥博星生物20060408)，间苯二酚4.0g(aladdin，货号R111662)，蒸馏水200ml。混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。再将30％三氯化铁(天津永大，货号20190514)水溶液25ml煮沸后加入上述混合液中，继续煮沸3min，要不断搅拌，搅拌棒上会出现胶样物质。然后终止加热，冷却后过滤。将滤纸上的物质连同滤纸放入60℃恒温箱中烤干。再将烤干的蓝色粉末连同滤纸溶于400ml 70％乙醇中。最后加浓盐酸4ml，苯酚5g，苯酚不能溶解时可略加温溶解。放置成熟后使用。

3)过氧化物酶封闭剂，购自赛诺特生物技术有限公司，货号SD8003；

4)一抗试剂：所述一抗试剂为AP标记的TTF-1抗体；

在其他实施例中，所述一抗试剂为AP标记的CK20抗体或AP标记的Her-2抗体。

5)碱性磷酸酶标二抗聚合物，包括碱性磷酸酶标-抗鼠聚合物、碱性磷酸酶标-抗兔聚合物、蛋白保护剂和抑菌剂(购自赛诺特生物技术有限公司，货号SD8003)；

6)碱性磷酸酶系统红染底物，购自赛诺特生物技术有限公司，货号SD8003；

7)红染底物匹配的红染缓冲液，购自赛诺特生物技术有限公司，货号SD8003；

8)清洗液，TBST缓冲液(pH8.0)。

对比例1 弹性纤维染色试剂盒1

该对比例提供了传统的弹性纤维染色试剂盒1，包括如下组分：

1)高锰酸钾氧化剂：1％高锰酸钾水溶液

2)草酸漂白剂：2％草酸水溶液

3)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法参见实施例1；

对比例2 弹性纤维染色试剂盒2

该对比例提供了弹性纤维染色试剂盒2，该试剂盒不包含高锰酸钾氧化剂、草酸漂白剂，具体包括如下组分：

维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法参见实施例1；

对比例3 弹性纤维染色试剂盒3

该对比例提供了弹性纤维染色试剂盒3，该试剂盒不包含高锰酸钾氧化剂、草酸漂白剂，但增加了抗原修复液，具体包括如下组分：

1)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法参见实施例1；

2)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)。

对比例4 免疫组化染色试剂盒

该对比例提供了一种免疫组化染色试剂盒，具体包括如下组分：

1)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)；

2)碱性磷酸酶(AP酶)标记二抗

3)快红显色剂

4)快红缓冲液。

实施例2 免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1

该对比例提供了免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1：组织切片脱蜡水化后；高压修复；先进行免疫组化红染色，再进行弹性纤维染色，染色步骤如下：

(1)抗原修复，采用高压修复法或微沸修复法，首选高压修复法；

其中，高压修复法包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉；微沸修复法包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。

(2)取待检测的含色素组织切片滴加过氧化物酶封闭剂，进行内源性过氧化物酶的封闭；

(3)使用一抗试剂对组织切片进行孵育，然后使用碱磷酸酶标二抗聚合物进行孵育，所述一抗试剂为AP标记的一抗；

(4)使用红染显色液对组织切片于常温孵育染色5-10min；所述红染显色液中包括：基于碱性磷酸酶系统的红染底物和与红染底物匹配的红染缓冲液；

(5)使用维多利亚蓝染液对组织切片进行弹力纤维染色。

实施例3 免疫组化联合弹性纤维双重染色方法2

该实施例提供免疫组化联合弹性纤维双重染色方法2，组织切片脱蜡水化后；高压修复；先进行弹性纤维染色，再进行免疫组化红染色，染色步骤如下：

(1)抗原修复，采用高压修复法或微沸修复法，首选高压修复法；

其中，高压修复法包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉；微沸修复法包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。

(2)取待检测的含色素组织切片使用维多利亚蓝染液进行弹力纤维染色；

(3)对组织玻片滴加过氧化物酶封闭剂，进行内源性过氧化物酶的封闭；

(4)使用一抗试剂对组织切片进行孵育，然后使用碱磷酸酶标二抗聚合物进行孵育，所述一抗试剂为AP标记的一抗；

(5)使用红染显色液对组织切片于常温孵育染色5-10min，所述红染显色液中包括：基于碱性磷酸酶系统的红染底物和与红染底物匹配的红染缓冲液。

对比例5 弹性纤维染色方法1

该对比例提供了传统弹性纤维染色方法1，包括如下步骤：

1)组织脱蜡、水化；

2)1％高锰酸钾水溶液氧化5min，纯化水冲洗；

3)2％草酸水溶液漂白1-3min，至标本无色为止，细流水稍洗；

4)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育0.5-2小时；

5)95％乙醇快速浸洗至无多余染液洗掉。

对比例6 弹性纤维染色方法2

该对比例提供了组织切片脱蜡水化后，不进行高锰酸钾氧化、草酸漂白，直接进行维多利亚蓝染色的弹性纤维染色方法2，包括如下步骤：

1)组织脱蜡、水化；

2)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育0.5-2小时

3)95％乙醇快速浸洗至无多余染液洗掉。

对比例7 弹性纤维染色方法3

该对比例提供了组织切片脱蜡水化后，先进行免疫组化高压修复，不进行高锰酸钾氧化、草酸漂白，而后进行维多利亚蓝染色的弹性纤维染色方法2，包括如下步骤：

1)组织脱蜡、水化；

2)高压修复3min；

3)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育0.5-2小时

4)95％乙醇快速浸洗至无多余染液洗掉。

对比例8 免疫组化染色方法

该对比例提供了免疫组化染色方法：组织切片脱蜡水化后，高压修复，然后进行免疫组化染色，染色步骤如下：

1)组织脱蜡、水化；

2)高压修复3min；

3)免疫组化红染色，操作步骤如下：

A.一抗孵育，参照抗体试剂说明书进行。

B.加AP标记二抗

除去清洗液，加入100μLAP标记二抗，室温孵育30min。

C.快红显色

除去清洗液，加入100μL新鲜配制的快红染色液，室温孵育5～10min。

注：快红染色液溶液配制：采用快红显色剂和快红缓冲液按比例配制，现配现用。

D.封片

在玻片上样本区域滴加1滴水性封片剂进行封片，自然晾干或者65℃烤干，如需长期保存，干燥后再滴加中性树胶进行封片处理即可。

E.光学显微镜阅片。

试验例

该部分分别采用实施例1或对比例1-4提供的试剂盒，按照实施例2-3或对比例5-8提供的染色方法对肺癌病理组织进行染色，对本发明免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒的实际应用效果以及染色方法步骤的可靠性及稳定性进行进行了验证，证明了本发明试剂盒组分合理，染色结果准确可靠，能够实现在同一张组织切片综合显示出两种检测结果。

试验例1

该试验例采用对比例1提供的弹性纤维染色试剂盒1，按照对比例5提供的传统的弹性纤维染色方法1对肺癌病理组织进行弹性纤维单染。

染色结果如图1所示，该图为肺组织，进行高锰酸钾氧化后弹性纤维染色(弹性纤维被染成蓝色)。

试验例2

该试验例采用对比例1提供的弹性纤维染色试剂盒2，按照对比例6提供的弹性纤维染色方法2对肺癌病理组织进行弹性纤维单染。

染色结果如图2所示，该图为肺组织，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色。

试验例3

该试验例采用对比例3提供的弹性纤维染色试剂盒3，按照对比例7提供的弹性纤维染色方法3对肺癌病理组织进行弹性纤维单染。

染色结果如图3所示，该图为肺组织，进行免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色。

试验例4

该试验例采用对比例4提供的免疫组化染色试剂盒，按照对比例8提供的免疫组化染色方法对肺癌病理组织进行染色。

染色结果如图4所示，该图为肺组织，免疫组化高压修复，进行免疫组化TTF-1红染染色。

试验例5

该试验例采用实施例1提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1，按照实施例2提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1对肺癌病理组织进行双重染色。

染色结果如图5所示，该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行免疫组化TTF-1红染染色，再进行弹性纤维染色。

试验例6

该试验例采用实施例1提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1，按照实施例3提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色方法2对肺癌病理组织进行双重染色。

染色结果如图6所示，该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行免疫组化TTF-1红染染色。

试验例7

该试验例采用实施例1提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1，按照实施例2提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1对肠癌病理组织进行双重染色。

染色结果如图7所示，该图为肠组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行免疫组化CK20红染染色，再进行弹性纤维染色。

试验例8

该试验例采用实施例1提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1，按照实施例2提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1对肠癌病理组织进行双重染色。

染色结果如图8所示，该图为乳腺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行免疫组化Her2红染染色，再进行弹性纤维染色。

对比图1、图2可知，对于弹性纤维单染来说，高锰酸钾氧化十分必要，未经高锰酸钾氧化的组织其弹力纤维着色显著减弱。对比图1-3可知，组织如果进行高压修复后，省略高锰酸钾氧化，弹力纤维染色色彩与正常高锰酸钾氧化、草酸脱色具相当的染色效果。但是使用高压修复的方法，省略了高锰酸钾氧化和草酸脱色两步，在相同的染色效果下，弹力纤维染色程序得到了明显改善。对比图4-6可知，组织经高压修复后，先进行弹力纤维染色，再进行免疫组化红染色；或是先进行免疫组化红染色，再进行弹力纤维染色。对比图7-8可知，组织经高压修复后，使用相同的方法，在肠组织上进行弹力纤维染色联合免疫组化CK20红染色，在乳腺组织上进行弹力纤维染色联合免疫组化Her2红染色也同样得到非常好的染色效果。两种方法进行的免疫组化红染色和弹力纤维染色均能得到非常好的染色效果。两种方案都可以将免疫组化红染和弹性纤维特殊染色有结合在一张玻片上，实现病理组织样本的多指标检测。