用于治疗癌症的细胞毒素剂

本申请是申请号为201480032023.9、申请日为2014年6月4日、发明名称为“用于治疗癌症的细胞毒素剂”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及治疗脑癌的方法。

背景技术

蒽环霉素是一类源自某些类型链霉菌属细菌的抗生素。蒽环霉素通常用作癌症治疗剂和部分充当核酸嵌入剂和DNA修复酶拓扑异构酶II的抑制剂，由此损伤癌细胞中的核酸，防止细胞复制。蒽环霉素癌症治疗剂的一个实例是多柔比星，其用于治疗多种癌症包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、淋巴瘤和白血病。合成多柔比星的6-马来酰亚胺己酰基腙(DOXO-EMCH，也称为aldoxorubicin或INNO-206)以提供可用于制备多柔比星和针对肿瘤抗原的单克隆抗体的免疫缀合物的酸敏感的连接基(Willner等，Bioconjugate Chem 4:521-527(1993))。在该背景下，将抗体二硫键用二硫苏糖醇还原以形成游离巯基，所述游离巯基进而与DOXO-EMCH的马来酰亚胺基反应而形成稳定硫醚键。当施用时，多柔比星抗体缀合物靶向含有被抗体识别的抗原的肿瘤。抗原-抗体结合之后，缀合物在肿瘤细胞内内化且转运至溶酶体。在酸性溶酶体环境中，多柔比星通过酸敏感腙连接基的水解在细胞内从缀合物释放。释放后，多柔比星到达细胞核且能够杀死肿瘤细胞。对于多柔比星和DOXO-EMCH的额外描述，参见例如美国专利7,387,771和7,902,144和美国专利申请号12/619,161，其各自以其整体通过引用并入本文。

进一步，DOXO-EMCH已在体外与人血清白蛋白(HSA)缀合以形成稳定的硫醚缀合物(Kratz等，J Med Chem 45:5523-5533(2002))。

脑肿瘤，尤其包括恶性神经胶质瘤，是最侵袭性的人类癌症且很少可治愈(DeAngelis等，N.Engl.J.Med.2001,344,114-123；Nelson等，J.Neurooncol.1985,3,99-103；Kornblith等，J.Neurosurg.1988,68,1-17)。诊断后的中值存活期为约12-14个月。化学治疗药物(诸如亚硝基脲、铂化合物和替莫唑胺)治疗仅稍微增加患者的存活时间(Huncharek等，Anticancer Res.1998,18,4693-4697；Brandes等，Anticancer RES.2000,20,1913-1920)。使脑癌的治疗复杂的进一步因素是许多药物无法穿过血脑屏障(BBB)。所述BBB由毛细血管周围的紧密连接组成且保护脑部以防止某些物质诸如离子的水平变化或防止感染。内皮细胞限制大分子诸如白蛋白的扩散，而允许较小分子诸如O

发明内容

本发明基于以下令人惊讶的观察结果：当静脉内施用时，治疗有效物质(例如DOXO-EMCH)诱导肿瘤消退和显著增加患有脑肿瘤诸如例如多形性胶质母细胞瘤的的哺乳动物的存活。

本发明涉及用于治疗脑癌的方法，其包括向患者施用治疗有效物质，其中所述治疗有效物质包含：

或其药学上可接受的盐

其中X是可在患者体内以pH依赖性方式水解裂解或酶促裂解的键。

在一些实施方案中，部分X在患者体内裂解，由此释放细胞毒素剂。在一些实施方案中，所述细胞毒素剂为蒽环霉素。在一些实施方案中，所述蒽环霉素选自：多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、洋红霉素、米托蒽醌和阿美蒽醌，或上述任一种的衍生物，或上述任一种的药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述蒽环霉素是多柔比星或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述共价蛋白结合基团选自：马来酰亚胺、卤代乙酰胺、卤代乙酸酯、吡啶基硫基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、二硫化物、乙烯基羰基、1-氮杂环丙烷和乙炔。在一些实施方案中，所述共价蛋白结合基团是马来酰亚胺。在一些实施方案中，所述连接基包含有机分子残基，其含有至少一个脂族碳链或具有1-12个碳原子的脂族碳环，所述1-12个碳原子中的一些可被杂原子或芳族部分替换。在一些实施方案中，所述连接基包含至少一个具有1-12个碳原子的碳链。在一些实施方案中，所述细胞毒素剂和连接基通过腙部分连接。在一些实施方案中，所述治疗有效物质具有以下结构：

在一些实施方案中，所述脑癌是原发性脑癌。在一些实施方案中，所述原发性脑癌是神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、颅咽管瘤、生殖细胞瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述原发性脑癌是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述脑癌是继发性或转移性癌症。在一些实施方案中，所述继发性或转移性癌症选自膀胱癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺管腺癌、肾上腺皮质癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、卡波西氏肉瘤、尤因氏肉瘤、软组织肉瘤、肾母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、骨癌、软骨肉瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌和胃癌。在一些实施方案中，所述癌症是替莫唑胺耐药性癌症。在一些实施方案中，所述替莫唑胺耐药性癌症是替莫唑胺耐药性多形性胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，所述治疗有效物质与所述抗癌剂组合施用。在一些实施方案中，所述抗癌剂选自多柔比星、顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、替莫唑胺、亚硝基脲、硼替佐米、吉西他滨、依托泊苷、托泊替康或其药学上可接受的盐。

施用后，治疗有效物质借助蛋白结合分子共价结合至体液成分或组织成分，由此生成细胞毒素剂的转运形式，该转运形式可在体内以pH依赖性方式水解裂解或酶促裂解而释放细胞毒素剂。由于其蛋白结合特性，所以可注射药物制剂由决定性改变和改善细胞毒素剂的药代动力学性质的治疗有效物质获得。当本发明的治疗有效物质与体液相互作用时，其共价结合至体液或组织成分，优选结合至血清蛋白，更优选结合至血清白蛋白，以便产生将细胞毒素剂转运至目标位点和/或以计量形式释放细胞毒素剂的大分子前药。

在一些实施方案中，所述脑癌是原发性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述原发性脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤。在其它实施方案中，脑癌是转移性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述转移性肿瘤选自包括，但不限于以下的癌症：乳腺癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺管腺癌、肾上腺皮质癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、卡波西氏肉瘤、尤因氏肉瘤、软组织肉瘤、肾生殖细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、骨癌、软骨肉瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌和胃癌。在一些实施方案中，所述肿瘤是替莫唑胺耐药性肿瘤。在一些实施方案中，所述替莫唑胺耐药性肿瘤是替莫唑胺耐药性多形性胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，所述治疗有效物质用于制备用于治疗脑癌诸如例如多形性胶质母细胞瘤的药物。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患者中的脑癌的治疗有效物质。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患者中的多形性胶质母细胞瘤的治疗有效物质。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患者中的脑癌的治疗有效物质。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患者中的脑癌的治疗有效物质。

附图说明

图1显示在鼠模型中aldoxorubicin降低多形性胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤负荷。在第0天，雌性Balb/c(nu/nu)小鼠颅内植入5x10

图2显示对照组(C)和多柔比星处理组(D)和aldoxorubicin处理组(A)中的小鼠的散布图，其显示获得自图1中所示图像的表示为辐照函数(光子数/sec/cm

图3显示具有GBM的小鼠的根据研究天数的Kaplan-Meier存活曲线。接受aldoxorubicin处理的小鼠(n＝8；实线(d))比接受媒介物(标记(c)的虚线)或多柔比星(标记(d)的虚线)的小鼠存活更长时间(p≤.0001)。媒介物处理和多柔比星处理的小鼠之间的存活曲线不存在差异(p＝0.949)。如本文所述，静脉内施用aldoxorubicin，总共注射六次(即，细胞植入后12、19、26、42、50和56天)。所有剂量均为32mg/kg/注射的最大耐受剂量(MTD)的～75％，除了细胞植入50天后给予的剂量是MTD的50％。以8mg/kg/注射的MTD的～75％施用多柔比星，总共注射两次(即，在细胞植入后12和19天)。

图4显示在向具有颅内GBM肿瘤的小鼠静脉内施用24mg/kg剂量(最大耐受剂量的75％)后，各种组织中的aldoxorubicin的浓度-时间曲线。线条表示获得自在各时间点取样的三个小鼠的平均数据(ng的aldoxorubicin/ml血浆或组织提取物)。条指示±标准偏差。脑中的aldoxorubicin浓度表示获得自具有肿瘤的小鼠的总脑组织的值。

图5显示颅内植入小鼠中的GBM肿瘤中的荧光素酶表达量。含有荧光素酶基因的植入的人GBM肿瘤细胞被允许在小鼠大脑中生长9天，然后用缓冲液对照(C)或aldoxorubicin(T)处理。在第9、16和23天，向小鼠施用缓冲液(C)或aldoxorubicin。通过在第7、21、29和33天检测扫描之前施用于小鼠的荧光素酶底物的生物发光来监测肿瘤生长。根据右侧色度方案显示肿瘤细胞中荧光素酶表达的强度，其中变暗区域表明最大表达(最多肿瘤细胞)且黑色表明没有表达(无肿瘤细胞)。

在7天时，在对照(C)和aldoxorubicin处理(T)的动物中均看到荧光素酶的肿瘤细胞表达。在21天时，所有对照小鼠均具有正在生长的肿瘤，而仅1个aldoxorubicin处理的小鼠具有可检测的肿瘤。在第29天，所有C小鼠都已死亡，而仅1个aldoxorubicin处理的小鼠死亡且在2个小鼠中观察到肿瘤再生长。在第33天，3个T小鼠已死亡且在4个其它小鼠中肿瘤的再生长。

图6显示对照(C)和aldoxorubicin处理组(T)中的小鼠的散布图，其显示获得自图5中所示图像的表示为辐照函数(光子数/sec/cm

图7显示具有GBM的小鼠的根据研究天数的Kaplan-Meier存活曲线。接受aldoxorubicin的小鼠(n＝8；虚线)比接受媒介物的那些(n＝8：实线)存活更长(p＝0.0006)。

图8显示肿瘤组织中的aldoxorubicin保留是周围脑组织中的3至4倍。小鼠的肿瘤和周围脑组织中的aldoxorubicin保留在向具有颅内GBM肿瘤的小鼠静脉内施用24mg/kg剂量(最大耐受剂量的75％)后通过HPLC测量。

图9显示对aldoxorubicin(ALDOX)处理相对于对照(NT)在增殖(Ki-67)、瘤内脉管(CD31)、中间丝蛋白表达(波形蛋白)和细胞凋亡效应物(切割的胱天蛋白酶-3)的活化的免疫组织化学评估的图示。

图10显示aldoxorubicin而非多柔比星在无胸腺裸小鼠中的颅内人神经胶质母细胞瘤肿瘤中的选择性累积。具有肿瘤的小鼠如实施例1所述接受aldoxorubicin和多柔比星的静脉内注射。在最后注射后24小时对小鼠进行安乐死。收获脑部且使用装有针对明场和落射荧光的多柔比星特异性波长的立体显微镜进行成像以显现药物累积。

图11显示如具有肿瘤的小鼠的脑组织冷冻切片中看到的aldoxorubicin而非多柔比星的选择性累积。还显示CD31(微血管密度标志物)和波形蛋白(促侵袭性III型中间丝蛋白)的免疫组织化学染色。所有细胞核均用DAPI复染。

图12显示对照(control)、多柔比星(doxo)和aldoxorubicin(aldoxo)处理组中的小鼠的柱状图，其显示获得自图1中所示图像的表示为辐照(光子数/sec/cm

具体实施方式

除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有普通技术人员通常理解的含义。通常，本文中所述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白和核酸化学结合使用的命名法及其技术是本领域中众所周知且常用的命名法和技术。

本申请中提及的所有出版物、专利和公开的专利申请通过引用具体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括其具体定义)为准。除非另有指明，否则应理解本发明的各实施方案可单独使用或与本发明的任一个或多个其它实施方案组合使用。

在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括所述整体(或组成)或整体(或组成)的组，但不排除任何其它整体(或组成)或整体(或组成)的组。

除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”包括复数。

术语“包括(including)”用于意指“包括，但不限于”。“包括(including)”和“包括(including)，但不限于”可互换使用。

对于由术语“约”限定的数字，2％、5％或甚至10％的变化在限定数字的范围内。

术语“蒽环霉素”是指一类具有蒽二酮(也称为蒽醌或二氧代蒽)结构单元的抗肿瘤抗生素。例如，术语“蒽环霉素”特别意欲个别包括多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、洋红霉素、米托蒽醌和阿美蒽醌。

术语“患者”和“个体”可互换使用且是指人或非人的动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、灵长类动物、家畜动物(例如牛、猪)、伴侣动物(例如犬、猫)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。

术语“药学上可接受”意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒物质。载体的特征将取决于施用途径。

术语“药学上可接受的载体”是指可与本发明的治疗有效物质一起施用于患者且不破坏细胞毒素剂的药理学活性的无毒载体。术语“赋形剂”是指制剂或组合物中的不是药物活性成分的添加剂。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指有效治疗患者中的脑癌的量，例如实现患有疾病(例如癌症)的患者的总体健康的有利和/或所需变化的量。技术人员应认识到，治疗脑癌包括，但不限于杀死癌细胞、防止新癌细胞生长、引起肿瘤消退(肿瘤大小减小)、引起癌转移减少、改善患者生命机能、改善患者康乐、减少疼痛、改善食欲、改善患者体重和其任何组合。“药学有效量”或“治疗有效量”也指改善患者临床症状所需的量。本文所述的治疗方法或治疗脑癌的方法不应解释为或以其它方式限于“治愈”脑癌。

如本文所使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括以改善或稳定受试者病症的方式逆转、减少或停滞病症的症状、临床体征和潜在病理学。如本文所使用和如本领域中所充分理解，“治疗”是获得有利或期望结果(包括临床结果)的方法。有利或期望的临床结果可包括，但不限于缓解或改善一种或多种症状或病症，减轻疾病程度，稳定(即，不恶化)疾病状态，延迟或减缓疾病进展，改善或缓和疾病状态和缓解(部分或全部)，无论是可检测或不可检测的。“治疗”也可意指与不接受治疗的预期存活相比存活延长。

术语“被取代”是指具有替换化合物骨架的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。应理解，“取代(substitution)”或“被…取代(substituted with)”包括以下隐含条件：此类取代与被取代的原子和取代基的允许化学价一致，和取代产生稳定化合物，例如其不会自发地经历转换，诸如通过重排、环化、消除等。如本文所使用，术语“被取代”考虑包括有机化合物的所有可容许取代基。在一个广泛方面，所述可容许取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于适当有机化合物，所述可容许取代基可以是一个或多个和相同或不同的。出于本发明的目的，杂原子诸如氮可具有氢取代基和/或满足杂原子化学价的本文所述有机化合物的任何可容许取代基。取代基可包括本文所述的任何取代基，例如卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、酰氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。

治疗有效物质

可用于本发明的治疗有效物质包含结构：

或其药学上可接受的盐，

其中X是可在患者体内以pH依赖性方式水解裂解或酶促裂解的键。

在一些实施方案中，用于治疗有效物质中的细胞毒素剂是蒽环霉素。蒽环霉素包括，但不限于多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、洋红霉素、米托蒽醌和阿美蒽醌或其衍生物。在一些实施方案中，所述蒽环霉素是多柔比星或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，可裂解部分("X")是酸可裂解部分。酸可裂解部分包括，但不限于缩醛、缩酮、亚胺、腙、羧基腙或磺酰基腙，或顺乌头基(cis-aconityl)部分或含有被取代或未被取代的三苯甲基的部分。在某些实施方案中，所述酸可裂解部分是腙部分。在一些实施方案中，当部分X在患者体内裂解时释放细胞毒素剂。

在一些实施方案中，可裂解部分("X")是酶可裂解的。酶可裂解部分包括，但不限于包含一个或多个氨基甲酸酯键的肽。肽部分可包含例如1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、2-5、2-10、2-15、2-20、2-25、2-30、2-35、或2-40个氨基酸残基。肽部分包括，但不限于包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基的部分。肽部分可被设计为可被一种或多种蛋白酶特异性裂解。在一些实施方案中，所裂解键是肽键、酰亚胺键或肼部分的羧基-腙键。

在一些实施方案中，所述连接基是有机分子。此类连接基可包含至少一个具有1-12个碳原子的脂族碳链和/或脂族碳环，其中任一碳原子均可被-OH或＝O取代，且其中当适当和化学上可行时，任一碳原子均可被杂原子或芳族部分替换。在一些实施方案中，所述杂原子是氧。在一些实施方案中，所述脂族连接基可包含含有1-12个碳原子的烷基链、含有2-12个碳原子的烯基链或含有2-12个碳原子的炔基链，其中任一碳原子均可被-OH或＝O取代，其中当适当和化学上可行时，任一碳原子均可被氧原子替换。在特定实施方案中，所述脂族连接基是包含1-12个碳原子的烷基链，其中当适当和化学上可行时，任一碳原子均可被＝O取代。在其它实施方案中，所述脂族连接基是包含3-9、4-8或5-7个碳原子的烷基链，其中当适当和化学上可行时，任一碳原子均可被＝O取代。在一个特定实施方案中，所述脂族连接基是包含6个碳原子的烷基链，其中连接至可裂解部分"X"的碳原子被＝O取代。

所述共价蛋白结合基团包括，但不限于马来酰亚胺基、卤代乙酰胺基、卤代乙酸酯基、吡啶基二硫基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基和异硫氰酸酯基。在某些实施方案中，所述共价蛋白结合基团是马来酰亚胺基。共价蛋白结合基团还包括二硫化物基、乙烯基羰基、1-氮杂环丙烷基或乙炔基。二硫化物基可通过作为可交换基团的硫代硝基苯甲酸(例如5'-硫基-2-硝基苯甲酸)活化。马来酰亚胺基、吡啶基二硫基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基适当时可被烷基取代或被以上水溶性基团取代。通常，蛋白结合基团具有蛋白结合特性，即其在生理环境中共价(“共价蛋白结合基团”)或非共价(“非共价蛋白结合基团”)结合至蛋白表面上的特定氨基酸。马来酰亚胺基、卤代乙酰胺基、卤代乙酸酯基、吡啶基二硫基、二硫化物基团、乙烯基羰基、1-氮杂环丙烷基和/或乙炔基优选与蛋白表面上的半胱氨酸的巯基(-SH)反应，而N-羟基琥珀酰亚胺酯基和/或异硫氰酸酯基优选与蛋白表面上的赖氨酸的氨基(-NH)反应。例如，所述共价蛋白结合基团(诸如马来酰亚胺基)可结合至白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白未被修饰(例如其未被修饰而未带正电或负电)。

用于本发明中的治疗有效物质包括一种或多种蒽环霉素、可裂解部分、连接基和共价蛋白结合基团的任何和所有组合。所述治疗有效物质可包含蒽环霉素、酸可裂解部分、烷基连接基和共价蛋白结合基团。在某些实施方案中，所述治疗有效物质包含蒽环霉素、作为酸可裂解部分的腙、烷基连接基和作为共价蛋白结合基团的马来酰亚胺基。在其它实施方案中，所述治疗有效物质包含蒽环霉素、作为酸可裂解部分的腙部分、6-碳烷基连接基(其中连接至可裂解部分的碳原子被＝O取代)和作为共价蛋白结合基团的马来酰亚胺基(即，蒽环霉素-EMCH分子)。

本发明中使用的示例性化合物是DOXO-EMCH。单独或与任何其它术语组合的术语“DOXO-EMCH”是指如由以下结构描述的化合物：

DOXO-EMCH也称为(E)-N’-(1-((2S,4S)-4-(4-氨基-5-羟基-6-甲基-四氢-2H-吡喃-2-基氧基-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-6,11-二氧代1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-基)-2-羟基亚乙基)-6-(2,5-二氧代-2H-吡咯-1(5H)基)己烷酰肼·HCl。

在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患者中的脑癌的药物组合物，其包含治疗有效物质，其中所述治疗有效物质包含：

或其药学上可接受的盐

其中X是可在患者体内以pH依赖性方式水解裂解或酶促裂解的部分。

如本文所述，本发明的各种方法或用途包括向患者施用治疗有效物质或其药学上可接受的盐或酯形式以治疗脑癌。在一些实施方案中，所述治疗有效物质可单独施用。在一些实施方案中，所述治疗有效物质可与抗癌剂组合施用。在一些实施方案中，所述治疗有效物质可与其它药物组合施用，所述其它药物诸如蒽环霉素、含铂抗癌化合物、紫杉烷、烷基化剂、蛋白酶体抑制剂、核苷类似物、拓扑异构酶抑制剂、用于治疗免疫介导的脑病症的免疫抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗有效物质可与其它药物组合施用，所述其它药物诸如多柔比星、顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、替莫唑胺、亚硝基脲、硼替佐米、吉西他滨、依托泊苷、托泊替康或其药学上可接受的盐。

待向患者施用的组合物中的治疗有效物质(例如DOXO-EMCH)的总量是适用于患者的量。本领域技术人员将理解，不同个体可能需要不同总量的治疗有效物质。在一些实施方案中，治疗有效物质的量是药学有效量。技术人员将能够基于因素诸如例如患者的年龄、体重和身体状况确定治疗患者所需组合物中的治疗有效物质的量。治疗有效物质(例如DOXO-EMCH)的浓度取决于其在静脉内施用溶液中的溶解度和可施用液体的体积。例如，治疗有效物质在可注射组合物中的浓度可以是约0.1mg/ml至约50mg/ml。在一些实施方案中，所述治疗有效物质的浓度可以是约0.1mg/ml至约25mg/ml、约7mg/ml至约17mg/ml、约0.1mg/ml至5mg/ml或约0.25mg/ml至约4.5mg/ml。在特定实施方案中，所述治疗有效物质的浓度可以是约0.1mg/ml、约0.2mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml、约2.0mg/ml、约2.1mg/ml、约2.2mg/ml、约2.3mg/ml、约2.4mg/ml、约2.5mg/ml、约2.6mg/ml、约2.7mg/ml、约2.8mg/ml、约2.9mg/ml、约3.0mg/ml、约3.1mg/ml、约3.2mg/ml、约3.3mg/ml、约3.4mg/ml、约3.5mg/ml、约3.6mg/ml、约3.7mg/ml、约3.8mg/ml、约3.9mg/ml、约4.0mg/ml、约4.1mg/ml、约4.2mg/ml、约4.3mg/ml、约4.4mg/ml、约4.5mg/ml、约4.6mg/ml、约4.7mg/ml、约4.8mg/ml、约4.9mg/ml、约5.0mg/ml、约5.1mg/ml、约5.2mg/ml、约5.3mg/ml、约5.4mg/ml、约5.5mg/ml、约5.6mg/ml、约5.7mg/ml、约5.8mg/ml、约5.9mg/ml或约6.0mg/ml。在一些实施方案中，所述治疗有效物质的浓度可以是约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml或约30mg/ml。

本发明的药物组合物和药剂盒也可含有稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域中众所周知的其它物质。

所述组合物可以多种常规方式施用。可使用的示例性施用途径包括口服、肠胃外、静脉内、动脉内、皮肤、皮下、肌肉内、局部、颅内、眶内、经眼、玻璃体内、心室内、囊内、脊椎内、脑池内、腹膜内、鼻内、气溶胶、中枢神经系统(CNS)施用或通过栓剂施用。在一些实施方案中，所述组合物适用于肠胃外施用。这些组合物可例如腹膜内、静脉内或鞘内施用。在一些实施方案中，所述组合物静脉内注射。在一些实施方案中，重构制剂可通过使冻干蒽环霉素化合物组合物在包含乙醇和水的重构液体中重构来制备。此类重构可包括添加重构液体和例如通过旋转或涡旋混合物混合。然后可通过混合(例如使乳酸化林格氏溶液(Ringer'ssolution)与制剂混合)以生成可注射组合物来使重构制剂适用于注射。本领域技术人员将理解施用治疗有效物质制剂或组合物的方法将取决于因素诸如所治疗患者的年龄、体重和身体状况和所治疗疾病或病症。因此，技术人员将能够基于个例选择对于患者最佳的施用方法。

在一些实施方案中，所述治疗有效物质的组合物可用于制备用于治疗脑癌的药物。

在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的治疗有效物质和药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂的药剂盒。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括一种或多种赋形剂。本领域技术人员将理解任何一种赋形剂的选择可影响任何其它赋形剂的选择。例如，因为赋形剂的组合将产生不良效应，所以特定赋形剂的选择可排除使用一种或多种额外赋形剂。本领域技术人员将能够凭经验决定哪些赋形剂(如果存在)包括在组合物中。赋形剂可包括，但不限于共溶剂、增溶剂、缓冲剂、pH调节剂、填充剂、表面活性剂、囊封剂、张力调节剂、稳定剂、保护剂和粘度调节剂。在一些实施方案中，所述组合物中包括药学上可接受的载体可以是有益的。

在一些实施方案中，所述组合物可包括增溶剂。增溶剂可用于增加组合物的任一组分(包括治疗有效物质(例如DOXO-EMCH)或赋形剂)的溶解度。本文所述的增溶剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性增溶剂提供。在某些实施方案中，增溶剂包括，但不限于乙醇、叔丁醇、聚乙二醇、甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和其任何药学上可接受的盐和/或组合。

所述组合物的pH可以是提供制剂或组合物的所需特性的任何pH。所需特性可包括例如治疗有效物质(例如DOXO-EMCH)稳定性、治疗有效物质与其它pH的所述组合物相比的保留增加，和改善的过滤效率。在一些实施方案中，所述组合物的pH可以是约3.0至约9.0，例如约5.0至约7.0。在特定实施方案中，所述组合物的pH可以是5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1、5.9±0.1、6.0±0.1、6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1或6.5±0.1。

在一些实施方案中，通过在所述组合物中包括一种或多种缓冲剂缓冲pH可以是有益的。在某些实施方案中，缓冲剂可具有例如约5.5、约6.0或约6.5的pKa。本领域技术人员会理解可基于缓冲剂pKa和其它特性选择适当缓冲剂用于包括在组合物中。缓冲剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的缓冲剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于本发明的制剂或组合物中的示例性缓冲剂提供。在某些实施方案中，缓冲剂包括，但不限于Tris、Tris HCl、磷酸钾、磷酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、磷酸钠和磷酸钾的组合、Tris/TrisHCl、碳酸氢钠、精氨酸磷酸盐、精氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、二甲基胂酸盐、琥珀酸盐、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、马来酸盐、bis-tris、磷酸盐、碳酸盐和其任何药学上可接受的盐和/或组合。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括pH调节剂。调节组合物的pH可对例如治疗有效物质的稳定性或溶解度具有有利效应或可用于制备适于肠胃外施用的组合物。pH调节剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的pH调节剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性pH调节剂提供。pH调节剂可包括例如酸和碱。在一些实施方案中，pH调节剂包括，但不限于乙酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠和其组合。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括填充剂。填充剂常用于冻干组合物中以向组合物提供增加的体积且有助于显现组合物，尤其在冻干颗粒以其它方式将难以看见的情况下。填充剂也可帮助防止药物由于药物组合物的活性组分喷出而损失和/或有助于对组合物进行冷冻保护。填充剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的填充剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性填充剂提供。

示例性填充剂可包括碳水化合物、单糖、二糖、多糖、糖醇、氨基酸和糖酸和其组合。碳水化合物填充剂包括，但不限于单碳水化合物、二碳水化合物或多碳水化合物、淀粉、醛糖、酮糖、氨基糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、甲基a-D-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖胺、半乳糖胺、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、菊糖、左聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜胶、半乳卡罗聚糖、果胶、直链淀粉、支链淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、石耳素、几丁质、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、黄嘌呤胶、蔗糖、海藻糖、葡聚糖和乳糖。糖醇填充剂包括，但不限于醛糖醇、肌醇、山梨糖醇和甘露糖醇。氨基酸填充剂包括，但不限于甘氨酸、组氨酸和脯氨酸。糖酸填充剂包括，但不限于醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、葡萄糖酸、异抗坏血酸、抗坏血酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、神经氨酸、果胶酸和海藻酸。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括表面活性剂。通常，表面活性剂降低液体组合物的表面张力。这可提供有利特性，诸如提高的过滤的容易性。表面活性剂也可充当乳化剂和/或增溶剂。表面活性剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的表面活性剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于本发明的制剂或组合物中的示例性表面活性剂提供。可包括的表面活性剂包括，但不限于脱水山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、脂多糖、聚乙二醇(例如PEG 400和PEG 3000)、泊洛沙姆(即，普洛尼克)、环氧乙烷和聚环氧乙烷(例如Triton X-100)，皂苷、磷脂(例如卵磷脂)和其组合。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括囊封剂。囊封剂可隔离分子和帮助使其稳定或溶解。囊封剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的囊封剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性囊封剂提供。可包括在组合物中的囊封剂包括，但不限于二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精和其组合。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括张力调节剂。当向患者施用(例如通过肠胃外施用)组合物时，液体组合物的张力是重要考虑因素。因此，可使用张力调节剂以帮助使组合物适于施用。张力调节剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的张力调节剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性张力调节剂提供。张力调节剂可以是离子型或非离子型的且包括，但不限于无机盐、氨基酸、碳水化合物、糖、糖醇和碳水化合物。示例性无机盐可包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾。示例性氨基酸是甘氨酸。示例性糖可包括糖醇，诸如甘油、丙二醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露糖醇。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括稳定剂。稳定剂帮助增加组合物中的治疗有效物质的稳定性。这可通过例如减少治疗有效物质的降解或防止其聚集来进行。不希望受理论束缚，增强稳定性的机制可包括从溶剂隔离治疗有效物质或抑制蒽环霉素化合物的自由基氧化。稳定剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的稳定剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性稳定剂提供。稳定剂可包括，但不限于乳化剂和表面活性剂。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括保护剂。保护剂是保护药物活性成分(例如治疗有效物质)免于不期望状况(例如由冷冻或冻干或氧化引起的不稳定性)的试剂。保护剂可包括例如冷冻保护剂、冻干保护剂和抗氧化剂。当组合物暴露于低于其凝固点的温度时，冷冻保护剂可用于防止活性药物成分(例如蒽环霉素化合物)的效力损失。例如，重构冻干制剂中可包括冷冻保护剂，使得制剂可在稀释用于静脉内(IV)施用之前进行冷冻。冷冻保护剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的冷冻保护剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性冷冻保护剂提供。冷冻保护剂包括，但不限于溶剂、表面活性剂、囊封剂、稳定剂、粘度调节剂和其组合。冷冻保护剂可包括例如二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)、多元醇(例如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇和卫矛醇)、二醇(例如乙二醇、聚乙二醇和丙二醇)。

冻干保护剂可用于稳定组合物的组分。例如，治疗有效物质可在重构之前用冻干保护剂冻干。冻干保护剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的冻干保护剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性冻干保护剂提供。冻干保护剂包括，但不限于溶剂、表面活性剂、囊封剂、稳定剂、粘度调节剂和其组合。示例性冻干保护剂可以是例如糖和多元醇。海藻糖、蔗糖、葡聚糖和羟丙基-β-环糊精是冻干保护剂的非限制性实例。

抗氧化剂可用于防止组合物的组分的氧化。氧化可导致药品聚集或对药品纯度或其效力的其它有害效应。抗氧化剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的抗氧化剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性抗氧化剂提供。抗氧化剂可以是例如抗坏血酸钠、柠檬酸盐、硫醇、偏亚硫酸氢盐和其组合。

在一些实施方案中，所述组合物中可包括粘度调节剂。粘度调节剂改变液体组合物的粘度。这可以是有益的，因为粘度在过滤液体组合物的容易性中发挥重要作用。组合物可在冻干和重构之前或在重构之后过滤。粘度调节剂是本领域中众所周知的。因此，本文所述的粘度调节剂并不意欲构成详尽列表，但仅作为可用于组合物中的示例性粘度调节剂提供。粘度调节剂包括溶剂、增溶剂、表面活性剂和囊封剂。可包括在所述组合物中的示例性粘度调节剂包括，但不限于N-乙酰基-DL-色氨酸和N-乙酰基-半胱氨酸。

本文提供的治疗方法可用于多种临床应用。蒽环霉素可用于治疗癌症。例如，多柔比星是嵌入剂以及拓扑异构酶II抑制剂，且优先杀死正在快速分裂的细胞，诸如肿瘤细胞。DOXO-EMCH是可用于治疗实体瘤以及血液恶性肿瘤的蒽环霉素化合物。DOXO-EMCH通过共价结合至白蛋白而起作用，其中白蛋白的半胱氨酸-34的游离巯基经由迈克尔加成结合DOXO-EMCH马来酰亚胺。据信，DOXO-EMCH-白蛋白缀合物然后在血流中循环直至到达肿瘤，其中肿瘤中较低的pH导致多柔比星和EMCH部分之间的腙键裂解，由此释放多柔比星。

在一个方面，本发明提供用于治疗脑癌的方法。在一些实施方案中，所述癌症是原发性脑癌。原发性脑癌的实例包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、颅咽管瘤、生殖细胞瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述原发性脑癌是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是转移性或继发性脑癌。转移性或继发性脑癌的实例包括实体瘤癌症、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺管腺癌、肾上腺皮质癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、卡波西氏肉瘤、尤因氏肉瘤、软组织肉瘤、肾生殖细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、骨癌、软骨肉瘤、肾癌、膀胱癌和胃癌。在一些实施方案中，所述转移性或继发性脑癌是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是替莫唑胺耐药性癌症。在一些实施方案中，所述替莫唑胺耐药性癌症是替莫唑胺耐药性多形性胶质母细胞瘤。

在另一个方面，本发明提供用于治疗原发性脑肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述原发性脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤。在其它实施方案中，所述脑癌是转移性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述转移性肿瘤选自包括，但不限于以下的癌症：乳腺癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺管腺癌、肾上腺皮质癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、卡波西氏肉瘤、尤因氏肉瘤、软组织肉瘤、肾生殖细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、骨癌、软骨肉瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌和胃癌。在一些实施方案中，所述肿瘤是替莫唑胺耐药性肿瘤。在一些实施方案中，所述替莫唑胺耐药性肿瘤是替莫唑胺耐药性多形性胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，所述方法包括施用单独或与抗癌剂组合的DOXO-EMCH(即，aldoxorubicin)用于治疗癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述方法包括施用单独或与抗癌剂组合的DOXO-EMCH(即，aldoxorubicin)用于治疗替莫唑胺耐药性肿瘤。在一些实施方案中，所述方法包括施用DOXO-EMCH(即，aldoxorubicin)用于治疗替莫唑胺耐药性肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述方法包括施用DOXO-EMCH(即，aldoxorubicin)用于治疗多形性胶质母细胞瘤。在其它实施方案中，所述方法包括施用DOXO-EMCH(即，aldoxorubicin)用于治疗替莫唑胺耐药性多形性胶质母细胞瘤。

普通技术人员可想到本文所述内容的变化、修改和其它实施，而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明不限于前述说明或以下实施例。

就现在一般描述的本发明方面而言，参考以下实施例将更容易理解这些，所述实施例仅为了说明本发明的某些特征和实施方案而包括且不意欲限制。

本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述的化合物、组合物和其使用方法的许多等效方案。此类等效方案被视为在本发明的范围内。

在神经胶质母细胞瘤的体内小鼠模型中比较多柔比星相对于aldoxorubicin的临床前功效。

将U87-luc神经胶质瘤细胞颅内植入小鼠中：U87MG亚系(具有荧光素酶报告基因的U87-luc)用于建立颅内人神经胶质母细胞瘤肿瘤。6-8周龄的雌性BALB/c(nu/nu)小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪混合溶液麻醉。将动物固定在Harvard Apparatus立体定位头架中，制备1cm中线头皮切口，且通过颅骨中的钻孔使用10μl Hamilton注射器将5μL无血清DMEM中的5x10

小鼠的aldoxorubicin处理：该研究由8个媒介物处理的对照小鼠(组C)、8个多柔比星处理的小鼠(组D)和8个aldoxorubicin处理的小鼠(组A)组成。处理在颅内植入多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞后十二天开始。静脉内施用媒介物(10mM磷酸钠，5％D-(+)-葡萄糖，pH 6.4)或aldoxorubicin，总共注射六次(即，在细胞植入后12、19、26、42、50和56天)。小鼠中的所有剂量均为32mg/kg/注射的最大耐受剂量(MTD)的～75％，除了细胞植入50天后给予的剂量为MTD的50％。用8mg/kg/注射的MTD的～75％静脉内施用多柔比星，总共注射两次(即，在细胞植入后12和19天)。药物和媒介物两者均使用0.15ml的注射体积施用。

颅内肿瘤的体内成像：颅内肿瘤生长使用体内成像系统(Xenogen,Palo Alto,CA)、通过生物发光成像进行定量。在成像之前10分钟，所有小鼠IP注射100μl悬浮于DPBS中的30mg/ml D-荧光素(PerkinElmer)以提供荧光素酶的底物。在成像前，小鼠用吸入异氟醚气体麻醉。对于涵盖小鼠头部的目的区域，图像使用Xenogen Ivis 200成像系统获得且用来自Xenogen的Living Image 4.1软件定量图像。图像强度表示为光子数/sec/cm

HPLC系统和条件：使用具有扫描荧光检测器的Agilent 1100系列HPLC系统(Wilmington,DE,USA)，激发和发射波长分别设定为480nm和560nm。Agilent Chemstation软件用于数据采集。分离在装有保护柱(BDS-Hypersil-C18,5μM)的Waters SpherisorbODS2柱(4mm x 250mm,5μm)上完成。洗脱用含有65％磷酸单钠(pH 2.2)和35％乙腈的流动相进行。将1.25ml/分钟的恒定流速用于分离。所述柱设定为28℃且注射体积为25μl。

多柔比星、aldoxorubicin和内部标准品柔红霉素分别表明4.06分钟、4.39分钟和6.52分钟的平均保留时间且在应用测定条件下充分分辨。在分析的器官样品中，aldoxorubicin以多柔比星的保留时间洗脱。在使用的色谱条件下未观察到干扰峰。

样品制备：在具有颅内GBM肿瘤的小鼠中通过尾静脉注射施用24mg/kg/注射(MTD的75％)的aldoxorubicin，且在注射后4、8、16和24小时之后，通过CO

冷冻样品在室温下解冻且使用PowerGen 125型匀浆机(Fisher Scientific)在无菌生理盐水中均质化以在肝和脑中获得150mg/ml的最终组织浓度(w/v)；对肺、心脏和肌肉，获得125mg/ml的最终组织浓度且对肾获得100mg/ml的最终组织浓度。向血浆或组织样品的20μl等分试样中添加高氯酸(35％，v/v)，随后添加25μl流动相。将样品涡旋，随后以10,000x g离心10分钟且将25μl上清液施加于HPLC柱。

统计学分析：使用时间等效检验、使用SAS Institute,Inc.,Cary,NC的统计学分析软件生成Kaplan-Meier存活曲线以比较对照小鼠和药物处理的小鼠的存活。各组之间的差异使用非配对的Student氏t检验评估。所有值都显示为平均值±标准偏差。p值≤0.05被视为统计显著的。

Aldoxorubicin而非多柔比星是小鼠中神经胶质肿瘤的有效抑制剂。图1和2显示在颅内植入肿瘤细胞8天后，对照组(组C)、多柔比星处理组(组D)和aldoxorubicin处理组(组A)之间不存在平均肿瘤大小的相对差异(p>0.05)。在22天内对照组中的3个动物和多柔比星组中的2个动物死亡且其它发展出大肿瘤。Aldoxorubicin处理2周显示肿瘤消退，导致平均肿瘤大小为对照组的28％和多柔比星处理组的40％(图2D)。另外，对照组和多柔比星处理组中的动物经历的存活与aldoxorubicin处理组中的动物相比短得多。对照组(组C)和多柔比星组(组D)中的所有动物在肿瘤植入后34天内死亡，但处理组(组A)中的动物仍活着。甚至在41天后，aldoxorubicin组中的八个动物中的七个仍活着。参见图1。

图3特征在于Kaplan-Meier存活曲线，其显示与媒介物处理组或多柔比星处理组相比，用aldoxorubicin处理的小鼠中的存活时间增加(p<.0001)。媒介物处理和多柔比星处理的小鼠之间不存在存活时间的差异(p＝0.949)。当终止研究时，检查存活动物，因为其尚未达到终点。

HPLC用于测定aldoxorubicin施用于颅内具有肿瘤的小鼠后的血浆和组织分布。浓度对时间曲线显示于图4中。静脉内施用aldoxorubicin(MTD的～75％)后，在血浆和除脑外的其它器官中，药物浓度在4小时后是最高的。血浆浓度是肝、心脏、肺和肾中的平均浓度的多于20倍，并且是脑中浓度的多于200倍。在血浆和除脑外的其它组织中，前药在20小时内几乎达到其浓度的50％。在脑中，水平从4小时至24小时几乎保持相同，表明脑中的高抗肿瘤活性可以与药物的长期存在相关。

这些结果表明，静脉内施用的aldoxorubicin、但非多柔比星诱导肿瘤消退且显著增加采用颅内植入人GBM肿瘤的体内异种移植模型中的存活。

雌性小鼠(6-8周龄)颅内植入具有荧光素酶报告基因的U87-luc亚系以建立人神经胶质母细胞肿瘤。肿瘤生长系使用D-荧光素底物、通过生物发光成像评估。将8个小鼠用aldoxorubicin处理且将8个小鼠经磷酸盐缓冲生理盐水(媒介物)处理。处理在植入GBM细胞后9天开始。Aldoxorubicin或媒介物静脉注射施用，一周一次，持续三周(细胞植入后9、16和23天)。Aldoxorubicin的前两次剂量是小鼠中的32mg/kg/注射的MTD的75％且第三次剂量是小鼠中的32mg/kg/注射的MTD的50％。结果显示于图5中。

这些结果表明，静脉内施用的aldoxorubicin诱导肿瘤消退且增加采用人GBM肿瘤的颅内植入的体内异种移植模型的存活。

HPLC系统和条件：使用的HPLC系统是配备有扫描荧光检测器的Agilent 1100系列(Wilmington,DE,USA)，激发和发射波长分别设定为480nm和560nm。Agilent Chemstation软件用于数据采集。分离在装有保护柱(BDS-Hypersil-C18,5μM)的Waters SpherisorbODS2柱(4mm x 250mm,5μm)上完成。洗脱用由65％50mM磷酸单钠(pH 2.2)和35％乙腈构成的流动相进行。1.25ml/分钟的恒定流速用于分离。所述柱设定为28℃且注射体积为25μl。

多柔比星、aldoxorubicin和内部标准品柔红霉素分别表明4.06分钟、4.39分钟和6.52分钟的平均保留时间且在应用测定条件下充分分辨。在分析的器官样品中，aldoxorubicin以多柔比星的保留时间洗脱。在使用的色谱条件下未观察到干扰峰。

样品制备：为了定量脑组织和脑肿瘤中的aldoxorubicin，小鼠通过吸入CO

冷冻样品在室温下解冻且使用PowerGen 125型匀浆机(Fisher Scientific)在无菌生理盐水中均质化以获得150mg/ml的最终组织浓度(w/v)。然后将高氯酸(35％，v/v)添加至20μl等分试样，随后添加25μl流动相。将样品涡旋，随后以10,000x g离心10分钟且将25μl上清液施加于HPLC柱。在分析的组织样品中，aldoxorubicin以多柔比星的保留时间洗脱。

Aldoxorubicin在肿瘤组织中的保留高于周围脑组织的3至4倍。参见图8。

免疫组织化学：对于组织学分析，收获来自对照和药物处理的具有肿瘤的小鼠的脑组织，在最佳切除温度(OCT)化合物中快速冷冻且在-80℃储存。将冷冻切片置于载片上且在锌缓冲的福尔马林中固定。载片用在1％BSA中的5％山羊血清封闭，随后与针对CD31(102402,Biolegend,San Diego,CA)、Ki-67(ab156956,Abcam,Cambridge,MA)、波形蛋白(ab92547,Abcam)、切割的-胱天蛋白酶-3(CP229B,Biocare Medical)和GFAP(NB300-141,Novus Biologicals,Littleton,CO)的一抗孵育过夜。然后将载片与一抗源特异性的二抗孵育，所述特异性二抗缀合至作为核复染色剂的Alexa Fluor 488或635和DAPI。使用的检测荧光团限于多柔比星的固有荧光光谱(λ

Aldoxorubicin在脑肿瘤中累积，但不在正常脑组织中累积。在肿瘤或正常脑中未发现任何明显量的多柔比星。

脑肿瘤中的aldoxorubicin/多柔比星检测：如以上实施例1中所述，向具有肿瘤的小鼠给予aldoxorubicin或多柔比星的静脉内注射。在最后注射后24小时对小鼠进行安乐死。收获脑部和使用针对明场和落射荧光装备有涵盖多柔比星特异性波长的滤光片的MVX10立体显微镜(Olympus of America)成像以显现药物累积。参见图10。

Aldoxorubicin而非多柔比星在神经胶质母细胞肿瘤中累积。