用于多糖定量的改进方法

发明领域

本发明涉及鉴定和定量测试样品中的多糖，并且特别是包含2-氨基糖醛酸的多糖，诸如某些细菌多糖。

引言

肠沙门氏菌伤寒血清型(

非缀合Vi多糖(Vi)是两种广泛可得的针对伤寒症的许可疫苗之一，连同口服的减毒活疫苗(Ty21a)

疫苗的制造要求其所有组分的良好表征和质量控制。Vi含量是由缀合或非缀合Vi组成的疫苗的关键质量属性

通常用于碳水化合物定量分析的比色法，诸如苯酚-硫酸法或蒽酮测试，由于Vi对酸水解的抗性而对Vi不适用

本发明人之前开发了基于强碱水解，随后HPAEC-PAD分析的定量方法

说明

在此，为了提高分析的灵敏度和特异性，本发明人已经开发出用于多糖(例如Vi)定量的新方法，所述方法基于报道用于快速蛋白水解的，伴随使用三氟乙酸和盐酸的酸水解

所述新方法将有助于基于多糖的疫苗的表征，诸如基于Vi的疫苗。所述方法可被用于其它多糖的定量，包括对常见的酸水解具有抗性的那些，如宋氏志贺氏菌O-抗原，或含有2-氨基糖醛酸，如肺炎链球菌(

因此，本发明的第一方面提供一种用于测量在测试样品中的一种或多种多糖的浓度和/或量的方法，其包含如下的步骤：

a. 用盐酸和三氟乙酸对测试样品的酸水解；

b. 步骤(a)的水解的测试样品的色谱分离；和

c. 基于步骤(b)中产生的数据，确定一种或多种多糖的浓度和/或量。

可选地，在步骤(c)中通过它们的色谱图确定一种或多种多糖。可选地，在步骤(a)之前，所述方法包含提供测试样品的步骤。可选地，所述方法也用于确定一种或多种多糖用于定量。

通过“测试样品”，我们是指或包括任何含有多糖的物质或混合物，例如，细菌培养物、糖纯化的中间产物(例如来自细菌培养物、药物物质或药物产品)、缀合的中间产物、最终缀合物、药物物质(例如疫苗药物物质)和药物产品(例如疫苗药物产品)。

步骤(b)的色谱方法可以是本领域已知的任何适宜的色谱法(参见，例如

可选地或额外地，前述权利要求中的任一项的方法，其中所述色谱法是HPAEC，例如HPAEC-PED (高效阴离子交换色谱法和脉冲电化学检测)或HPAEC-PAD (高效阴离子交换色谱法和脉冲安培检测)，参见例如Rohrer, Basumallick & Hurum, 2013, Biochemistry(Moscow), 'High-performance anion-exchange chromatography with pulsedamperometric detection for carbohydrate analysis of glycoproteins' 78: 697-709。可选地或额外地，所述HPAEC 优选是HPAEC-PAD。

可选地或额外地，所述多糖是细菌多糖。可选地或额外地，所述细菌多糖是表面多糖，例如，荚膜多糖或脂多糖。关于综述，参见Mostowy & Holt, 2018, TrendsMicrobiol., 'Diversity-Generating Machines: Genetics of Bacterial Sugar-Coating' 26(12): 1008-1021，其通过引用并入本文。

前述权利要求中的任一项的方法，其中所述多糖对常见的酸水解具有抗性。通过“对常见的酸水解具有抗性”的多糖，我们是指或包括这样的多糖，当使用选自氢氟酸、盐酸或三氟乙酸的单一酸水解时，导致在所述多糖完全解聚之前的单体降解。可以通过本领域已知的任何适宜的方式确定多糖解聚的程度，例如，通过HPLC-SEC、HPAEC-PAD、质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和核磁共振(NMR)。例如，参见参考文献22中利用的方法，其通过引用并入本文。

通过“单体降解”，我们是指或包括通过所述酸水解改变所述单体的化学结构。可以通过本领域已知的任何适宜的方式确定单体改变，例如，使用HPLC-SEC、HPAEC-PAD、质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和核磁共振(NMR)(例如通过与参考样品比较)。例如，参见参考文献22中利用的方法。

通过所述多糖是“完全解聚的”，我们是指或包括所有或实质上所有的所述多糖已经被单体化，例如≥90%的已经被单体化，例如≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%或≥100%的所述多糖已经被单体化。可以通过本领域已知的任何适宜的方式确定多糖解聚，例如，通过使用HPLC-SEC、HPAEC-PAD、质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和核磁共振(NMR)与参考样品比较。

可选地或额外地，所述多糖含有2-氨基糖醛酸，例如，所述多糖可以选自：

a. Vi荚膜多糖；

b. 宋氏志贺氏菌O-抗原；

c. 鲍氏不动杆菌(

d. 肺炎链球菌血清型12A；

e. 肺炎链球菌血清型12F；

f. 金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖；

g. 金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖；和

h. 肠杆菌共同抗原(ECA)。

可选地或额外地，所述多糖包含或由O-[4-氨基-2-(N-乙酰基)氨基-2,4-双脱氧-β-D-吡喃半乳糖基]-(1→4)-[2-(N-乙酰基)氨基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸]的重复二糖单元组成。可选地或额外地，所述多糖优选是Vi荚膜多糖。

可选地或额外地，所述酸水解步骤使用一定浓度的盐酸和三氟乙酸进行，以实现所述测试样品多糖的至少50%的单体回收，例如，所述测试样品多糖的至少60%、70%、90%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的单体回收。

可以通过本领域已知的任何适宜的方式确定单体回收百分比，例如，通过定量核磁共振(例如通过与对照样品比较)。例如，参见参考文献22中利用的方法。

可选地或额外地，所述酸水解步骤导致无单体降解或实质上无单体降解。

通过“无单体降解”，我们是指或包括在所述酸水解步骤期间没有多糖单体发生结构改变(除了通过解聚)。可选地或额外地，通过“无单体降解”，我们是指或包括在所述酸水解步骤期间没有多糖单体发生结构改变，除了通过解聚和包含或由脱-O-乙酰化和脱-N-乙酰化(例如酯键和酰胺键的断裂)组成的微小结构改变。

为避免疑义，单体降解可以发生在所述单体在其单体状态时或所述单体形成寡聚物或聚合物的部分时。通过“实质上无糖降解”，我们是指或包括在所述酸水解步骤期间，≤10%的所述多糖单体发生结构改变，例如，在所述酸水解步骤期间≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2%、≤1%、≤0.5%或≤0.1%的所述多糖单体发生结构改变。可以通过本领域已知的任何适宜的方式确定单体改变，例如，使用HPLC-SEC、HPAEC-PAD、质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和核磁共振(NMR)(例如通过与参考样品比较)。例如，参见参考文献22中利用的方法。

本发明人发现含有2-氨基糖醛酸的多糖(Vi和宋氏志贺氏菌O-抗原)的常规碱水解导致产生与测试的多糖共有的色谱峰。相反，当使用本发明的方法水解时，相同多糖的色谱图中没有该共有峰。因此，本方法能够区分和定量含有2-氨基糖醛酸的多糖。

可选地或额外地，在本方法中，所述酸水解步骤

可选地或额外地，酸水解步骤(a)的盐酸和三氟乙酸可顺次添加，但优选混合添加。可选地或额外地，将盐酸和三氟乙酸混合至如下的浓度：

a. 7M至10M HCl (例如8M至10M、8M至9M，或8M HCl)；和

b. 5%至30% v/v TFA (例如10%至25%、10%至20%，或10% TFA v/v TCA)。

可选地或额外地，优选地，所述酸水解步骤

可选地或额外地，所述酸水解步骤在72.0℃至85.0℃进行，例如，75.0℃至82.5℃、77.5℃至82.5℃，或80℃。可选地或额外地，优选地，所述酸水解步骤

可选地或额外地，所述酸水解步骤进行3.5至6.0小时，例如，4.0至6.0小时、4.0至5.5小时、4.0至5.0小时或4.5小时。可选地或额外地，优选地，所述酸水解步骤进行至少3小时。

前述权利要求中的任一项的方法，其中色谱法步骤(b)是或使用HPAEC-PAD，并运行≤30分钟，例如，≤25分钟、≤20分钟、≤19分钟、≤18分钟、≤17分钟、≤16分钟、≤15分钟、≤14分钟、≤13分钟、≤11分钟、≤10分钟或≤9分钟。

可选地或额外地，在酸水解步骤(a)之前，对所述测试样品进行脱盐和/或缓冲液交换，例如，通过透析或凝胶过滤色谱。

可选地或额外地，所述方法包括或由以下步骤组成：

i. 可选地，通过凝胶过滤色谱对测试样品脱盐.

ii. 将所述测试样品与TFA-HCl溶液以0.3:1 v/v的比率混合(例如通过涡流混合)；

iii. 将步骤(ii)的混合物在80℃加热4.5小时；

iv. 将步骤(iii)的混合物冷却至室温；

v. 使步骤(iv)的混合物蒸发(例如通过氮冲洗，由此充分干燥所述测试样品[例如至少99 w/w %干燥的，优选99.5 w/w %、99.6 w/w %、99.7 w/w %、99.8 w/w %、99.9 w/w%、99.99 w/w %干燥的])；

vi. 将步骤(v)的混合物溶解在水中(例如300 ml的水并溶解，例如通过涡流)；

vii. 通过0.2 µm过滤器过滤步骤(vi)的混合物；和

viii. 对步骤(vii)的混合物进行HPAEC-PAD。

可使用预定义的标准，例如，来自此前实验的一种或多种测量结果和/或由其产生的标准曲线，来解释色谱数据。可选地或额外地，在步骤(c)中，通过与一种或多种对照样品的色谱测量结果比较，来确定一种或多种多糖的浓度和/或量。

可选地或额外地，所述一种或多种对照样品包含预定浓度和/或量的有待于在所述测试样品中测量的多糖。可选地或额外地，所述一种或多种对照样品经过与所述测试样品相同的样品制备、酸水解和色谱步骤。

可选地或额外地，所述测试样品的样品制备、酸水解和色谱步骤与所述一种或多种对照样品的样品制备、酸水解和色谱步骤同时进行或连续进行。

可选地或额外地，使用足够数量和/或浓度范围的不同浓度的对照样品，以提供最佳拟合线，例如，导致(a) 显著的回归模型，(b) 非显著的失拟(lack of fit)，和/或(c)正态分布的残差(例如不需要数据变换)的最佳拟合线。可选地或额外地，所述最佳拟合线的决定系数(R

可选地或额外地，在一种或多种对照样品中多糖的下列浓度是0.05至15 µg/mL，例如，0.05、0.08、0.10、0.15、0.16、0.31、0.62、1.25、2.5、5和10 µg/mL。可选地或额外地，在一种或多种对照样品中的多糖浓度是5.0至10 µg/mL。

可选地或额外地，所述测试和/或对照样品的色谱运行顺序是随机的。在一个实施方案中，所述测试和对照样品以一式三份、四份或五份重复运行。

通过“对照样品”，我们是指或包括一种或多种单体，其来源于待测量的多糖的酸水解和/或纯化的多糖本身(其可能经过本发明的酸水解步骤)。

可选地或额外地，所述方法可用于定量样品，所述样品含有少于2.5 ug/mL的待定量的多糖，例如少于2.0 ug/mL、少于1.5 ug/mL、少于1 ug/mL、少于0.5 ug/mL、少于0.25ug/mL、少于0.20 ug/mL或少于0.1 ug/mL的待定量的多糖。

本发明的第二方面提供测试样品，所述测试样品使用在第一方面的方法中定义的酸水解步骤制备。

本发明的第三方面提供一种试剂盒，其用于实施在第一方面中定义的方法，所述试剂盒包含(a)盐酸、(b)三氟乙酸、(c)可选地，如权利要求20-28中任一项定义的一种或多种对照样品，和(d)可选地，使用说明。

现在将参考下列表格和附图，描述体现本发明特定方面的优选的非限制性实例。

图1：Vi多糖(a)和宋氏志贺氏菌O-抗原(b)重复单元结构。

图2：确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：来自DOE实验，在60℃ (a)、70℃ (b)和80℃ (c)的温度下的响应曲面图。

图3：来自在所确定的最佳条件下，用HCl/TFA水解的Vi多糖的单体的COSY (a)、HSQC (b)、MS谱(c)。

图4：Vi多糖(a)或宋氏志贺氏菌O-抗原(b)碱水解后的HPAEC-PAD色谱图，和Vi多糖(c)或宋氏志贺氏菌O-抗原(d) HCl/TFA水解后的HPAEC-PAD色谱图。

图5：确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：第一DOE响应面。

图6：确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：第二DOE响应面和残差正态图。

图7：通过酸水解，随后HPAEC-PAD的Vi定量的线性度确定：a)对校准曲线运行5次重复的ANOVA；b)校准曲线的重复。

图8：对缀合样品中的Vi定量的准确度确定(掺入回收率)。

图9：用于宋氏志贺氏菌O-抗原定量的水解动力学。

图10：通过酸水解，随后HPAEC-PAD的宋氏志贺氏菌O-抗原定量的线性度确定：a)对校准曲线的5次重复的ANOVA；b)校准曲线的重复。

图11：来自宋氏志贺氏菌O-抗原在所确定的最佳条件下的酸水解的产物的MS分析。

图12：金黄色葡萄球菌8型(a)、5型(b)和肺炎链球菌血清型12F (c)多糖的HCl/TFA水解后的HPAEC-PAD色谱图。

实施例

1.引言

伤寒症是发展中国家中发病率和死亡率的主要原因。针对伤寒症，已批准或在开发基于Vi荚膜多糖的疫苗。Vi含量是疫苗发放的关键质量属性，以监测它们的稳定性和确保适当的免疫反应。Vi多糖是在C-3位O-乙酰化的α-1,4-N-乙酰半乳糖氨基糖醛酸的均聚物，其对常用于在定量单体前的糖链解聚的酸水解具有抗性。我们之前开发了基于强碱水解，随后HPAEC-PAD分析的定量方法，但灵敏度低并且用于定量来自多糖解聚的未知产物。

我们在此描述了开发用于Vi多糖定量的方法，其基于伴随使用三氟乙酸和盐酸的酸水解。DoE方法用于确定最佳水解条件。所述方法比前一方法灵敏100倍，并且具有特异性，导致已知产物的形成，通过一维和二维NMR谱和质谱确认为脱-O-乙酰化和脱-N-乙酰化的Vi单体。确定了准确度和精密度，并改进了色谱条件以使分析时间缩短。

该方法将有助于基于Vi的疫苗的表征。此外，相似的方法有潜力拓展至其它含有2-氨基糖醛酸的多糖，如已在此证实的，用于宋氏志贺氏菌O-抗原、肺炎链球菌血清型12F以及金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜多糖。

2. 材料和方法

2.1.

氢氧化钠(NaOH) 50% w/w (目录号7067)购自Baker。三氟乙酸(TFA) (目录号299537)购自Honeywell。

用于定量NMR (qNMR)谱的马来酸标准品(目录号92816)、氧化氘(D

通过纯化去离子水制备1级纯水，在25℃ > 18 MΩ-cm。

Acroprep Advance 96过滤板0.2 μm Supor (目录号8119)购自Pall。1 mL 96深孔板(目录号260252)、96孔锥形BTM PP板(目录号249944)和用于96孔PP板的预开缝孔帽(目录号276011)购自Thermo。螺旋盖玻璃小瓶2 mL和W/Teflon橡胶内衬杯(目录号224741)购自Wheaton。Combitip plus 5 mL (目录号0030069.250)购自Eppendorf。

如前所述

2.2.

所有的水解步骤都在通风柜中操作以避免暴露于TFA和HCl。

2.3.

通过在玻璃瓶中以2:13 v/v的比率混合TFA和HCl，来制备TFA-HCl混合物。使用Eppendorf Xstream电子移液器，将在2 mL螺旋盖小瓶中的含有多糖样品/标准品的300微升溶液添加至1 mL TFA-HCl混合物中；盖上盖子，并且通过涡流混合内容物。

将含有样品/标准品的水解小瓶放置在配备三个预热的SHT1 12 33 Stuart铝块的SBH130D/3 Stuart热块加热器内，在80℃持续4.5小时。由插入铝块中的玻璃温度计监测温度。

水解后，从热块加热器中取出所述小瓶并冷却至室温。然后，用配备PTFE涂层针FSC4NCS的Techne样品浓缩器FSC400D，使用氮冲洗使所述小瓶的内容物蒸发。

干燥后，将每个小瓶的内容物重新溶解在300 µL水中并且通过涡流准确混合。每个小瓶的内容物转移到置于96锥形BTM板上的0.2过滤96孔板中，并且以524 rcf离心(具有SX4750摆斗式转子和393070微板载体的Beckmann Allegra X-15) 1分钟，以收集过滤的样品。

用预开缝的96-孔帽覆盖含有过滤的样品/标准品溶液的平板，并放进HPAEC-PAD自动进样器隔室中。

2.4.

使用脉冲安培计模式和金工作电极和Ag/AgCl参比电极，应用标准四碳水化合物波形(quad carbohydrate waveform)，在Thermo ICS-5000 (Chromeleon 7.2)或ICS-3000(Chromeleon 6.8)上进行色谱操作。

在具有Thermo CarboPac PA1 4x50保护柱的Thermo CarboPac PA1 4x250分析柱上进行分离。柱和检测器隔室保持在25℃，样品隔室保持在10℃。

作为系统适用性测试，在分析前，三次进样葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸(各5 µg/ml)的溶液，检查板计数和峰的不对称值。使用的色谱条件为：25 µL进样，总运行时间15分钟，400 mM NaOH中以1.5 mL/分钟流速的等度洗脱，在样品/标准品运行之间没有洗脱步骤。在分析结束时，在使用500 mM NaOH以1 mL/分钟的流速清洗20分钟后，将柱保存在200 mMNaOH中。

为了定量，运行两条校准曲线，一条在样品列的起始并且一条在末尾；如果残差低于10% (15%用于最低校准点)，则接受校准曲线点，每次分析弃去一个点的最大值。

每个样品分析一式三份，并且结果取平均值。使用Dixon Q检验99% (Q阈值0.994)，以获得从平均值除去三个水解重复中的一个的可能性。

2.5.

使用标准脉冲序列，用Bruker Avance III 400波谱仪在298K记录波谱。在400MHz记录

使用二维实验：COSY和HSQC分配单体的

对于定量NMR (qNMR)谱，将Vi多糖的溶液转移至两个螺旋盖小瓶中并干燥，以在每个小瓶中具有1 mg多糖(一份参考和一份用于水解)。经过水解的样品重悬在水中，并且用HCl 8 M 10% TFA的最终混合物在80℃处理4.5h，随后干燥。

将干燥的多糖用作参考，并且将干燥的水解的多糖重悬在D

使用H-3α和H-3β信号的总和与马来酸内部标准品之间的比率定量水解的样品。使用N-乙酰基信号与马来酸内部标准品之间的比率定量脱-O-乙酰化的多糖。通过计算估计水解产率，其作为在两个定量之间的比率。

2.6.

通过以10 µL/分钟直接注入样品，在Q-Exactive plus (Thermo)上记录高分辨率质谱。1毫克多糖在优化条件中水解并干燥，以200 µg/mL终浓度重悬在80%乙腈/20%水中。使用下列参数：扫描范围80-2000 m/z；分辨率70000，正离子模式，鞘气流速5，辅助气流速1，吹扫气流速0，喷雾电压3.8 KV，毛细管温度100℃，S-透镜RF水平60和辅助气加热器40℃。

2.7.

使用Design Expert 10 (Stat-Ease Inc.)进行实验计划和数据加工。

2.8.

用Minitab 18 (Minitab Inc.)进行统计分析。

3. 结果

3.1.

在获得一些初步的和有希望的测试结果后，验证伴随使用TFA和HCl (传统上报道其用于蛋白质的氨基酸性组成的分析

HCl浓度、TFA浓度、水解时间和温度是分别在5-8 M、10-20% v/v、2-5h、80-110℃的范围评估的因子。每个水解测试在总体积为450 µL的7 µg/mL Vi中进行，其中，酸水解混合物组成、时间和温度如表2中详述。在水解后，干燥样品并保存在4℃直到分析。在完成所有水解后，所有样品重悬在300 µL水中，并通过HPAEC-PAD分析；进样顺序遵循用于水解的相同随机方案(表2)。

以使水解产率相对于分析物色谱峰面积最大化为目的进行优化。

为了加工数据，选择具有二次式模型的响应面，并且在分析前对数据进行对数变换。使用向后剔除过程，从模型中去除非显著项(p值> 0.05)(在表3和图5中报告统计分析和结果)。实验结果被认为是用于进一步实验的基础，因为校正的R

基于这些结果，进行实验，以比较在有和没有10% TFA的情况下，在80℃和8 M HCl的5h水解。在存在TFA的情况下，所得分析物的峰面积比在没有TFA的情况下获得的对应的峰高约两倍。这证实了TFA浓度的变化在10-20%的范围内没有影响，但需要存在TFA以保证更有效的水解。

为了减少在后续优化中测试的数量，将水解混合物中的TFA百分比维持在10% (v/v)。

进行第二DoE，再次使用以温度为难改变因子，响应面方法，球形设计(α = 1.73)的分区法(表4)，HCl浓度从8 M改变至10 M，水解时间在2-6h的范围内且温度在60-80℃的范围内。

再次，选择具有二次式模型的响应面，并且在分析前对数据进行对数变换。使用向后剔除过程，从模型中去除非显著项(p值> 0.05)(在表5和图6)。残差是正态分布的(Ryan-Joiner检验，P > 0.1)，并所得模型具有0.97的校正的-R

基于结果，选择8 M HCl、10% TFA、4.5 h、80℃作为优化的水解条件(图2)。

3.2.

我们之前用于通过碱水解，随后HPAEC-PAD进行Vi多糖定量的方法

在通过DoE实验确定的优化条件中(8 M HCl、TFA 10%、4.5 h、80℃)，水解Vi多糖。所得产物通过

在HSQC谱中50.7 ppm和53.8 ppm的信号(图3b)是C-N键的特征，证实水解后没有损失氨基基团。

通过MS分析，也证实形成了预期的氨基-糖醛的脱-O-乙酰化和脱-N-乙酰化的单体(图3c)。在194.06609 u的离子对应于C

使用正交技术(NMR和MS)，我们证明所确定的水解条件导致完全脱-乙酰化的Vi单体，回收率为99.3%，如通过qNMR计算的。

3.3. 线性度的确定

为了评估新方法的线性度，以0.15、0.31、0.62、1.25、2.5、5、10 µg/mL的Vi浓度运行校准曲线的五次不同重复。样品制备顺序和色谱运行顺序是随机的。

对生成数据的回归分析显示出显著的线性模型和不显著的失拟。然而，残差不具有正态分布，并且不能使用数据的Box-Cox变换进行归一化。

之后通过减小校准曲线的范围重复回归分析(最高的校准曲线点从10至5 µg/mL)：回归模型显著，失拟不显著，并且所得残差正态分布，不需要数据变换(图7)。

3.4.

确定用于分析未缀合和缀合的Vi多糖样品二者的方法的精密度

为了评估Vi多糖样品(2 g/mL)分析的精密度，在不同的6天进行了总共6次分析会话(session)。两个操作者(operator)各自运行3次会话。在每个会话中，样品制备顺序和色谱运行顺序是随机的。

类似实验设计用于评估Vi-CRM缀合物样品(2.5 g/mL Vi)分析的精密度。

ANOVA方差成分分析(具有随机因子的一般线性模型和嵌套在操作者中的分析会话)用于评估中间精密度(定义为在不同会话、不同分析员之间的变异性)、重复性(定义为经过短的间隔时间，在相同操作条件下的变异性)，以及操作者和分析会话对变异性的贡献(表6)。

在表1中显示了对两种样品类型获得的结果，以%变异系数(CV)报告。

3.5.

没有评估用于Vi样品的准确度，因为校准曲线使用相同的物质建立。使用掺入回收率技术评估对Vi-CRM样品的准确度。

将1 µg/mL Vi多糖掺入Vi-CRM缀合物样品(在2.5 µg/mL的Vi浓度进行测试)。

为了评估掺入回收率，在不同的6天进行了总共6次分析会话。两个操作者各自运行3次会话。在每次会话中，样品制备顺序和色谱运行顺序是随机的。对于每次分析会话，计算基于理论掺入的掺入多糖的回收量。结果的平均值是101%的回收率，置信区间(95%)是85-117% (图8)。

3.6. 将

将针对Vi的优化的水解条件应用于宋氏志贺氏菌O-抗原。宋氏志贺氏菌O-抗原也在其重复单元中含有N-乙酰基-氨基糖醛酸(图1b)，使得所述聚合物对常用于在通过HPAEC-PAD定量单体之前的糖链解聚的酸水解具有抗性

为了定量此类糖，我们之前已经应用了用于Vi定量的相同碱水解条件和HPAEC-PAD分析

对宋氏志贺氏菌O-抗原进行在80℃用8 M HCl和10% TFA进行的水解动力学，其证实检测到的最大峰面积接近4.5 h (图9)。此外，证实了所述方法在0.08-2.5 µg/mL范围内的线性度(图10)。

水解产物的MS分析(图11)与如下相符：在194.0656 u对应于C

3.7. 将

为了收集开发的方法可拓展至其它含有2-氨基糖醛酸的多糖的进一步证据，在肺炎链球菌血清型12F以及金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜多糖中尝试用于Vi的优化条件

所有选择的三种多糖在它们的结构中都含有N-乙酰-氨基甘露糖醛酸。实际上，在水解后，我们确定它们全部形成在相同保留时间洗脱的峰(图12)，在水解3 h后具有最大面积。水解产物的MS分析证实在所有情况下，都存在脱-N-乙酰化的氨基-糖醛酸。MS分析还揭示存在所有三种结构共有的岩藻糖胺。

4.讨论

针对肠沙门氏菌伤寒血清型的疫苗已经上市，还有许多其它疫苗正在开发中，并且其中许多是基于Vi荚膜多糖

多糖含量是基于Vi的疫苗的关键质量属性之一。WHO已经推荐比色法

开发用于Vi定量的灵敏且特异的方法的主要障碍之一是其对于常见的酸水解程序具有抗性，所述酸水解程序通常应用于在其单体糖定量之前解聚多糖

获得的高水解产率连同良好定义的物类的形成，使所述新方法不仅具有特异性，而且比我们之前开发的基于碱的HPAEC-PAD程序灵敏~100倍。已经实现0.15 µg/mL相对16µg/mL的LOQ。在此报道的用于Vi解聚的程序可以用于产生单体，其可以容易地标准化以及用于建立校准曲线。

DOE方法已经应用于确定最佳水解条件。此类方法学的使用允许减少测试次数，并确定反应条件的最佳组合。此外，将色谱条件改进，使运行时间从用于原始HPAEC-PAD分析的31分钟减少至小于15分钟。

已证实所述方法对于定量未缀合和缀合的Vi是精确和准确的。发现的变异性(接近5%)可主要归因于重复性，而没有来自操作者的显著贡献。

针对Vi优化的相同程序成功拓展至宋氏志贺氏菌O-抗原。志贺氏菌感染是全世界中度至重度腹泻的主要原因之一。近期发布的全球疾病负担研究2016估计每年近似1.12亿例病例以及总计238,000例死亡，30%在小于5岁的儿童中，98.5%在中-低收入国家

该新方法将有助于表征基于Vi的疫苗，并将发现用于疫苗发放和随着时间推移的疫苗稳定性的应用。此外，相似的方法可拓展至其它含有2-氨基糖醛酸的多糖，如已经在此显示的宋氏志贺氏菌O-抗原(针对宋氏志贺氏菌O-抗原，本定量方法显示与用于Vi定量的此前方法的那些限值类似的限值

5. 结论

在此描述了定量针对肠沙门氏菌伤寒血清型的基于Vi的疫苗的新方法。该方法依赖于伴随使用TFA和HCl的多糖酸水解，随后HPAEC-PAD分析。所确定的条件导致多糖完全水解为其脱-O-乙酰化和脱-N-乙酰化的单体。这允许实现比目前使用的那些更特异和敏感的定量方法。我们已经示出该方法可以拓展至定量其它含有氨基糖醛酸的多糖。

表格

表1：通过酸水解，随后HPAEC-PAD定量Vi：用于Vi和Vi-CRM分析的中间精密度和重复性测定

表2：确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：第一DOE实验集

表3. 确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：用于第一DOE的模型的统计分析

用于选择的模型的REML (限制性最大似然)分析

Kenward-Roger p-值

固定效应[类型III]

方差成分

表4：确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：第二DOE实验集

表5：确定用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD进行Vi定量的最佳水解条件：第二DOE的模型的统计分析

用于选择的模型的REML (限制性最大似然)分析

Kenward-Roger p-值

固定效应[类型III]

方差成分

表6：用于通过酸水解，随后HPAEC-PAD定量非缀合和缀合样品中的Vi的重复性和中间精密度测定

Vi样品的ANOVA结果

一般线性模型：Vi ug/mL相对于操作者；会话

因子信息

方差分析

方差成分，使用校正的SS

*值是负的，并以零估计。

fVi-CRM样品的ANOVA结果

一般线性模型：Vi-CRM ug/mL相对于会话；操作者

因子信息

方差分析

方差成分，使用校正的SS

参考文献