一种非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针及检测方法。

背景技术

荧光PCR检测技术现已广泛被应用于检测行业，诸如新冠检测、非瘟检测。现目前荧光PCR检测有两种技术，分别是染料法和探针法。目前市面上的商品化非瘟荧光PCR检测试剂盒均是采用的探针法，探针法具有敏感性高、杂交稳定性高、特异性强的特点，是染料法所无法比拟的。但目前现有的商品化非瘟荧光PCR检测试剂盒价格高、质量参差不齐，大量使用商品化非瘟荧光PCR检测试剂盒对于养殖企业来说，无疑不利于降本增效。且现有的检测试剂盒还存在灵敏度低、检测结果误差较大等缺点。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提出一种非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针及检测方法。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案之一是：一种非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针，包括荧光PCR特异性引物和荧光PCR探针，其中，所述荧光PCR特异性引物的核苷酸序列包括：

上游引物：5’-AATGGGCCATTTAAGAGC-3’；

下游引物：5’-TACGTGTCCATAAAACGC-3’；

荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’(FAM)-TCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGG-3’(TAMRA)，该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团FAM，3’端结合有荧光淬灭基团TAMRA，荧光基团报告基团由FAM改为VIC、HEX、Cy5等，

荧光淬灭基团由TAMRA改为BHQ1、BHQ2、MGB等均可实现同样的检测效果。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案之二是：一种非洲猪瘟荧光PCR检测方法，利用前面所述的引物与探针组合，结合反应酶，对待测样品进行荧光PCR检测，该反应体系的总体积为25μL，其中：反应酶12.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、探针0.25μL、模板5μL，余下为无菌无酶水；

反应条件如下：94℃预变性30s；94℃5s，60℃30s，采集荧光信号，45个循环；

根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果:待检测样品的检测结果的Ct值小于或等于35，为阳性，表示样品中存在非洲猪瘟病毒；待检测样品的检测结果的Ct值大于35小于等于45时，则报告为可疑，需重复此样品的检测；待检测样品的检测结果无Ct值，或无典型的扩增曲线，则报告为阴性，表示样品中不存在非洲猪瘟病毒。

本发明的非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针及检测方法，引物和探针具有优良的敏感性与特异性，极大地减少了可能出现的因引物探针错配导致的漏检，且具有极佳地重复性，能有效降低检测成本，为非洲猪瘟防控工作提供有效的手段，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例荧光PCR扩增非洲猪瘟p72基因曲线图。

具体实施方式

为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本公开实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本公开的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

在本实施例一中，本发明的一种非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针组合，包括荧光PCR特异性引物和荧光PCR探针，针对非洲猪瘟病毒p72基因序列截选一段50-150bp区域进行引物与探针的初设计，再使用DNAStar软件进行评估以及采用BLAST方法进行特异性分析，选取合适的引物与探针对进行综合评估测试。其中，所述荧光PCR特异性引物的核苷酸序列包括：

上游引物：5’-AATGGGCCATTTAAGAGC-3’；

下游引物：5’-TACGTGTCCATAAAACGC-3’；

荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’(FAM)-TCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGG-3’(TAMRA)，该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团FAM，3’端结合有荧光淬灭基团TAMRA。

非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针组合，结合反应酶使用的检测方法，具体为：

该反应体系的总体积为25μL，其中：反应酶12.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、探针0.25μL、模板5μL，余下为无菌无酶水；

反应条件如下：94℃预变性30s；94℃5s，60℃30s，采集荧光信号，45个循环；

根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果:待检测样品可以是血清样本，还能应用于肝脏、淋巴结等多种组织样本,本实施例待检测样品采用活猪血清，检测结果的Ct值小于或等于35，为阳性，表示样品中存在非洲猪瘟病毒；待检测样品的检测结果的Ct值大于35小于等于45时，则报告为可疑，需重复此样品的检测；待检测样品的检测结果无Ct值，或无典型的扩增曲线，则报告为阴性，表示样品中不存在非洲猪瘟病毒。

本实施例的特异性测试：

将非洲猪瘟病毒基因组作为模板，采用上述引物与探针组合使用方案进行检测，同时设置猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环2型病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒基因组作为非特异性对照。荧光PCR检测结果显示，非洲猪瘟病毒靶序列可被检出(图1)，与目前基于p72序列的荧光检测方法相当。而且其他病毒(即猪细小病毒、猪瘟病毒等)基因组作为非特异性对照未出现荧光信号(图1)，表明该引物与探针组合特异性较好，可用于非洲猪瘟病毒的检测。

体系中各添加量对检测结果的影响试验：

总体系为25μL，反应酶添加量为12.5μL、探针添加量为0.5μL、模板添加量为5μL，上下游引物添加量依次变化为0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL，最终添加无菌无酶水补充反应体系至25μL。

同一份阳性质粒样品经过荧光PCR检测结果如下表1：

表1

从上表结果数据分析可知，探针添加量固定为0.5μL，当上下游引物添加量为0.5μL时，Ct值的平均值最低且标准差最小。

总体系为25μL，反应酶添加量为12.5μL、上下游引物添加量为0.5μL、模板添加量为5μL，探针添加量依次变化为0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL，最终添加无菌无酶水补充反应体系至25μL。

同一份阳性质粒样品经过荧光PCR检测结果如下表2：

表2

综上所述，该所述引物与探针组合最优反应体系为：探针添加量为0.25μL、上下游引物添加量为0.5μL。

重复性与稳定性试验：

制备4份不同Ct值的非洲猪瘟病毒强阳样品(Ct＜35)，每份样品重复测3次得Ct值，间隔12小时后再次同样使用荧光PCR测得每份样品的Ct值，得结果如下表3：

表3

以上数据表明，所述引物与探针组合针对非洲猪瘟病毒检测批次内变异系数小于2％，批次间变异系数小于2％，表明该方法具有良好的重复性与稳定性。

本发明的非洲猪瘟荧光PCR检测引物与探针及检测方法，引物和探针具有优良的敏感性与特异性，极大地减少了可能出现的因引物探针错配导致的漏检，且具有极佳地重复性，本发明中所提供的引物与探针对其自身自由能较高，不会产生自身干扰，能有效降低检测成本，为非洲猪瘟防控工作提供有效的手段，具有广泛的应用前景。

以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。