多孔骨替代材料
文献发布时间：2023-06-19 18:35:48
技术领域
本发明属于用于骨修复的骨替代材料领域，特别是用于腔隙性骨缺损的修复和/或节段性骨缺损的修复的骨替代材料。
背景技术
骨不断经受再生和修复过程。事实上，我们的骨资本(capital)因此适应了我们存在的生物力学需求，用新的组织替换旧的组织。骨是由细胞即骨细胞组成的，被矿化的细胞外基质所包围。这种基质的更新是由于两种类型的细胞的作用之间的平衡，即：成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞合成骨基质，而破骨细胞则在各种激素和机械应力的作用下清除老化的骨组织。这个过程使骨具有惊人的自修复特性，使其在受伤时能够再生。因此，在骨折后，肢体的重构(réalignement)和维护(maintien)一般来说足以愈合：通过生成新的组织，成骨过程填补了由于骨折造成的缺陷，恢复了骨骼的功能。
然而，在某些情况下，这种自然的自修复过程是不够的：大约十次中就有一次，机械或生物问题阻碍了骨折的自修复。此外，遭遇家庭事故或道路事故、袭击的受害者中遇到的某些骨损伤、某些病理(注入假性关节炎)或手术干预(肿瘤、囊肿、感染部位的摘除)可能会导致骨物质的大量损失，而自然成骨不足以填补。这时必须对骨进行辅助治疗。
一种预期的修复骨的解决方案是移植自体骨的部分。然后我们就说到了骨自体移植。自体移植不会产生防御性免疫反应，因为组织来自于患者自身。然而，它导致了移植组织中相当多的细胞死亡。移植组织产生新的骨细胞的能力能够补偿这种损失，但这特别取决于移植组织的血管形成。事实上，后者对骨的重构至关重要：血管为细胞增殖提供必要的能量和养分。此外，自体移植需要两个手术部位(先切除再移植)，这可能会引起并发症(疼痛、脓肿、神经痛)。填充所需的移植物的大小是另一个重要的限制。
另一个预期的骨修复方案是移植来自捐赠者的骨部分。
这两种解决方案并不令人满意。这就是为什么似乎有必要开发一种骨替代材料，其性质类似于天然骨，但也能够促进与生长因子、祖细胞相关联的骨结合。
为了能够修复骨缺损，骨替代材料必须具有两个重要的特性：
-骨传导性，即材料作为骨再生的被动支撑的能力，和
-骨诱导性，是含蛋白质材料的特性，它的释放能诱导骨形成所需的生物级联。
它还必须多孔的和可吸收的。
有几种类型的材料可作为细胞和组织定植的被动支撑：可以使用天然或合成陶瓷，或各种自然来源的材料，其化学成分接近于骨的矿物相。自然来源的材料具有多种来源：例如，可以例举陶瓷化的牛骨或珊瑚外骨骼(滨珊瑚)，一种具有引人关注的骨传导性和生物力学性质的碳酸钙。填充骨缺损的最常用合成材料是羟基磷灰石和磷酸三钙，是磷酸盐族的两个矿物种类，纯的或作为混合物。它们可以以块状或颗粒状的形式制备。控制密度、粒度和孔隙度会确定材料的体内行为。
然而，当它们被使用时，这些材料不能单独使用，需要与生长因子、祖细胞相关联。此外，这些材料不能修复大面积骨缺损的连续性和骨结构，而且很少将骨传导和骨诱导性质与可控的、完全的生物降解性结合起来，以与骨再生动力学相协调。
文献US2011/268782描述了一种包括非脱细胞骨颗粒，特别是牛源性骨颗粒和热固性、非弹性和无孔聚氨酯树脂的骨植入物。
因此，发明人开发了一种新的多孔骨替代材料，具有良好的骨传导性和良好的骨诱导性，同时具有良好的生物相容性和降解性，适用于骨再生。此外，该多孔骨替代材料能够很容易地被外科医生操纵，并且能够很容易地被塑造为适应所有类型的骨缺损，包括重大骨缺损。
发明内容
因此，本发明的主题是一种多孔骨替代材料，其包括：
-至少一种多孔弹性体基质，及
-脱细胞骨的颗粒。
本发明的另一个主题是该骨替代材料在骨修复中的用途，优选为在腔隙性骨缺损的修复和/或节段性骨缺损的修复中的用途。
本发明的另一个主题是一种包括多孔骨替代材料的骨修复试剂盒。
本发明的另一个主题是一种制备骨替代材料的方法。
具体实施方式
本发明涉及一种多孔骨替代材料，其包括：
-至少一种多孔弹性体基质，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的含义中，术语“骨替代材料”是指一种物理支撑物，骨祖细胞能够在骨替代材料的表面和内部粘附、迁移、增殖及分化为成骨细胞，成骨细胞是负责骨形成的细胞。
有益地，根据本发明的骨替代材料是一种包括至少一种多孔弹性体基体和脱细胞骨的颗粒的复合材料，其单独的性质结合起来形成一种具有高度改进的整体性能的非均质材料(骨替代材料)，在单独使用该至少一种弹性体基体或脱细胞骨的颗粒时是观察不到该性能的。
发明人令人惊讶地表明，根据本发明的包括至少一种多孔弹性体基体和脱细胞骨颗粒的多孔骨替代材料具有：
-足以承受应力，而且也足以承受待修复区域的再生过程，并且足以成为这个区域骨组织的支撑的机械性能，
-允许参与这些过程的调整(régularisations)的祖细胞、养分和其他分子的循环，同时允许本发明的多孔骨替代材料的内部血管形成的孔隙度和相互连通性，
-允许参与这些过程的调整的分子的细胞粘附和吸附的粗糙度。
更特别的是，本发明人已经表明，该多孔骨替代材料是机械稳定的(杨氏模量E为100-300kPa)、无毒的(根据本发明的多孔骨替代材料孵育24小时后，间充质基质细胞的代谢活性大于90％)、可生物降解的(在37℃下的寿命为12至65个月)和具有骨传导性的。事实上，本发明人已经表明，该多孔骨替代材料允许祖细胞的粘附以及它们的增殖，包括深度增殖，随后祖细胞分化为成骨细胞。
在本发明的含义中，术语“弹性体基体”意指由多孔弹性体系统组成的结构，该结构可包括脱细胞骨颗粒。有益地，根据本发明的该至少一种弹性体基体具有良好的生物降解性、良好的生物相容性和良好的机械性能。
有利地，该弹性体基体的异氰酸酯指数在0.1和6.0之间。有利地，异氰酸酯指数在0.1和5.0之间，有利地在0.2和4.9之间，有利地在0.3和4.8之间，有利地在0.4和4.7之间，有利地在0.5和4.7之间，有利地在0.6和4.6之间，有利地在0.7和4.5之间，有利地在0.8和4.5之间，有利地在0.9和4.5之间，有利地在1到4.5之间，有利地在1.05到4.5之间，有利地在1.1和4.5之间，有利地在1.2和4.5之间，有利地在1.3和4.5之间，有利地在1.4和4.5之间，有利地在1.5和4.5之间，有利地在2.0和4.5之间，有利地在2.5和4.5之间，有利地在2.6和4.4之间，有利地在2.7和4.3之间，有利地在2.8和4.2之间，有利地在2.9和4.1之间，有利地在3.0和4.0之间。
在本发明的含义中，术语“弹性体”意指一种或多种具有“橡胶弹性”性质的交联聚合物。在本发明的一个特定实施例中，弹性体必须是生物相容的和可生物降解的。有利地，本发明的骨替代材料的压缩杨氏模量在10kPa和1000kPa之间。
在本发明的含义中，“生物相容的”弹性体基体是指这样一种弹性体基质，它有益地既能与患者的植入物相容，也就是说，这种植入物从治疗的角度看具有有益的效益/风险比，例如在2001/83/EC指令的含义中，即，相对于相关的治疗效益，患者的风险减少或甚至不存在风险；并且与包括在其中的脱细胞骨颗粒相容，也就是说，它允许包括脱细胞骨颗粒，不会或仅会轻微降低基体中包含的脱细胞骨颗粒的活性，并且一旦骨替代材料被植入患者，即人类或动物体内，就适合于骨重构。
在本发明的含义中，术语“可生物降解的”弹性体基体意指可生物再吸收和/或可生物降解和/或可生物吸收的弹性体基体，其共同目标是逐渐消失，在已经植入该材料的患者，即人类或动物体内弹性体基体有一种或多种不同或互补的降解、溶解或吸收机制。
在本发明的一个特定实施例中，根据本发明的该至少一种弹性体基体包括基于聚(酯-脲-氨酯)的弹性体。
在本发明的一个特别有利的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体包括基于聚(酯-脲-氨酯)的弹性体，该酯选自己内酯(PCL)低聚物、乳酸(PLA)低聚物、乙醇酸(PGA)低聚物、羟基丁酸酯(PHB)低聚物、羟基戊酸酯(PVB)低聚物、对二氧环己酮(PDO)低聚物、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)低聚物、聚(己二酸丁二醇酯)(PBA)低聚物或其组合。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(己内酯-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(乳酸-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(乙醇酸-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)基弹性体的基体。在另一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)基弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(乳酸-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)和聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)和聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)和聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)和聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)、聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)、聚(乙醇酸-脲-氨酯)和聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)、聚(乙醇酸-脲-氨酯)、聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)和聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)、聚(乙醇酸-脲-氨酯)、聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)、聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)和聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)、聚(乙醇酸-脲-氨酯)、聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)、聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)、聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)和聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)、聚(乙醇酸-脲-氨酯)、聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)、聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)、聚(对二氧环己酮-脲-氨酯)、聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)和聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。
这些弹性体确实允许实现本发明，而且具有细胞相容性、允许修复缺损骨的生理应力、避免修复后重新手术以及允许正确重构缺损骨的优点。特别有利地，多孔骨替代材料的该至少一种弹性体基体是包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的基体。这种包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的基体还有具有弹性体性质、为基体提供柔性以及具有相互连通的多孔结构和适合骨重构的骨诱导特性的优点。
在根据本发明的一个实施例中，存在于多孔骨替代材料中的骨颗粒是脱细胞骨的颗粒。在本发明的含义中，术语“脱细胞骨”是指仅由胶原蛋白特别是I型胶原蛋白组成的骨胶原基质、由羟基磷灰石晶体(结晶磷酸钙)和碳酸钙组成的矿物相、以及骨诱导蛋白组成的骨胶原基质。胶原蛋白和骨诱导蛋白的存在可增大骨传导性和骨诱导性。
有益地，脱细胞骨从海绵状的天然骨中获得。有益地，海绵状的天然骨可以是人股骨头。
换言之，根据本发明的脱细胞骨不含骨细胞(成骨细胞、破骨细胞、骨细胞及骨侧细胞)和任何潜在的致病和/或免疫成分。在一个特定的实施例中，存在于脱细胞骨颗粒中的胶原蛋白的比例按重量在10％和40％之间，有益地在15％和35％之间。有益地，脱细胞骨颗粒由I型胶原蛋白和III型胶原蛋白组成。
有益地，相对于颗粒的总重量，脱细胞骨颗粒包括：
-按重量比例低于2％的脂类；
-按重量比例在25％和45％之间的蛋白质；
-按重量比例为10％至30％的钙；
-按重量比例为5％至20％的磷；
-按重量含量低于15％的水；
钙/磷比有益地是1至2.2。
在一个特定的实施例中，多孔骨替代材料的脱细胞骨颗粒可以从天然骨中获得。有益地，天然骨颗粒可以从人类或动物来源的同种异体或异种异体的骨中获得。
有益地，多孔骨替代材料的脱细胞骨颗粒可以根据专利FR2798294或EP0502055中描述的方法之一从天然骨中获得。
在一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料的脱细胞骨颗粒从人类或动物来源的天然骨中获得。
有益地，脱细胞材料的脱细胞骨颗粒从海绵状的天然骨中获得。有益地，海绵状的天然骨可以是人股骨头。
在一个特定的实施例中，根据本发明的脱细胞骨颗粒的直径在1nm到1mm之间。有益地，脱细胞骨颗粒的直径在1nm和1mm之间，有益地在10nm和900μm之间，有益地在100nm和800μm之间，有益地在100nm和700μm之间，有益地在100nm和600μm之间，有益地在100nm和500μm之间，有益地在1μm和800μm之间，有益地在1μm和700μm之间，有益地在10μm和600μm之间，有益地在100μm和550μm之间，有益地在200μm和500μm之间，有益地在300μm和450μm之间，有益地在300μm和400μm之间。有益地，脱细胞骨颗粒的直径在300μm和400μm之间。
作为脱细胞骨的示例，可以特别提到
在本发明的一个有益实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，该酯选自己内酯低聚物(PCL)、乳酸低聚物(PLA)、乙醇酸低聚物(PGA)、羟基丁酸酯低聚物(PHB)、羟基戊酸酯低聚物(PVB)、对二氧环己酮低聚物(PDO)、聚(己二酸乙二醇酯)低聚物(PEA)、聚(己二酸丁二醇酯)低聚物(PBA)或其组合，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第一个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第二个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第三个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第四个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(乳酸-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第五个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)和聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第六个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第七个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)、聚(乳酸-脲-氨酯)和聚(乙醇酸-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第八个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(羟基戊酸酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第九个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(羟基丁酸酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第十个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(对二氧环己烷-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第十一个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己二酸乙二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的第十二个特定实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己二酸丁二醇酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的一个有益实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料仅包含：
-包括基于聚(酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，该酯选自己内酯低聚物(PCL)、乳酸低聚物(PLA)、乙醇酸低聚物(PGA)、羟基丁酸酯低聚物(PHB)、羟基戊酸酯低聚物(PVB)、对二氧环己酮低聚物(PDO)、聚(己二酸乙二醇酯)低聚物(PEA)、聚(己二酸丁二醇酯)低聚物(PBA)或其组合，及
-脱细胞骨的颗粒。
在本发明的一个有益实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包含：
-包括基于聚(酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，该酯选自己内酯低聚物(PCL)、乳酸低聚物(PLA)、乙醇酸低聚物(PGA)、羟基丁酸酯低聚物(PHB)、羟基戊酸酯低聚物(PVB)、对二氧环己酮低聚物(PDO)、聚(己二酸乙二醇酯)低聚物(PEA)、聚(己二酸丁二醇酯)低聚物(PBA)或其组合，及
-脱细胞骨的颗粒。
无论上述实施例如何，脱细胞骨的颗粒可以从人类或动物来源的天然骨或合成骨中获得。有益地，脱细胞骨颗粒的直径在1nm和1mm之间，有益地在300μm和400μm之间。
在本发明的一个特别有益的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
有益地，本发明人已经证明，由于羟基磷灰石的存在，脱细胞骨的颗粒和包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体的特定组合，赋予多孔骨替代材料更好的生物相容性。事实上，由包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体的降解会产生一种微酸性环境，使得细胞增殖的减少。由于羟基磷灰石的存在，脱细胞骨颗粒的加入使得可以中和这种酸度。
本发明人还发现，与单独使用包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的弹性体基体相比，脱细胞骨的颗粒和包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体的特定组合允许增大骨诱导性。事实上，由于多孔骨替代材料表面形貌的改变和/或钙离子的释放，添加脱细胞骨颗粒使得细胞附着和矿化的增加，而无需添加外源因素(facteursexogènes)。
有益地，根据本发明的多孔骨替代材料仅包含：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
有益地，根据本发明的多孔骨替代材料包含：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒。
有益地，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒，该脱细胞骨的颗粒从人类或动物来源的天然骨或从合成骨中获得。
有益地，根据本发明的多孔骨替代材料包含：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒，该脱细胞骨的颗粒从人类或动物来源的天然骨或从合成骨中获得。
有益地，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒，该脱细胞骨的颗粒的直径包括在1nm和1mm之间，有益地包括在300μm和400μm之间。
有益地，根据本发明的多孔骨替代材料包括：
-包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体的至少一种弹性体基体，及
-脱细胞骨的颗粒，该脱细胞骨的颗粒的直径包括在1nm和1mm之间，有益地包括在300μm和400μm之间，该脱细胞骨的颗粒从人类或动物来源的天然骨或从合成骨中获得。
在本发明的一个特定实施例中，脱细胞骨颗粒按重量占多孔骨替代材料的至少10％。有益地，脱细胞骨颗粒按重量占多孔骨替代材料的至少11％，有益地按重量占多孔骨替代材料的至少12％，有益地至少13％，有益地至少14％，有益地至少15％，有益地至少16％，有益地至少17％，有益地至少18％，有益地至少19％，有益地至少20％，有益地至少21％，有益地至少22％，有益地至少23％，有益地至少24％，有益地至少25％，有益地至少26％，有益地至少27％，有益地至少28％，有益地至少29％，有益地至少30％，有益地至少31％，有益地至少32％，有益地至少33％，有益地至少34％，有益地至少35％，有益地至少36％，有益地至少37％，有益地至少38％，有益地至少39％，有益地至少40％，有益地至少41％，有益地至少42％，有益地至少43％，有益地至少44％，有益地至少45％，有益地至少46％，有益地至少47％，有益地至少48％，有益地至少49％，有益地至少50％。有益地，脱细胞骨颗粒按重量占多孔骨替代材料的10％到50％之间。有益地，脱细胞骨颗粒按重量占多孔骨替代材料的11％和50％之间，有益地在12％和50％之间，有益地在13％和50％之间，有益地在14％和50％之间，有益地在15％和50％之间，有益地在16％和50％之间，有益地在17％和50％之间，有益地在18％和50％之间，有益地在19％和50％之间，有益地在20％和50％之间，有益地在21％和50％之间，有益地在22％和50％之间，有益地在23％和50％之间，有益地在24％和50％之间，有益地在25％和50％之间，有益地在26％和50％之间，有益地在27％和50％之间，有益地在28％和50％之间，有益地在29％和50％之间，有益地在30％和50％之间，有益地在31％和50％之间，有益地在32％和50％之间，有益地在33％和50％之间，有益地在34％和50％之间，有益地在35％和50％之间，有益地在36％和50％之间，有益地在37％和50％之间，有益地在38％和50％之间，有益地在39％和50％之间，有益地在40％和50％之间。
在本发明的一个特别有利的实施例中，脱细胞骨颗粒按重量占多孔骨替代材料的33％。在本发明的另一个特别有利的实施例中，脱细胞骨颗粒按重量占多孔骨替代材料的50％。
在本发明的一个有利实施例中，多孔骨替代材料的多尺度孔径在50μm和2000μm之间。在本发明的含义中，术语“孔径”和“孔直径”可以互换使用。所谓的“多尺度孔径”是指孔径的可变分布，也就是说，包括具有若干微米的孔和具有更小尺寸的孔，比例可变。举例来说，多尺度孔径在50μm和2000μm之间的骨替代材料是在同一骨替代材料中同时包括可变孔径在50μm至2000μm之间的孔。作为非限制性的示例，多尺度孔径在50μm和2000μm之间的骨替代材料是指在同一骨替代材料中同时包括例如孔径为50μm的孔、孔径为100μm的孔、孔径为500μm的孔、孔径为1500μm的孔、孔径为2000μm的孔。
有益地，多孔骨替代材料的多尺度孔的孔径在50μm和2000μm之间，有益地在50μm和1500μm之间，有益地在50μm和1000μm之间，有益地在50μm和800μm之间，有益地在100μm和1500μm之间，有益地在100μm和1000μm之间，有益地在100μm和800μm之间。
在本发明的一个有利实施例中，多孔骨替代材料的孔具有粗糙表面。
在本发明的含义中，当孔径大于50nm时，使用术语大孔率；当孔径小于2nm时，使用术语微孔率；当孔径在2nm到50nm之间时，使用术语中孔率。有益地，多孔骨替代材料具有大孔率。
在本发明的一个有利实施例中，多孔骨替代材料的总孔隙度大于或等于60％。在本发明的含义中，术语“总孔隙度”是指材料的空隙体积与多孔骨替代材料的总体积之比。有益地，多孔骨替代材料的总孔隙度大于或等于60％，有益地大于或等于61％，有益地大于或等于62％，有益地大于或等于63％，有益地大于或等于64％，有益地大于或等于65％，有益地大于或等于66％，有益地大于或等于67％，有益地大于或等于68％，有益地大于或等于69％，有益地大于或等于70％，有益地大于或等于71％，有益地大于或等于72％，有益地大于或等于73％，有益地大于或等于74％，有益地大于或等于75％，有益地大于或等于76％，有益地大于或等于77％，有益地大于或等于78％，有益地大于或等于79％，有益地大于或等于80％，有益地大于或等于81％，有益地大于或等于82％，有益地大于或等于83％，有益地大于或等于84％，有益地大于或等于85％，有益地大于或等于86％，有益地大于或等于87％，有益地大于或等于88％，有益地大于或等于89％，有益地大于或等于90％，有益地大于或等于91％，有益地大于或等于92％，有益地大于或等于93％，有益地大于或等于94％，有益地大于或等于95％，有益地大于或等于96％，有益地大于或等于97％，有益地大于或等于98％，有益地大于或等于99％。在本发明的一个有益的实施例中，多孔骨替代材料的总孔隙度大于或等于80％。
有益地，多孔骨替代材料的总孔隙度在60％和95％之间，有益地在61％和89％之间，有益地在62％和88％之间，有益地在63％和87％之间，有益地在64％和86％之间，有益地在65％和85％之间，有益地在66％和84％之间，有益地在67％和83％之间，有益地在68％和82％之间，有益地在69％和81％之间，有益地在70％和80％之间。在一个特别有益的实施例中，多孔骨替代材料的总孔隙度在70％和90％之间。
在本发明的一个有益实施例中，多孔骨替代材料的孔间相互连通性在60％和100％之间。有益地，孔间相互连通性在65％和100％之间，有益地在70％和100％之间，有益地在75％和100％之间，有益地在80％和100％之间，有益地在85％和100％之间，有益地在90％和100％之间，有益地在91％和100％之间，有益地在92％和100％之间，有益地在93％和100％之间，有益地在94％和100％之间，有益地在95％和100％之间，有益地在96％和100％之间，有益地在97％和100％之间，有益地在98％和100％之间，有益地在99％和100％之间。
在本发明的一个特别有利的实施例中，孔间相互连通性大于65％，有益地大于70％，有益地大于75％，有益地大于80％，有益地大于85％，有益地大于90％，有益地大于91％，有益地大于92％，有益地大于93％，有益地大于94％，有益地大于95％，有益地大于96％，有益地大于97％，有益地大于98％，有益地大于99％。在本发明的一个有益实施例中，多孔骨替代材料的孔间相互连通性是100％。
在一个特别有益的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料的多尺度孔径在50μm至2000μm之间，总孔隙度在60％和95％之间，孔间相互连通性在60％和100％之间。有益地，根据本发明的多孔骨替代材料的多尺度孔径在50μm至2000μm之间，总孔隙度在70％和85％之间，孔间相互连通性为100％。
在一个特别有益的实施例中，包括至少一种弹性体基体和脱细胞骨颗粒的多孔骨替代材料，该至少一种弹性体基体包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体，该多孔骨替代材料的多尺度孔径在50μm至2000μm之间，总孔隙度在60％和95％之间，孔间相互连通性在60％和100％之间。有益地，包括至少一种弹性体基体和脱细胞骨颗粒的多孔骨替代材料，该至少一种弹性体基体包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体，该多孔骨替代材料的多尺度孔径在50μm至2000μm之间，总孔隙度在70％和85％之间，孔间相互连通性为100％。材料的孔隙度、孔径及其相互连通性对多孔骨替代材料的血管形成和逐渐吸收的能力有很大影响。
因此，由于其总孔隙度在70％和85％之间，其多尺度孔径在50μm和2000μm之间，包括至少一种弹性体基体和脱细胞骨颗粒的多孔骨替代材料，该至少一种弹性体基体包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体，该多孔骨替代材料特别适用于细胞迁移和在该多孔骨替代材料内的骨形成。此外，50μm和2000μm之间的多尺度孔径和100％的孔间互相连通性使得根据本发明的多孔骨替代材料本身可以调节血管生成和骨生成。事实上，相互连通的多孔网络使其可以引导附着和细胞生长，从而引导新形成的骨骼的生长。因此，包括至少一种弹性体基体和脱细胞骨颗粒的多孔骨替代材料，该至少一种弹性体基体包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体，该多孔骨替代材料允许祖细胞迁移并且分化为成骨细胞，这使它成为一种骨传导材料。
多孔骨替代材料的尺寸取决于待重构的骨的大小和厚度。在本发明的一个特定实施例中，多孔骨替代材料的尺寸在10mm至20cm之间，厚度在100μm至4cm之间。有益地，多孔骨替代材料的尺寸在10mm和20cm之间，有益地在50mm和20cm之间，有益地在100mm和20cm之间，有益地在500mm和20cm之间，有益地在1cm和20cm之间，有益地在2cm和20cm之间，有益地在3cm和20cm之间，有益地在4cm和20cm之间，有益地在5cm和20cm之间，有益地在6cm和20cm之间，有益地在7cm和20cm之间，有益地在8cm和20cm之间，有益地在9cm和20cm之间，有益地在10cm和20cm之间，有益地在11cm和20cm之间，有益地在12cm和20cm之间，有益地在13cm和20cm之间，有利于14cm和20cm之间，有益地在15cm和20cm之间。在本发明的一个特定实施例中，多孔骨替代材料的尺寸为10cm，特别是当待重构的骨是长骨时。
有益地，多孔骨替代材料的厚度在100μm和4cm之间，有益地在200μm和4cm之间，有益地在500μm和4cm之间，有益地在1mm和4cm之间，有益地在1cm和4cm之间，有益地在1cm和3cm之间。在一个特别有益的实施例中，多孔骨替代材料的厚度在1cm和3cm之间，特别是当待重构的骨是长骨时。在另一个特别有益的实施例中，多孔骨替代材料的厚度在100μm和1cm之间，特别是当待重构的骨是扁骨时。
在本发明的一个特定实施例中，多孔骨替代材料的体积至少是0.1cm
在本发明的一个实施例中，骨替代材料可以具有各种形式，有益地是圆柱形、平面或棱形形式。有益地，骨替代材料可以是柔性多孔海绵的形式、柔性多孔膜的形式、柔性多孔薄膜的形式。
在本发明的一个特定实施例中，根据本发明的骨替代材料单独使用。在本发明的另一个实施例中，骨替代材料可以进一步与活性剂结合使用。有益地，活性剂被布置在根据本发明的骨替代材料的孔内，部分或完全地覆盖骨替代材料的孔。有益地，活性剂可以通过以下方法之一添加：用活性剂覆盖骨替代材料，将骨替代材料浸泡在活性剂中，将活性剂洒(pulvérisation)到骨替代材料上，将活性剂熏蒸(vaporisation)到骨替代材料上，或本领域技术人员熟知的能够将其填充和/或填入该骨替代材料的孔的任何其他技术。有益地，活性剂可以是对于应用到植入部位具有理想的生理特性的任何治疗剂或药物活性剂(包括但不限于核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物)。治疗剂包括但不限于：抗感染剂，如抗生素和抗病毒剂；化学治疗剂(如抗癌剂)；抗排斥剂；镇痛剂和镇痛制品；抗炎剂；激素，如类固醇；生长因子(包括但不限于，细胞因子、趋化因子和白细胞介素)，凝血因子(因子VII，VIII，IX，X，XI，XII，V)，白蛋白，纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子(Von Willebrand factor)，凝血酶抑制剂，抗血栓形成剂，溶栓剂，纤维蛋白溶解剂，血管痉挛抑制剂，钙通道抑制剂，血管扩张剂，血管痉挛抑制剂，抗高血压剂，抗菌剂，抗生素，表面糖蛋白受体抑制剂，抗血小板药物，抗有丝分裂剂，微管抑制剂，抗血小板药物，抗有丝分裂剂，微管抑制剂，肌动蛋白抑制剂抗分泌剂，重构抑制剂，反义核苷酸，抗代谢物，抗增殖剂，抗癌化学治疗剂，抗炎类固醇，非甾体抗炎剂，免疫抑制剂，生长激素拮抗剂，生长因子，多巴胺激动剂，放射治疗剂，肽，蛋白质，酶，细胞外基质成分，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，自由基清除剂，螯合剂，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，抗氧化剂，抗聚合酶，抗病毒剂，光动力治疗剂和基因治疗剂以及其他天然存在的或经基因改造的蛋白质，多糖，糖蛋白和脂蛋白，或其组合，该清单不具有限制性。在本发明的一个特别有益的实施例中，活性剂是治疗剂的组合，特别是抗生素和生长因子的组合。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的用于骨修复的多孔骨替代材料。在本发明的含义中，术语“骨修复”意指通过诱导受损骨的成骨作用进行重构。根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复各种骨科病变。有益地，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复腔隙性缺损和/或修复节段性骨缺损。有益地，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复腔隙性骨缺损。有益地，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复节段性骨缺损。有益地，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复颌面部骨缺损。
就本发明而言，术语“腔隙性骨缺损”是指相对于没有缺损的骨的总表面而言，体积至少为0.1cm
在本发明的含义中，术语“节段性骨缺损”是指相对于没有缺损的骨而言，沿骨的长度损失至少10mm，并且失去连续性。有益地，失去连续性的骨损失至少为10mm，有益地至少50mm，有益地至少100mm，有益地至少500mm，有益地至少1cm，有益地至少2cm，有益地至少3cm，有益地至少4cm，有益地至少5cm，有益地至少6cm，有益地至少7cm，有益地至少8cm，有益地至少9cm，有益地至少10cm，有益地至少11cm，有益地至少12cm，有益地至少13cm，有益地至少14cm，有益地至少15cm。
可能存在这种缺损的情况的示例包括损伤后的节段性骨损失，骨被切除以及接着进行关节的全关节置换术(例如，嵌入移植等)的骨肿瘤的手术，由于感染性疾病引起的骨损失，先天性缺陷。根据本发明的多孔骨替代材料可以作为假体骨重构植入物或替代物，例如用于骨科手术，包括髋关节的修正，替代骨损失，例如用于创伤学，颌面外科的重构或牙周缺损和拔牙后的牙槽修复，包括增加嵴(crêtes)和提升窦(sinus)。因此，根据本发明的多孔骨替代材料能够被用于矫正骨修复部位任意数量的骨缺损。
在本发明的一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料能够被用于修复任何类型的人类或动物来源的骨。在一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复长骨。举例说明长骨，可以特别提到肱骨、股骨、胫骨、腓骨、桡骨和尺骨。在一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复短骨。举例说明短骨，可以特别提到椎骨、髌骨、腕骨和跗骨。在一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复扁骨。举例说明扁骨，可以特别提到肋骨、颅骨、髂骨、肩胛骨和胸骨。有益地，根据本发明的多孔骨替代材料可以被用于修复颌面骨。
在本发明的一个特定实施例中，骨修复的体积大于或等于待修复的骨体积的5％。有益地，骨修复的体积大于或等于待修复的骨体积的6％，有益地大于或等于7％，有益地大于或等于8％，有益地大于或等于9％，有益地大于或等于10％，有益地大于或等于11％，有益地大于或等于12％，有益地大于或等于13％，有益地大于或等于14％，有益地大于或等于15％，有益地大于或等于16％，有益地大于或等于17％，有益地大于或等于18％，有益地大于或等于19％，有益地大于或等于20％，有益地大于或等于21％，有益地大于或等于22％，有益地大于或等于23％，有益地大于或等于24％，有益地大于或等于25％，有益地大于或等于26％，有益地大于或等于27％，有益地大于或等于28％，有益地大于或等于29％，有益地大于或等于31％，有益地大于或等于32％，有益地大于或等于33％，有益地大于或等于34％，有益地大于或等于35％，有益地大于或等于36％，有益地大于或等于37％，有益地大于或等于38％，有益地大于或等于39％，有益地大于或等于40％，有益地大于或等于41％，有益地大于或等于42％，有益地大于或等于43％，有益地大于或等于44％，有益地大于或等于45％，有益地大于或等于46％，有益地大于或等于47％，有益地大于或等于48％，有益地大于或等于49％。有益地，骨修复的体积大于或等于待修复的骨体积的50％。
在本发明的一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料能够被用于人类或动物的骨修复。举例来说，动物可以是马、小马、狗、猫、大鼠、小鼠、猪、母猪、奶牛、肉牛、公牛、牛犊、山羊、绵羊、公羊、羔羊、驴、骆驼、单峰骆驼，该清单并不具有限制性。
本发明的另一个方面涉及一种包括根据本发明的多孔骨替代材料和固定元件的骨修复试剂盒。有益地，该骨修复试剂盒包括多孔骨替代材料和固定元件，该多孔骨替代材料包括至少一种弹性体基体和脱细胞骨颗粒，该至少一种弹性体基体包括基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体。在本发明的含义中，术语“固定元件”意指金属板或用于固定金属板的管状、环形、内部或外部固定装置，以便将根据本发明的多孔骨替代材料适当地保持在待修复的骨上，直到其固化。有益地，固定器可以是其上有带螺纹的螺丝孔的锁板，使埋头螺钉(contre-vis)能够到位，防止螺钉向后移动，诸如
本发明的另一个方面涉及一种制备根据本发明的多孔骨替代材料的方法。在本发明的一个特定的实施例中，根据本发明的多孔骨替代材料通过poly-HIPE方法(具有高内相的乳液的形成和聚合/交联)获得。高内相乳液或HIPE由不混溶的液/液分散系统组成，其中内相，也称为分散相，所占体积大于乳液总体积的74-75％，也就是说，体积大于单分散球体的紧凑包装在几何学上可能的体积。
在一个特定的实施例中，该制备多孔骨替代材料的方法包括以下步骤：
a)制备包括合成聚(酯-脲-氨酯)所需的化合物的有机相，
b)在步骤a)的有机相中加入水和脱细胞骨颗粒，以形成乳剂，
c)将在步骤c)中含有脱细胞骨颗粒的乳液进行聚合/交联，以获得该多孔骨替代材料，
d)清洗在步骤c)中获得的该多孔骨替代材料，及
e)干燥在步骤d)中获得的该多孔骨替代材料。
在本发明的一个实施例中，步骤a)在于制备包括合成聚(酯-聚氨酯)所需的化合物的有机相。有益地，有机相还包括低聚物、该低聚物的有机溶剂、交联剂、催化剂和表面活性剂。有益地的，有机相包括甲苯、聚己内酯三醇低聚物、司盘80表面活性剂、六亚甲基二异氰酸酯交联剂(HMDI)和二月桂酸二丁基锡催化剂(DBTDL)。
在一个特定的实施例中，步骤a)包括第一步a1)将聚己内酯三醇低聚物和司盘80表面活性剂溶解于甲苯中，然后是第二步a2)将HMDI交联剂和DBTDL催化剂加入步骤a1)的溶液中以形成有机相。在本发明的一个有益的实施例中，使用了7mL甲苯，1.3g聚己内酯三醇低聚物，1.3g司盘80表面活性剂，1.04mL HMDI交联剂和12滴DBTDL催化剂。有益地，本领域的技术人员会知悉如何根据多孔骨替代材料所需孔径来调整甲苯、聚己内酯三醇低聚物、司盘80表面活性剂、HMDI交联剂和DBTDL催化剂的用量。
在一个特定的实施例中，该方法的步骤b)在于将水加入到有机相中以形成乳液，然后将脱细胞骨颗粒加入到乳液中。有益地，水和脱细胞骨颗粒在搅拌下逐渐加入，直到获得乳液。有益地，水是消毒过的蒸馏水。有益地，本领域技术人员会知悉如何根据多孔骨替代材料所需的孔径来调整水的用量。有益地，加入的水量为34mL。
在一个特定的实施例中，该工艺的步骤c)包括对步骤b)中获得的乳液聚合/交联，以获得该多孔骨替代材料。有益地，聚合/交联是在模具中进行的，以便使多孔骨替代材料具有所需的形状。有益地，将步骤b)中获得的乳液在30℃和80℃之间的温度下放置10至30小时。有益地，将步骤b)中获得的乳液放置于35℃至65℃之间的温度下，有益地置于40℃至60℃之间的温度下，有益地置于45℃至65℃之间的温度下，有益地置于50℃至60℃之间的温度下，有益地置于55℃的温度下。有益地，将步骤b)中获得的乳液在30℃至80℃的温度下放置10至30小时，有益地放置11至29小时，有益地放置12至29小时，有益地放置13至28小时，有益地放置14至27小时，有益地放置15至27小时，有益地放置16至27小时，有益地放置17至27小时，有益地放置18至26小时，有益地放置19至25小时，有益地放置20至24小时，有益地放置24小时。有益地，本领域技术人员会知悉如何根据多孔骨替代材料所需的孔径来调整温度。
在本发明的一个特定实施例中，步骤c)中获得的多孔骨替代材料在步骤d)之前被退火。有益地，在步骤c)中获得的多孔骨替代材料在至少50℃的温度下退火至少1小时。有益地，在步骤c)中获得的多孔骨替代材料在100℃的温度下退火2小时。
在一个特定的实施例中，步骤d)的清洗步骤可以去除在聚合过程中未发生反应的合成聚(酯-脲-氨酯)所需的试剂，以及仍然存在的表面活性剂和催化剂。有益地，步骤d)的清洗是使用以下产品中的一种进行的：二氯甲烷、二氯甲烷/正己烷、正己烷、水、这些产品的混合物或这些产品的连续应用。有益地，步骤d)的清洗是通过使干燥的多孔骨替代材料与二氯甲烷接触至少24小时，然后用二氯甲烷/正己烷(50％体积/50％体积)清洗至少24小时，接着用正己烷清洗至少24小时，然后用蒸馏水最后清洗至少24小时。
在一个特定的实施例中，根据本发明的方法还可以包括在步骤c)和步骤d)之间的干燥步骤。有益地，这个干燥步骤可以通过在露天或烤箱中干燥来执行。有益地，本领域技术人员会知悉如何根据待干燥的材料来调整烤箱温度。有益地，干燥是通过露天晾晒至少7天来进行的。
有益地，步骤e)的干燥可以通过在露天或烤箱中干燥来执行。有益地，本领域技术人员会知悉如何根据待干燥的材料来调整烤箱温度。有益地，干燥是通过露天晾晒至少15天来进行的。
在一个特定的实施例中，根据本发明的方法还可以包括在清洗该多孔骨替代材料的步骤e)之后的灭菌步骤f)。在一个特定的实施例中，灭菌步骤f)能够直接在干燥的多孔骨替代材料上进行，或者在水介质中对生物材料进行真空清洗后进行。有益地，灭菌是在水介质中进行真空清洗后进行。
在一个实施例中，灭菌步骤f)按以下方式进行：
f1)将多孔骨替代材料在真空下与无菌水接触1小时，
f2)更换无菌水，并且将多孔骨替代材料在真空下与更换的无菌水接触4小时，
f3)将来自步骤f2)的多孔骨替代材料在真空下与70％乙醇接触1小时，
f4)用无菌水更换70％乙醇，并且将来自步骤f3)的多孔骨替代材料在环境压力下与无菌水接触过夜，
f5)将步骤f4)产生的根据本发明的生物材料在高压灭菌器中用水消毒。
在另一个实施例中，灭菌步骤f)能够通过伽马辐照进行。在另一个实施例中，灭菌步骤f)能够通过贝塔辐照进行。有益地，贝塔和/或伽马辐照的剂量可以在15至45kGy之间。有益地，贝塔和/或伽马辐照的剂量是25kGy。有益地，贝塔和/或伽马辐照的剂量是15kGy。
在另一个实施例中，灭菌步骤f)能够通过使骨替代材料与环氧乙烷接触来进行。
在另一个实施例中，灭菌步骤f)能够通过使骨替代材料与来自气体的等离子体相接触来进行。
在另一个实施例中，灭菌步骤f)能够通过用电子束(E-beam，Faisceau E)照射骨替代材料来进行。电子束辐照治疗有以下优点：缩短处理时间，提高供应线的效率，减小弹性体基体被削弱的风险，减少生物材料的氧化损伤，弹性体基体没有颜色变化，使其清洁和安全。此外，电子束辐照处理是一种生态处理。
在一个特定的实施例中，根据本发明的方法还可以包括在灭菌步骤e)之后储存该多孔骨替代材料的步骤g)。有益地，储存该材料的步骤g)通过使多孔骨替代材料接触70％乙醇来进行的，直到使用为止。
在本发明的一个特定的实施例中，该制备多孔骨替代材料的方法包括以下步骤：
a)制备包括合成聚(酯-脲-氨酯)所需的化合物的有机相，
b)在步骤a)的有机相中加入水和脱细胞骨颗粒，以形成乳剂，
c)将步骤b)中获得的乳液进行聚合/交联，以获得该多孔骨替代材料，及
d)清洗在步骤c)中获得的该多孔骨替代材料，
e)干燥在步骤d)中获得的该多孔骨替代材料，
f)对在步骤e)中获得的多孔骨替代材料进行灭菌，及
g)可选地，储存多孔骨替代材料。
在本发明的一个特定的实施例中，该制备多孔骨替代材料的方法包括以下步骤：
a)制备包括合成聚(酯-脲-氨酯)所需的化合物的有机相，
b)同时将水和脱细胞骨颗粒加入步骤a)的有机相中，以形成乳剂，
c)将步骤b)中获得的乳液进行聚合/交联，以获得该多孔骨替代材料，及
d)清洗在步骤c)中获得的该多孔骨替代材料，
e)干燥在步骤d)中获得的该多孔骨替代材料，
f)对在步骤e)中获得的多孔骨替代材料进行灭菌，及
g)可选地，储存多孔骨替代材料。
在本发明的一个特别有利的实施例中，该制备多孔骨替代材料的方法包括以下步骤：
a)制备包括合成聚(酯-脲-氨酯)所需的化合物的有机相，该步骤a)包括第一步a1)将聚己内酯三醇低聚物和表面活性剂司盘80溶于甲苯中，然后是第二步a2)将交联剂HMDI和催化剂DBTDL加入步骤a1)的溶液中以形成有机相，
b)在步骤a)的有机相中加入水和脱细胞骨颗粒，以形成乳剂，
c)将步骤b)中获得的乳液进行聚合/交联，以获得该多孔骨替代材料，及
d)清洗在步骤c)中获得的该多孔骨替代材料，
e)将步骤d)中获得的该多孔骨替代材料干燥至少15天，
f)对在步骤e)中获得的多孔骨替代材料进行灭菌，及
g)可选地，储存多孔骨替代材料。
附图
图1：图1示出了根据本发明的多孔骨替代材料内部和表面上均匀分布的异体骨颗粒。这些图像是根据本发明的多孔骨替代材料在清洗后通过3D显微镜(VHX基恩士)获得的，没有对骨颗粒进行染色，箭头表示骨颗粒(A，B)的所处位置；
图2：图2示出了单独的骨颗粒、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)的傅立叶变换红外光谱(FTIR)分析；
图3：图3示出了单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)在压缩试验期间的应力-变形曲线(左侧：完整曲线；右侧：曲线开始处的放大图)；
图4：图4示出了单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)在37℃体外降解和90℃加速体外降解期间的质量损失；
图5：图5示出了用单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)的浸提介质孵育后，用MTT试验测定的细胞活性。“空白样本”(Blanksample)表示正常条件下的对照细胞的结果，而“阳性对照”(positive control)表示细胞毒性分子(这里选择HMDI)存在时的结果；
图6：图6示出了对单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)进行间接细胞毒性试验期间，通过锥虫蓝染色确定的细胞存活率。“空白样本”(Blank sample)表示正常条件下的对照细胞的结果，而“阳性对照”(positivecontrol)表示细胞毒性分子(这里选择HMDI)存在时的结果；
图7：图7示出了从犬科脂肪组织中获得的间充质基质细胞从第10天(D10)到第40天(D40)在单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)中的迁移情况；
图8：图8示出了大鼠股骨上临界尺寸的节段性缺损；
图9A：图9A示出了根据本发明的多孔骨替代材料在植入到包装介质之前的柱体；
图9B：图9B示出了根据本发明的多孔骨替代材料的柱体在微断层扫描后的情况；
图10A：图10A示出了对由骨固定板固定的节段性股骨缺损的放射学监测，61天后进行了部分重构；
图10B：图10B示出了对由骨固定板固定的节段性股骨缺损的放射学监测，31天后出现了系统故障；
图11：图11示出了在不同的研究时间，对照批次(非操作(Non op))、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Composite)、脱细胞骨和阳性对照(C pos)(非临界)的红细胞和血小板的浓度；
图12：图12示出了在不同的研究时间，对照批次(非操作(Non op))、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Composite)、脱细胞骨和阳性对照(C pos)(非临界)的白细胞和淋巴细胞的浓度；
图13：图13示出了在不同的研究时间，对照批次(非操作(Non op))、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Composite)、脱细胞骨和阳性对照(C pos)(非临界)的骨代谢血清标记物的浓度(CTX：骨吸收；P1PN和Oc：骨合成)；
图14A：图14A示出了在不同的研究时间，对照批次(非操作(Non op))、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Compo)和阳性对照(C pos)(非临界)1或3个月后在骨缺损区域内形成的骨量；
图14B：图14B示出了在不同的研究时间，对照批次(Non opérés)、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Compo)和阳性对照(C pos)(非临界)的骨缺损的骨量/初始体积比；
图15A：图15A示出了在不同的研究时间，对照批次(Non opérés)、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Compo)和阳性对照(C pos)(非临界)1或3个月后在骨缺损区域内形成的表面积；
图15B：图15B示出了在不同的研究时间，对照批次(Non opérés)、空白对照(“Témoin vide”)、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(“Elastomère”)、根据本发明的骨替代材料(Compo)和阳性对照(C pos)(非临界)的骨缺损的骨表面积/初始体积比；
图16：图16示出了3个月后“对照”批次的骨缺损仍然是空的，((A)：3D微断层扫描的俯视图，(B)：3D微断层扫描的侧视图)；
图17A：图17A示出了3个月后“阳性对照”(positive control)批次的非临界尺寸的骨缺损在3D微断层扫描中的俯视图；
图17B：图17B示出了3个月后“阳性对照”(positive control)批次的非临界尺寸的骨缺损在3D微断层扫描中的侧视图；
图17C：图17C示出了1个月后“阳性对照”(positive control)批次的非临界尺寸的骨缺损用马松三色染色的组织切片(放大率×5)；
图17D：图17D示出了“阳性对照”批次的骨缺损的中心区域的细节(插入图像C，放大率×40)；
图18A：图18A示出了1个月后单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体批次的临界尺寸的骨缺损在3D微断层扫描中的顶视图；
图18B：图18B示出了3个月后单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体批次的临界尺寸的骨缺损在3D微断层扫描中的顶视图；
图18C：图18C示出了1个月后单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体批次的临界尺寸的骨缺损用苏丹黑染色的组织切片(放大率×2.5)；
图18D：图18D示出了1个月后用马松三色染色的单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体批次的骨缺损的中心区域的细节(插入图像C，放大率×40)；
图19：图18B示出了3个月后单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体批次的骨缺损((A)：2D微断层扫描的侧视图，(B)：3D微断层扫描的侧视图，和(C)：3D微断层扫描的底视图)；
图20：图20示出了3个月后“脱细胞骨”批次的骨缺损的3D微断层扫描中的侧视图；
图21A：图21A示出了1个月后根据本发明的多孔骨替代材料“复合材料”批次的临界尺寸的骨缺损在3D微断层扫描中的顶视图；
图21B：图21B示出了3个月后根据本发明的多孔骨替代材料“复合材料”批次的临界尺寸的骨缺损在3D微断层扫描中的俯视图；
图21C：图21C示出了1个月后根据本发明的多孔骨替代材料“复合材料”批次的临界尺寸的骨缺损用马松三色染色的组织切片(放大率×2.5)；
图21D：图21D示出了根据本发明的多孔骨替代材料“复合材料”批次的骨缺损的中心区域的细节(插入图像C，放大率×40)；
图21E：图21E示出了1个月后根据本发明的多孔骨替代材料“复合材料”批次的非临界尺寸的骨缺损用马松三色染色的组织切片(放大率×2.5)；
图21F：图21F示出了根据本发明的多孔骨替代材料“复合材料”批次的骨缺损外区的细节(插入图像C，放大率×40)。
实施例
实施例1：根据本发明的多孔骨替代材料的配方和合成
首先，研磨
然后，在通过poly-HIPE法(高内相乳液的形成和聚合/交联)合成基于聚(己内酯-脲-氨酯)的弹性体过程中，这些颗粒被并入到由该弹性体组成的弹性基体中。对几种异体弹性体基体/骨的比例进行了测试。
这些步骤对人类来源的脱细胞异体骨
所使用的保留的成分是：
-骨替代材料A，异体弹性体/骨基体比例为100％(1g/1g)，即骨质量分数为50％，粒度在300和400μm之间；
-骨替代材料B，异体弹性体/骨基体比例为50％(1g/0.5g)，即骨质量分数为33％，粒度在300和400μm之间。
如果骨的比例高于50％，会导致骨替代材料的结构损失。
根据本发明的骨替代材料的物理化学性能通过以下方式进行测试：
-傅立叶变换红外光谱(FTIR)用于分析合成的替代材料中存在的化学功能；
-扫描电子显微镜(SEM)用于替代材料的形态观察，同时进行元素分析(EDX)；
-测量体积吸收率以确定多孔结构的相互连通性；
-茜素红着色法用于评估和显现异体骨颗粒在替代材料内的结合情况。这种染料是钙质沉积的特异标记物。
为清楚起见，下面详细描述的结果是针对骨质量分数为33％并且包括直径为300至400μm的骨颗粒的骨替代材料B。
清洗后，骨替代材料的密度通过比重瓶法进行了评估。
与单独的基体(1.05)或单独的骨(2.59)相比，发现的数值为1.29，表明骨颗粒仍然存在于弹性体基体中。与最初引入乳液的质量分数33％相比，发现清洗后骨的质量分数为31％。脱细胞骨颗粒似乎均匀地分布在骨替代材料的内部和表面上(图1)。此外，对体积吸收率的测量表明，多孔结构的相互连通性因骨颗粒的并入仅发生非常轻微的变化，仍然大于80％。这一数值与液体的良好渗透和细胞迁移相匹配(rv单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体＝100.8±8％，而rv复合材料＝86.4±2％)。
EDX分析(表1)和FTIR(图2)证实了多孔骨替代材料中由于脱细胞骨颗粒而存在钙和磷。
表1：通过EDX分析单独的脱细胞骨颗粒、单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的骨替代材料(复合材料)得到的基本成分(由于仪器的灵敏度限制，与实验的对比没有考虑氮)。
元素分析显示，根据材料合成过程中并入的骨量的理论上的预期值与材料清洗后的实验值之间存在良好的相关性。这再次证明了骨颗粒在弹性体基体中的存在。
弹性体基体的化学结构并没有被修改，因为发现了所有与这个基体相关的峰(图2)。
对机械性能的研究需要生产更大直径的样品，并且对合成步骤进行验证。一旦后者完成，根据本发明的骨替代材料和单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体的弹性体性质通过机械压缩试验得以体现：根据本发明的骨替代材料与单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体的应力-变形曲线相似，证明了材料的弹性性质(图3)。
多孔材料的杨氏模量E可以定义在曲线的第一个线性部分。发现根据本发明的骨替代材料的数值为228kPa，这属于弹性体泡沫的范围(1
在生产用于组织工程学的骨替代材料的过程中，一个重要的标准是其可吸收性，因为它必须随着时间的推移被新形成的骨取代。有研究认为对于骨组织的再生，骨替代材料必须具有降低的亲水性，从而使降解速率可以超过18个月。体外降解研究是根据标准ISO10993-13执行。降解动力学最主要通过测量质量损失进行评估。90℃下的加速降解试验表明，骨替代材料的降解略快于单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体(图4)。这是由于材料的亲水性增加，这一点从与水的接触角的测量中可以得到证实： 单独使用聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体的θ＝121±10°，而使用骨替代材料的θ＝83±22°。 因此，单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体在90℃下稳定了14天。应用“十分法”给出温度升高十度时降解速率增加的关系，并且采用2-2.5的Q10系数[ASTM F 1980-02:无菌医疗器械包装的加速老化试验标准指南]，单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体在37℃下的寿命估计为19.4至63.4个月。 对于骨替代材料，在90℃下的寿命为10天，这使在37℃下的寿命估计在13.0至42.3个月之间。这种稳定性适合于将骨替代材料用作骨再生的支撑。 实施例3：根据本发明的多孔骨替代材料与从犬科脂肪组织中获得的间充质基质细胞(CSM)之间的相互作用
首先，根据标准ISO 10993-5和10993-12，研究了根据本发明的骨替代材料可能释放的提取产物的细胞毒性。 因此，将示例1中获得的骨替代材料和单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体在标准培养基中于37℃孵育24小时。然后将这种提取介质沉积在MSC 80％汇合的垫子上。孵化24小时后，通过MTT剂量测量细胞的代谢活性。 结果如图5所示。 该标准规定，产品的细胞活性限制为70％，才能被认为是无细胞毒性的。 所得结果显示，对照细胞与被放置在单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体或根据本发明的骨替代材料(复合材料)的提取介质中的细胞在代谢活性方面没有差异。这个代谢活性大于90％，因此达到了标准规定的极限。这些结果表明，在这些条件下，这些材料的提取产物不具有细胞毒性。其次，通过间接细胞毒性试验评估细胞毒性产物释放的效果。为此，在没有直接接触的情况下，将这些材料沉积在CSM上面达到80％的汇合。在37℃下孵育24小时后，通过锥虫蓝染色测量细胞活性。 结果如图6所示。 获得的细胞存活率大于80％并且在对照和被放置在单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体或根据本发明的骨替代材料(复合材料)中的细胞之间具有可比性。24小时后，支架-细胞的间接相互作用不会在培养基中产生细胞毒性化合物。
为了测试根据本发明的骨替代材料(复合材料)和单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体的“吸引”力，用犬科CSM进行了定植试验。根据本发明的骨替代材料(复合材料)和单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体分别以80％的汇合沉积在CSM的床上。 在D10、D20、D30和D40测定细胞迁移。 结果如图7所示。 在经过酶处理的细胞分离后，对存在于根据本发明的骨替代材料(复合材料)和单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体上和内部的细胞进行计数。获得的结果表明，细胞能够迁移到材料中。 结论：所有这些结果证明，根据本发明的骨替代材料(复合材料)是没有毒性的，细胞能够粘附在其上面并且在其中增殖，而且无论培养条件如何，它们甚至深度定植，证明了其骨诱导性质。 实施例4：骨替代材料(复合材料)在大鼠节段性缺损模型上的修复力的体内研究 该研究是基于大鼠(Lewis，雄性，7-9周，1月育种)节段性骨缺损的重构。可以评估生物材料在真实条件下的生物相容性、生物降解性和有效性成为可能，这种类型的病变与军队或平民受害者在攻击或交通事故等经常遇到的那些相似。 节段性骨缺损模型在于取出一段骨，消除所获得的两个骨段之间的任何连续性，并且不允许自发修复。这种骨缺损的临界尺寸被定义为等于(至少)1.5至2倍的骨直径。 为了评估根据本发明的骨替代材料(复合材料)相对于单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体的有效性，对几批动物进行了监测，直至病变/植入后3个月。通过对安乐死后取出的股骨进行微断层扫描和组织学来评估骨修复的效率。动物的血液被用来进行血液计数/配方和ELISA(血清)剂量，用于骨形成和吸收的标记物。 每次使用6只动物的批次，1和3个月，即总共60只动物。右侧股骨进行手术，左侧股骨作为参考。 ·“对照”批次：空的缺损，无植入物 ·“单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体”批次 ·“根据本发明的骨替代材料(复合材料)”批次(配方为33％的骨，粒度为300-400μm) ·“阳性对照”批次：非临界(空白对照(“témoin vide”))尺寸缺损 ·“对照批次”(Non op.)对应的是没有进行手术但进行了麻醉和镇痛的动物。 大鼠节段性骨缺损模型在于在股骨干上制成不允许自发修复的部分。这种骨缺损的临界尺寸是5到6mm，这是一个在这种啮齿动物模型中已经确立的长度。在骨干处切开骨头，用适合大鼠股骨的固定器稳定两个骨端(图8)。这个固定器由4个直径为1.1mm的不锈钢螺钉(Synthes)固定在股骨的上面上。
麻醉/镇痛：麻醉：氯胺酮/美托咪定：60/0.5mg/kg肠内注射。 唤醒：阿替美唑，1mg/kg肌肉注射 镇痛：丁丙诺啡，术后0.05mg/kg(醒来后每天3次，持续3天)，皮下注射(SC)。
·小腿后侧+背部的剪切；用必达净(betadine)消毒；确定手术大腿的外侧； ·皮肤和外侧的腱膜的切开(20-30mm)，用圆尖头手术凿展开肌肉平面，以暴露股骨中央部分(骨干)，而不损伤血管； ·安装固定器(钢板或PEEK，L＝23mm)，用持针器固定在股骨的上面上； ·在连续的生理盐水冲洗下钻出用于接收螺钉的孔(直径为1mm的钻头)；定位4颗经皮螺钉； ·用振荡锯(ConMed)锯出骨的横切面，并且切除骨节段(图11)，用生理盐水精细注射清洗孔的内部； ·将植入体放入骨缺损处； ·将肌肉面合拢。如有必要，增加2至3个独立的点(可吸收线)。用5mm的针封闭皮肤面。 ·局部应用必达净； ·醒来后，将动物侧卧在笼子里的热板上的干燥薄单上； ·术后护理：在醒来时皮下镇痛，持续3天(每天3次)。 动物在醒来后立即使用其身体部分进行手术。每天对动物进行监测：伤口干净，没有发炎的外部迹象，当骨接系统稳定时，没有发现跛行或行为的改变。在整个研究过程中，所有批次的体重曲线都是相似的，手术后的恢复阶段大约为15天。
生物材料(根据本发明的骨替代材料(复合材料)和单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体是长度为10至15mm、直径为4mm的柱体(图9A)。它们在植入前一天以无菌方式在包装介质中制备，并在37℃和5％ CO 所用的包装介质包含DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)；青霉素/链霉素0.8％；二性霉素B1％。 生物材料保持其完整性，在植入时不会破裂。 两种类型的生物材料——单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体和根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)——似乎是射线可透过的，这将使放射学监测更加容易，使新合成的骨质能够被观察到。 只有复合材料内的
在1、3、6、12天，然后每10至15天，用辐照器(SARRP)在成像模式下进行放射学监测，可以验证骨合成系统的完整性和骨缺损内矿化骨的出现(图10A)。在骨接系统失效的情况下，如图10B所示，最远端的螺钉31天后开始脱离，动物被安乐死，股骨被回收进行分析。 对图像的定性分析显示，在手术后一个月内没有骨形成。三个月后，在缺损内可看到或多或少的骨痂，在“根据本发明的骨替代材料(复合材料)”组的一半动物中，两个片段之间恢复了连续性。
在牺牲前对麻醉大鼠进行心内穿刺从EDTA-K3采集血液，以便执行血细胞计数(Procyte DX-IDEXX兽医血液学仪器)，以便检测异常炎症，或生物材料对血液配方的可能影响。还从收集的血液中制备血清，不加抗凝剂，在1500g下离心10分钟，用于骨修复标志物的ELISA定量测定。 关于红细胞水平，与未手术的动物相比，在1个月和3个月时的产生仍很可观，但在每个批次和每次都没有发现明显变化。血小板浓度没有变化(图11)。 所有批次的炎症总体水平相似(图12)，与未手术大鼠的基本水平相似，没有记录到明显的差异：因此，单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体或根据本发明的骨替代材料(复合材料)机体能很好地耐受，在这个大鼠模型的这些后期，不会增强由于骨创伤引起的炎症反应。 重建的直接标志物(图13)证明了合成活性(Oc，P1NP)和骨吸收活性(CTX1)。然而，对动物来说，对其定量测定的解释是困难的，因为它们的水平可能取决于，例如，白天/夜晚的周期。P1NP(1型原骨胶原的N端前肽)的观察值反而反映了成骨细胞增殖的阶段。这些值在这里比未手术的动物低4至5倍(53.20±2.89ng/mL)。然而，脱细胞骨的批次的值在3个月时高出2倍(25.52±11.34ng/mL)。 骨钙素(Oc)是骨合成的血清标志物(反映成骨细胞的矿化活性)，在一个月和三个月时，所有批次的骨钙素浓度仍然低于未手术大鼠的浓度(1031.35±59.06ng/mL)。然而，需要注意的是，植入各种生物材料的批次在3个月时的值与正在进行完全重建的阳性对照组的值相似(625.65±41.15ng/mL)。这些值比对照批次(空的缺损)观察到的值高3倍，因为没有观察到重建(221.40±19.50ng/mL)。 所有这些值都反映了放置生物材料时产生的成骨细胞的高活性，即使它们的数量仍然低于在未手术的动物中发现的数量。CTX1(1型胶原蛋白羧基末端端肽)是通过组织蛋白酶K途径，即主要的骨重构途径进行的骨吸收水平的标志物。当骨缺损保持为空时(7.89±0.87ng/mL)，其浓度低于未手术的动物(9.24±0.52ng/mL)，反映了低重塑活性，与骨组织的低新生合成有关。当单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体、根据本发明的多孔骨替代材料(复合材料)或脱细胞骨在1个月和3个月后被植入时，这个浓度与未手术动物的浓度相当，表示新形成的矿化组织的重建正在进行中。
当股骨被固定在Burckhardt溶液中以进行后续的组织学分析时，它们被用微断层扫描(Skyscan 1174)进行分析，参数如下：50kV；800mA，对节段性缺损处的骨新生矿化进行可视化和量化。对具有固定器的完整股骨进行快速采集(40至70min)，分辨率为50至60μm，然后根据取样时观察到的矿化水平和“固体度”，除去固定器，进行更好的采集(分辨率为14至20μm，2至3小时)用于分析。测量区与初始骨缺损区相对应。 采集的数据由量化软件(CTan,Skyscan)处理，经由BV/TV比(骨量/组织量)可以查看和量化骨缺损层面的骨重建情况，该比将新形成的骨量转化为一定的体积。 图14A可以量化骨缺损区域的骨量。在一个月和三个月时，与未手术的动物相比，对照动物的这个值仍然比未手术的动物低3倍(31.11mm 植入根据本发明的骨替代材料(复合材料)在三个月时形成的骨量是未手术动物的2.5倍(68.60±26.02mm 然而，当这个形成的骨量恢复到缺损区的初始体积时(图14B)，所有批次获得的值集仍然小于未手术动物中发现的值(41.1)。这个值反映了骨在限定区域内的比例，能够评估正在进行的修复过程的各个阶段。事实上，骨修复包括活跃的合成阶段，然后是有点长的骨痂重构阶段。在这个最后阶段，根据所涉及的骨的区域，在这种情况下是皮质骨，对骨进行重新设计和重构，以使机械性能得到恢复。 骨表面(BS)与骨缺损体积(BV)比率(BS/BV)的镜像反映了形成的骨的结构水平(图15A和图15B)。对于对照动物，高比率(15.10±5.49mm
所有在微断层扫描中获得的数据与通过组织学分析获得的局部数据有关，并且在同一样品上相继进行。取出的股骨被固定在Burckhardt溶液中，并且被包括在适合硬组织的MMA树脂(甲基丙烯酸甲酯)中。 厚的切口(以便生物材料不被撕裂)然后用不同细胞类型的特定染料进行染色： -马松三色(TM)，将矿化组织染成蓝色，突出了负责形成的细胞：成骨细胞，和负责骨重构的细胞：破骨细胞，以及骨样矿化区域(为粉红色)和血管。 -苏丹黑(NS)，将聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体染成黑色， -天狼星红(RS)，将胶原纤维染成光学显微镜下的红色，和偏振光下的黄色/橙色。能够显现组织的结构水平。
图16示出了获得的结果。 骨缺损仍然是空的，在研究的3个月中没有观察到缺损内重构(图16)。仅在边缘形成骨，一些动物在固定器下显示出骨合成的苗头(图16)。缺损被纤维组织填充。这证实了骨缺损的临界尺寸。
骨缺损的大小在这里不是临界的，是代表简单骨折。3个月后，当这个尺寸约为2mm时，可观察到几乎完全重构(图17A)。1个月后在骨边缘再次发现了非常活跃的矿化区域，如图17C中的箭头所示，以及缺损中心的软骨内骨化区域(图17D)，可能与该系统的某种“弹性”有关。这是因为大鼠是活跃的、动态的，这个区域要经受高的机械应力。 图17B中能够观察到，当缺损的尺寸小于1mm时，3个月后就可以完全修复，恢复骨的连续性(仅锯切)。 图17A至图17D示出了获得的结果。
植入一个月后的重构水平较低(图18A)，仅在骨边缘。然而，用苏丹黑染色允许显示位于缺损中心的单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体，并且部分地与新生合成的骨结合(图18C)。 可以注意到，单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体已经发生了宏观结构的改变：海绵已经“变平、展开”，正如我们在先前的研究中在一个腔隙性缺损中一个月时所观察到的。马松三色染色使得可以观察到骨样区域——对应于被成骨细胞矿化的区域——在这部分周围有许多与骨紧密结合的区域(图18D，由箭头表示)。此外，在单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体内就可看到生物材料，这证明了后者的孔隙度保持不变。 3个月后获得的3D重构图(图18B)显示了缺损的部分重构，几乎恢复了连续性。毫无疑义地发现，单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体的骨诱导性先前已在腔隙性骨缺损模型上得到证明。 然而，对于某些样品，注意到在单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体存在的情况下，缺损内新形成的骨有一种特殊的小梁结构(图19)。此外，在固定器的两端观察到轻微的骨合成，似乎是“靠”在后者上，在图19中由箭头定位。
为了验证生物相容性和骨传导性能，用直径为2mm的
以颗粒的形式将脱细胞骨并入聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体，改变了重构过程。事实上，一个月后，骨边缘上形成了骨，这能够通过骨的马松三色染色来识别，在这个水平上有许多骨样区域(图21C和图21D)。然而，骨缺损的区域总是空的；脱细胞骨的颗粒清晰可见，并且相对于这个区域或多或少地集合在一起，偏离中心(图21A)。然而，注意到一种强烈的“非定域”骨合成，固定器上覆盖着一层矿化层。这在3个月后更加明显(图21B)，固定器的远端和近端完全被骨覆盖。这时，骨的合成很旺盛，缺损区域几乎得到了修复：一半的动物恢复了连续性，缺损处几乎被矿化组织填满。组织学分析将可以验证这种新形成的骨的结构及其重构水平。 在某些样本中，矿化颗粒被发现完全在待重构的区域外，被困在骨组织和周围肌肉之间。在这里，组织学分析也将使得可以知道这些是否是已经迁移到缺损区域之外的脱细胞骨的残留颗粒，没有被吸收，或者这些是外部矿化灶。 事实上，在某些组织学剖面上，从一个月开始就可以看到位于骨缺损外的矿化过程中存在或多或少的扩散区域(图21E和21F)。 结论： 骨的形成通常地发生在生物材料的周围和较小的范围内。根据本发明的多孔骨替代材料的多尺度多孔性似乎是一个积极的因素，因为在其中检测到几个骨化灶，表明分化和活跃的细胞可能已经迁移到这个区域，可能伴随着血管。 这些组织学分析也使得可以可见骨缺损内的根据本发明的多孔骨替代材料：这种材料看起来是零散的，部分被包含在矿化组织中，证明与修复动力学一致的降解和生物整合。根据本发明的多孔骨替代材料的体内寿命估计为13至42个月。这一寿命与临床使用相适应。 组织学分析证实了从植入的第一个月就可以看出根据本发明的多孔骨替代材料的骨传导性质性和降解性，同时也证实了骨的形成。 所有的结果表明，根据本发明的多孔骨替代材料具有良好的机械性能，良好的生物相容性和降解性，适应于骨组织的重构。它通过诱导强烈的骨合成而具有关注体内表现，直到两个骨碎片之间的组织连续性得到恢复。根据本发明，多孔骨替代材料中脱细胞骨的存在增加了矿化组织的产生，这比用单独的聚(己内酯-脲-氨酯)弹性体基体三个月后获得的矿化组织要多三倍。然而，这种旺盛的生产不仅位于骨缺损内部，而且也发生在固定器周围。在骨组织和周围的肌肉之间已经发现了几个矿化区域。