一种基于移动交换界面的可视化检测物质浓度的方法

技术领域

本发明涉及分析化学、纳米科学和生物技术等领域，具体涉及一种基于移动交换界面的可视化检测物质浓度的方法。

背景技术

移动界面理论经过多年的理论与应用研究，已被证明具有检测微量物质的潜力，相关工作已申请了移动界面检测方面的专利(用于测定酸碱浓度的电迁移酸碱滴定装置,中国,2010-12-18,ZL201010596012.7；一种用于测定蛋白质总浓度的可视化生物传感器装置,中国,2012-05-09,ZL201210142985.2；基于移动反应界面电泳的高通量蛋白质滴定方法,中国,2013-03-20,ZL201310089084.6；防渗漏电泳滴定电极液流动排气装置及其使用方法,中国,2014-09-18,ZL201410478864.4等)。

此外，为了进一步减少检测样品消耗、缩短检测时间发展了蛋白电泳芯片滴定技术(H.Y.Wang,Y.T.Shi,J.Yan,J.Y.Dong,S.Li,H.Xiao,H.Y.Xie,L.Y.Fan,C.X.Cao,Anal.Chem.,2014,86,2888-2894；L.X.Zhang,Y.R.Cao,H.Xiao,X.P.Liu,S.R.Liu,Q.H.Meng,L.Y.Fan,C.X.Cao,Biosens.Bioelectron.,2016,77,284-291)，并申请了芯片电泳滴定相关专利(一种定性、定量一体化检测乳品掺次的方法,中国,2015-08-28,ZL201510542254.0；定量分析乳品中掺次程度的电泳滴定方法,中国,2015-03-27,ZL201510140100.9)。为进一步探索QDs可视化的应用，开拓电泳滴定技术在纳米颗粒(NPs)表面配体含量测定方面的应用，发展了移动中和界面电泳技术检测量子点表面配体含量的技术，并申请了相关专利(一种快速检测纳米颗粒表面配体含量的方法,中国,2019-04-30,ZL201910363510.8)。

虽然移动反应界面在蛋白、核酸含量检测等方面已经有一定的应用，并可成功地测定量子点表面的配体含量，但是对于物质表面配体交换形成的移动界面仍未展开深入研究，尤其是基于电泳技术的配体交换反应检测待测物浓度的研究和应用相对缺乏。

发明内容

本发明提供了一种基于移动交换界面的可视化检测物质浓度的方法，能够快速、便捷、精确的确定检测物质浓度。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种基于移动交换界面的可视化检测物质浓度的方法，包括以下步骤：

(1)在电泳通道内，给定浓度的待测物与固相物质表面配体交换反应形成可视化移动交换界面，根据移动交换界面参数与待测物的浓度的关系，建立标准曲线；

(2)在相同条件下，对未知浓度的物质进行电泳，记录移动交换界面参数，代入步骤(1)建立的标准曲线，获得该物质浓度和表面密度信息。

进一步地，所述的固相物质可以是但不限于纳米颗粒、微小颗粒、细胞、病毒、功能化凝胶。

进一步地，所述固相物质表面配体可以是单一配体也可以是多种配体的集合，待测物能够置换固相物质表面配体，配体在固相物质表面发生置换反应形成光学信号。

进一步地，预先将固相物质固定在电泳通道内，通过电泳方式驱动待测物在电泳通道内移动并置换固相物质表面的配体，形成移动交换界面。

进一步地，所述固相物质固定在电泳通道内的方式为采用凝胶或自填充方式固定。

具体方法为：

步骤一，配置混有配体包裹的固相物质的溶液，与凝胶溶液混合后转移至电泳通道，或者自填充方式填充到电泳通道；

步骤二，将配置好的凝胶分别注入至毛细管标记的位置，静置待凝胶聚合，或自填充后静置至平衡状态；

步骤三，在电泳管样品区中填充待测物，缓冲区填充缓冲液，电泳通道两边的电极液池内加入等量的电极缓冲液，将阴、阳极液池内的电极分别与电源连接，并进行电泳；

步骤四，在电场作用下，待测物迁移进入凝胶区域，待测物与固相物质表面配体发生置换反应而形成移动交换界面，电泳进行一段时间后，关闭电源停止电泳；

步骤五，电泳时用设备记录电泳的界面迁移过程，得到界面距离。

所述毛细管规格为长10-100mm，内径75-600μm。将毛细管电泳微装置置于光学设备种，施加电场后，通过光学设备捕获释放出的荧光信号，记录整个迁移过程，最后通过数据处理即可得到界面平均迁移距离(速率、宽度)。

所述光学设备包括但不限于：CCD，智能手机。所述的界面迁移需根据界面信号通过数据处理确定界面位置，进而计算出样品中待测物的界面平均迁移距离(速率、宽度)等参数。

进一步地，电泳所施加的电压为10-50V或60-120V，电泳总时间小于10min。

进一步地，采用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，质量体积浓度为15-45％，交联度为2-6％，其背景电解质溶液为tris-HCl缓冲液，pH 4-10；检测中采用荧光物质作为指示剂，在电泳滴定过程中产生荧光信号猝灭或恢复。

进一步地，电泳开始后，移动交换界面的距离通过给定时间记录起点和终点得到，当界面完整出现记为移动交换界面的起点，界面位置根据信号强度分布曲线求导后的极值点确定，计算出该界面迁移速率v

其中，f(c

与现有技术相比，本发明基于移动交换界面的可视化检测技术检测物质浓度的方法具有检测消耗少、成本低、操作简便、样品前处理简单、可模块化和自动化等特点，不需要依赖昂贵的仪器就能实现对待测物浓度的定量分析，尤其，本发明检测速度快，整个检测过程可在10分钟内完成。

附图说明

图1为MEB实验的原理图，分为MEB-A(移动交换A界面)和MEB-B(移动交换B界面)；

图2为移动交换界面——猝灭界面实验、理论计算和数值计算结果比较；

图3为移动交换界面——恢复界面实验、理论计算和数值计算结果比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种基于移动交换界面的可视化检测物质浓度的方法，在电泳通道内给定浓度的待测物与固相物质(包括不限于NPs、微小颗粒、细胞和病毒)表面配体的交换反应形成可视化移动交换界面；根据界面距离(速度、宽度等)与待测物的浓度的关系，建立标准曲线；然后在相同条件下对未知浓度的物质进行电泳，根据记录的移动交换界面距离(或速率、宽度等参数)代入标准曲线即获得该物质浓度和表面密度信息，从而完成对相应检测物的可视化检测。

所述的应用检测反应包括但不限于：待测物A与固相物质表面配体B的反应，已知物质A浓度与固相物质表面待测配体B的含量，及其他的知其中一方浓度的交换反应。

可检测目标物质包括但不限于：与配体B发生特异性反应的待测物质A，未知浓度的配体B，以及配体置换反应的反应速率等。

具有方法为：

i)含有配体B的固相物质与聚丙烯酰胺凝胶母液均匀混合后注入毛细管中，然后等待其凝固，将毛细管置于毛细管电泳微装置中，在阴极端上样(待测物)。

所述的i)检测中采用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，质量体积浓度为15-45％，交联度为2-6％，其背景电解质溶液为tris-HCl(pH 4-10)缓冲液。

所述的i)检测中采用荧光物质作为指示剂，在电泳滴定过程中产生荧光信号猝灭或恢复。

所述的i)检测中在阴极端上样，可以是在电泳管内上样，也可以是在阴极液池直接上样。

ii)将毛细管电泳微装置置于光学设备种，施加电场后，通过光学设备捕获释放出的荧光信号，记录整个迁移过程，最后通过数据处理即可得到界面平均迁移距离(速率、宽度)。

所述的ii)电压采用但不限于10-50V用于形成猝灭界面(或60-120V用于形成恢复界面)。

所述的ii)光学设备包括但不限于：CCD，智能手机。

所述的ii)界面迁移需根据界面信号通过数据处理确定界面位置，进而计算出样品中待测物的界面平均迁移距离(速率、宽度)等参数。

以下结合具体实施例对本发明作详细说明。

以5,5’-二硫代双-2-硝基-苯甲酸(DTNB)，即Ellman试剂，三巯基丙酸(MPA)为反应物质，量子点(QDs)为信号转化物质(指示剂)，本实施例在以下发明技术方案的前提下进行，并给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

1、溶液配置：

移动交换界面(MEB)中的猝灭界面以DTNB置换QDs表面配体MPA猝灭QDs荧光为例，恢复界面以MPA置换QDs表面配体TNB恢复QDs荧光为例。

背景和电极缓冲溶液：背景和电极缓冲溶液均采用tris-HCl作为缓冲溶液。不高于100mM的Tris溶液用0.01-1M的盐酸分别调节pH至4-10作为毛细管凝胶电泳的备用缓冲溶液。

凝胶母液：配置15-45％的丙烯酰胺母液，使用前用纯水稀释到所需浓度，摇匀保存在4℃冰箱中。

样品溶液：配置浓度为10-100μM的DTNB标准溶液用缓冲溶液稀释,同理，配置浓度为1-10000μM的MPA标准溶液，并用缓冲溶液稀释。

QDs水凝胶的制备：将QDs加入背景缓冲液Tris-HCl(pH 4-10)中均匀分布，然后与凝胶母液混合。随后，将APS和TEMED掺入均匀的混合物中。最后，将混合物转移到毛细管内指定区域，并保存用于之后的实验。

2、检测过程：

移动交换界面(MEB)检测在给定毛细管标记区域进行。荧光量子点颗粒(即[MPA-QDs])在给定激发光下可发出荧光。

制备好[MPA-QDs]后，在样品区填充DTNB溶液，并保持背景缓冲液在各处的浓度和pH保持一致。然后，在电场驱动下，样品区中的DTNB进入凝胶区域(即检测区域)，与[MPA-QDs](有荧光)上的MPA-交换反应形成了[TNB-QDs](无荧光)，从而形成了MEB-Q界面。同时，猝灭界面的迁移被设备记录。

之后，用背景缓冲液对毛细管系统清洗，用MPA溶液填充样品区，并保持背景缓冲液在各处的浓度和pH保持一致。然后，在电场驱动下，样品区中MPA进入凝胶区域(即检测区域)，与[TNB-QDs](无荧光)上的TNB-发生配体竞争、置换后得到[MPA-QDs](有荧光)，从而形成了MEB-R界面。同样，该恢复界面的迁移也被光学设备记录。

最后，在数据处理阶段，采用自编程序对记录的视频进行处理，得到移动交换界面的界面距离(速度、宽度)等信息(图2A、B和图3A、B)，将待测物的界面相关数据代入根据标准溶液测量得到的标准曲线(图2C、D和图3C、D)即可得出相应的待测物浓度。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。