一种牙齿矿化抗菌双功能凝胶、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用材料制备技术领域，涉及一种牙齿矿化抗菌双功能凝胶、制备方法及应用。

背景技术

龋病是危害人类健康的常见病和多发病，通常始于牙釉质表面及其下方的脱矿。白斑是临床上最常见的早期牙釉质脱矿，表现为牙釉质表面的白色斑块，不仅影响美观，而且妨碍牙体健康，不及时防治，易造成进一步的牙体组织脱矿从而导致严重龋病。目前临床上针对釉质白斑的防治材料，主要包括含氟产品，如：含氟牙膏、漱口液、凝胶、清漆等；含钙磷成分产品，如：护牙素、生物活性玻璃等；牙科修复材料，如：渗透树脂、全瓷修复体等。但上述材料的临床效果仍存在争议，主要涉及生物安全性、再矿化效果、树脂耐久性、牙体组织损害等问题，目前临床上还没有可使白斑有效逆转的口腔材料，这也成为一个亟待解决的难题。

随着现代微创牙科理念的提出，生物矿化技术已成为龋病防治的趋势。特别是，迫切需要能够释放大量生物活性Ca

牙体硬组织的主要无机成分是非化学计量比的羟基磷灰石，阳离子如Na

发明内容

基于此，本发明提供了一种牙齿矿化抗菌双功能凝胶、制备方法及应用，矿化所得牙齿矿化抗菌双功能凝胶的主要活性成分为杂合无定形磷酸钙，杂合无定形磷酸钙粒径为30-40nm，外形为规则的球形颗粒，并掺杂不同金属离子和氟离子，具有抗菌、促矿化等性能。制备方法简单易行，制备成本低廉，便于大规模生产和临床推广使用。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种牙齿矿化抗菌双功能凝胶的制备方法，其包括下述步骤：

1)将稳定剂、钙盐和至少一种金属离子盐添加剂溶于溶剂中得到混合液，然后加入凝胶剂，溶胀均匀，得到凝胶i；

2)将磷酸盐和氟化物溶于溶剂中得到混合液，调整溶液的pH至8～12，然后加入凝胶剂，溶胀均匀，得到凝胶ii；

3)将步骤1)得到的凝胶i与步骤2)得到的凝胶ii按比例混合均匀，得到牙齿矿化抗菌双功能凝胶。

进一步的，所述步骤1)中，各组分以重量份计为：稳定剂10～100份、钙盐50～500份、金属离子盐添加剂50～250份、凝胶剂50～200份、溶剂50～2000份。

进一步的，所述步骤2)中，各组分以重量份计为：磷酸盐50～500份、氟化物10～50份、凝胶剂50～200份、溶剂50～2000份。

进一步的，步骤3)中所述的按比例混合为，通过凝胶剂i和凝胶ii配比的选择，使得牙齿矿化抗菌双功能凝胶中，钙和金属离子盐添加剂中的金属离子的摩尔比为1～10：1；钙和金属离子盐添加剂中的金属离子之和与磷的摩尔比为1.3～2.1：1。

本发明还提供了所述方法制备得到的牙齿矿化抗菌双功能凝胶，所述牙齿矿化抗菌双功能凝胶的活性成分是杂合无定形磷酸钙，杂合无定形磷酸钙的粒径为30-40nm，外形为球形颗粒，掺杂有金属离子盐添加剂中的金属离子和氟离子。

本发明以凝胶剂为载体并借助聚天冬氨酸等稳定剂来螯合游离钙离子、掺杂金属离子、磷酸盐离子和氟离子，从而获得杂合无定形磷酸钙凝胶。这种矿化方法简单易行，使用前双组份凝胶可分开储存，使用时杂合ACP可即刻合成，不同金属离子杂合程度可控，Ca/P及Ca/F比可调，杂合ACP稳定性可控，产物尺寸形貌可控。

本发明还提供了一种所述杂合无定形磷酸钙凝胶套装在制备牙齿仿生矿化的药物中的应用。优选的，所述牙齿仿生矿化的药物为牙齿白斑防治药物、早期龋病治疗药物或牙齿脱敏治疗药物。

与现有技术相比本发明具有以下优势：

(1)本发明制剂的主要活性成分是杂合无定形磷酸钙，由于采用钙和磷分开双组份模式，可在使用时即刻混合新鲜制备杂合无定形磷酸钙，避开了无定形磷酸钙在水介质中过早向结晶磷灰石转变的问题，保证了产物具有良好的矿化活性。

(2)本发明制剂含有的无定形磷酸钙材料的相稳定性和杂合程度可控，赋予其良好的矿化和抗菌性能。

(3)本发明提供的牙齿矿化抗菌双功能凝胶的制备方法简单易行，不需大型仪器设备，生产效率高、成本低，适于大规模生产，可用于牙齿白斑、早期龋病、牙本质敏感等口腔疾病的防治，具有巨大的市场前景。

附图说明

图1凝胶制剂的FTIR+XRD+SEM图；

图2凝胶制剂相稳定性的FTIR图；

图3抑制牙釉质白斑形成的数字摄影+Micro-CT图；其中，a)数字摄影图像显示本发明制剂处理组在4周pH循环过程中牙釉质样本表面颜色改变最小。b)Micro-CT图显示经过4周的pH循环，本发明制剂处理组的牙釉质矿物质损失及脱矿深度最小。

图4治疗早期牙釉质龋的SEM图。

具体实施方式

下面通过实施案例对本发明作进一步说明，为本发明的优选例。凡在本发明的原则之内所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。

本发明提供的牙齿矿化抗菌双功能凝胶，一般可按如下步骤进行制备：

1)将稳定剂、钙盐和至少一种金属离子盐添加剂溶于溶剂中得到混合液，然后加入凝胶剂，溶胀均匀，得到凝胶i；步骤1)中，各组分以重量份计为：稳定剂10～100份、钙盐50～500份、金属离子盐添加剂50～250份、凝胶剂50～200份、溶剂50～2000份。

2)将磷酸盐和氟化物溶于溶剂中得到混合液，调整溶液的pH至8～12，然后加入凝胶剂，溶胀均匀，得到凝胶ii；步骤2)中各组分以重量份计为：磷酸盐50～500份、氟化物10～50份、凝胶剂50～200份、溶剂50～2000份。

3)将步骤1)得到的凝胶i与步骤2)得到的凝胶ii按比例混合均匀，得到牙齿矿化抗菌双功能凝胶；步骤3)中所述的按比例混合为，通过凝胶剂i和凝胶ii配比的选择，使得牙齿矿化抗菌双功能凝胶中，钙和金属离子盐添加剂中的金属离子的摩尔比为1～10：1；钙和金属离子盐添加剂中的金属离子之和与磷的摩尔比为1.3～2.1：1。

其中，作为本发明的优选实施方案，所述稳定剂为聚葡萄糖酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸、聚马来酸、聚谷氨酸、聚乙烯基膦酸、羧甲基壳聚糖、乙二胺四乙酸、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠的任意一种或多种的组合；

作为本发明的优选实施方案，所述钙盐为可溶性钙盐，选自氯化钙和/或其水合物、乙酸钙和/或其水合物、乳酸钙和/或其水合物、柠檬酸钙和/或其水合物、碳酸氢钙、磷酸二氢钙中的任意一种或多种的组合。

作为本发明的优选实施方案，所述金属离子盐添加剂选自可溶性银、锌、锶、镁、铜、镓、锰、铈、锆、钛的硝酸盐、硫酸盐或氯化物中的任意一种或多种的组合。

作为本发明的优选实施方案，所述步骤1)和步骤2)中，所述凝胶剂为甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、丙烯酰胺类聚合物、丙烯酸类聚合物、乙烯醇类聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基壳聚糖、木质素、海藻酸钠、琼脂、淀粉、胶原、透明质酸和多肽类化合物中的任意一种或多种的组合；

作为本发明的优选实施方案，所述溶剂为去离子水、任意比的甘油去离子水溶液、任意比的乙醇去离子水溶液。

作为本发明的优选实施方案，所述磷酸盐为可溶性磷酸盐，选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵中的任意一种或多种的组合；所述氟化物为氟化亚锡、氟化钠、氟化钾、氟化银、单氟磷酸钾、氟硅酸钠中的任意一种或多种的组合。

本发明提供的牙齿矿化抗菌双功能凝胶可以直接采用上述方法进行制备，制备得到的牙齿矿化抗菌双功能凝胶可稳定存在4小时而不发生相变，作为一种可选的实施方式，所述牙齿矿化抗菌双功能凝胶在制备之前优先制备凝胶i和凝胶ii；凝胶i和凝胶ii分开存放，在需要制备牙齿矿化抗菌双功能凝胶时，再将两者混合。即使用时，将得到的凝胶i与得到的凝胶ii按比例混合均匀，得到杂合无定形磷酸钙凝胶；控制混合比例使杂合无定形磷酸钙凝胶中，钙和金属阳离子的摩尔比为1～10：1；钙和金属阳离子之和与磷的摩尔比为：1.3～2.1：1。

以质量份计，所述的凝胶i包含：稳定剂10～100份、钙盐50～500份、金属离子盐添加剂50～250份、凝胶剂50～200份、溶剂50～2000份；凝胶i制备方法为：将稳定剂、钙盐和金属离子盐添加剂溶于溶剂中得到混合液，然后加入凝胶剂，溶胀均匀，得到凝胶i；所述的凝胶ii包含：磷酸盐50～500份、氟化物10～50份、凝胶剂50～200份、溶剂50～2000份，凝胶ii制备方法为：将磷酸盐和氟化物溶于溶剂中得到混合液，调整溶液的pH至8～12，然后加入凝胶剂，溶胀均匀，得到凝胶ii。

实施案例1

本实施例的凝胶制备过程如下：

(1)以去离子水为溶剂，制备含0.8mol/L氯化钙、0.2mol/L氯化锌、36g/L聚天冬氨酸的混合溶液，按照每1mL混合溶液加入0.1g羟丙基甲基纤维素，充分溶胀后形成凝胶i；

(2)以去离子水为溶剂，制备含0.48mol/L磷酸氢二钠、4g/L氟化钠的混合溶液，并用氢氧化钠调节溶液pH为8～12，按照每1mL混合溶液加入0.1g羟丙基甲基纤维素，充分溶胀后形成凝胶ii；

(3)将凝胶i和凝胶ii等体积搅拌混合，获得含杂合无定形磷酸钙的牙齿矿化抗菌双重功能凝胶。

本案例实施的凝胶i和凝胶ii可以分开保存，使用前混合，可确保杂合无定形磷酸钙的相稳定性和矿化活性。

实施案例2

本实施例的凝胶制备过程如下：

(1)以去离子水为溶剂，制备含1.2mol/L氯化钙、0.3mol/L氯化锶、42g/L聚丙烯酸的混合溶液，按照每1mL混合溶液加入0.1g羧甲基壳聚糖，充分溶胀后形成凝胶i；

(2)以去离子水为溶剂，制备含1mol/L磷酸氢二钾、5g/L氟化钠的混合溶液，并用氢氧化钾调节溶液pH为8～12，按照每1mL混合溶液加入0.1g羧甲基壳聚糖，充分溶胀后形成凝胶ii；

(3)将凝胶i和凝胶ii等体积搅拌混合，获得含杂合无定形磷酸钙的牙齿矿化抗菌双重功能凝胶。

本案例实施的凝胶i和凝胶ii可以分开保存，使用前混合，可确保杂合无定形磷酸钙的相稳定性和矿化活性。

实施案例3

本实施例的凝胶制备过程如下：

(1)以去离子水为溶剂，制备含2mol/L氯化钙、0.1mol/L氯化铈、58g/L聚丙烯酸的混合溶液，按照每1mL混合溶液加入0.1g羟丙基甲基纤维素，充分溶胀后形成凝胶i；

(2)以去离子水为溶剂，制备含1.2mol/L磷酸氢二钠、5g/L氟化钠的混合溶液，并用氢氧化钠调节溶液pH为8～12，按照每1mL混合溶液加入0.1g羧甲基壳聚糖，充分溶胀后形成凝胶ii；

(3)将凝胶i和凝胶ii等体积搅拌混合，获得含杂合无定形磷酸钙的牙齿矿化抗菌双重功能凝胶。

本案例实施的凝胶i和凝胶ii可以分开保存，使用前混合，可确保杂合无定形磷酸钙的相稳定性和矿化活性。

实施案例4

将实施案例1获得的牙齿矿化抗菌双重性能凝胶进行傅里叶红外光谱(FTIR)测试、X射线衍射仪分析(XRD)、扫描电镜(SEM)和能量色散X射线光谱仪(EDX)分析。结果如图2所示，从图2可见，本发明的凝胶制剂表征结果A)FTIR图示在1061和572cm-1的特征红外吸收峰，表明该制剂含有无定形磷酸钙的矿化成分；B)XRD图示在2θ＝20°和2θ＝30°的弥漫性包峰，说明含有的磷酸钙成分为无定形相；C)SEM图凝胶剂中无定形磷酸钙为球形颗粒，粒径约为30-40nm。即本发明的凝胶中含有的磷酸钙盐成分为无定形矿物相；扫描电镜显示无定形磷酸钙为球形颗粒，均匀的分布在凝胶基质中，粒径为30-40nm；元素分析表明含有Ca、P、Zn、F、C、O、H的化学成分。

实施案例5

对实施案例1获得的牙齿矿化抗菌双重性能凝胶进行相稳定性检测。将即刻混合后的凝胶制剂置于人工唾液中37℃环境下孵育，于不同时间点取样进行FTIR测试。从图2的测试结果可以看出，凝胶中无定形磷酸钙活性成分可以在人工唾液中维持亚稳态长达4小时，这有利于其发挥良好的矿化潜能。

实施案例6

对实施案例1获得的牙齿矿化抗菌双重性能凝胶进行预防效果评估。

制备正常的牙釉质片：选取颗新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹、无斑点的人前磨牙供实验使用。在水冷却下，用Isomet精密切割机颊舌侧切取4mm×4mm×1.5mm的牙釉质块36个。使用碳化硅研磨纸将釉质外表面磨平并抛光，后用双层耐酸指甲油涂覆，余留3mm×3mm的开窗面。

将上述的凝胶制剂涂覆在牙釉质面上，放入5mL的人工唾液中孵育8小时，然后取出冲洗干净，再放入脱矿溶液中孵育16小时。每天更换新鲜的凝胶制剂和处理液，设置空白对照组(脱矿的牙釉质)和阳性对照组(临床常用再矿化制剂GC Tooth Mousse Plus)。置于37℃恒温箱中2周、4周取样。数字摄影、Micro-CT、SEM观察本发明凝胶制剂抑制牙釉质白斑形成的效果。

效果观察

采用标准环境下数字摄影来评价牙釉质样本在基线、脱矿再矿化循环2周、脱矿再矿化循环4周时的牙釉质颜色外观情况：

如图3所示，在4周的脱矿再矿化循环过程中，各处理组牙釉质表面颜色随时间而变白，本发明的凝胶制剂处理组变白程度最小，说明其具有抑制牙釉质脱矿的效果，具有抑制牙釉质白斑形成的效果，可用于牙齿白斑的防治。

Micro-CT观察牙釉质的病变深度和矿物质损失量：

使用台式Micro-CT扫描仪，对同一个样本扫描2次，分别在基线和脱矿再矿化循环4周后进行。如图3所示，与基线相比，在4周的脱矿再矿化循环过程后，凝胶制剂处理组的病变深度和矿物质损失量最小。

扫描电镜观察牙釉质的脱矿情况：

取出牙釉质后，去离子水冲洗干净，将样本用乙醇梯度脱水，然后在空气中干燥并喷金，用SEM观察脱矿情况。空白对照牙釉质表面的粗糙度和孔隙率增加，釉柱和釉柱间质脱矿明显，未检测到新生矿物质沉积；凝胶制剂组牙釉质表面相对光滑，可见明显的矿物质沉积，釉柱和釉柱间质结构完整，新生的矿物质致密沉积在釉质晶体间隙中；阳性对照组的再矿化程度不如凝胶制剂组。

实施案例7

评价实施案例1获得的牙齿矿化抗菌双重性能凝胶对早期牙釉质龋的治疗效果。

制备早期牙釉质龋样本：选取颗新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹、无斑点的人前磨牙供实验使用。在水冷却下，用Isomet精密切割机颊舌侧切取4mm×4mm×1.5mm的牙釉质块36个。使用碳化硅研磨纸将釉质外表面磨平并抛光，后用双层耐酸指甲油涂覆，余留3mm×3mm的开窗面。将各牙釉质片置于5mL醋酸缓冲溶液中浸泡6天。病变形成后将样本取出用去离子水冲洗干净，滤纸吸干放在4℃备用。

将本发明的凝胶制剂涂覆在脱矿牙釉质面上，放入5mL的人工唾液中，每天更换新鲜的凝胶制剂和人工唾液，设置空白对照组(脱矿的牙釉质)和阳性对照组(临床常用再矿化制剂GC Tooth Mousse Plus)。置于37℃恒温箱中1周、2周取样。数字摄影、Micro-CT、SEM观察本发明凝胶制剂对早期牙釉质龋的治疗效果。

效果观察

数字摄影观察脱矿牙釉质样本在基线、脱矿后和再矿化2周后的颜色改变。与基线相比，各处理在脱矿后均出现了白垩色外观。再矿化2周后，空白对照组脱矿牙釉质表面的颜色外观无改善；凝胶制剂组白垩色外观消失，釉质表面的光泽性增加；阳性对照组脱矿牙釉质的颜色外观基本不变。

Micro-CT扫描各组样本在基线、脱矿后和再矿化2周后的病变深度和矿物质含量变化。与基线相比，各组样本在脱矿后均显示出明显的釉质表面下病变，CT灰度值显著降低。再矿化2周后，凝胶制剂组釉质病变深度减小，CT灰度值显著增强，效果明显优于空白对照组和阳性对照组。

扫描电镜对比正常牙釉质、脱矿牙釉质、各处理组再矿化后牙釉质的微观结构。如图4所示，正常牙釉质表面光滑平整，釉柱及釉柱间质的结构完整，釉质晶体间隙不明显；脱矿牙釉质表面呈现“鱼鳞状”的形貌，釉柱和釉柱间质的完整性被明显破坏，部分釉柱间质消失，釉质晶体间出现明显间隙。再矿化2周后，空白对照组未观察到再矿化迹象；凝胶制剂组釉质表面的脱矿形貌消失，原来暴露的釉质晶体间隙被新生的矿物质致密沉积，釉质微观结构得到良好的修复；阳性对照组的再矿化效果不如凝胶制剂组。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。