一种鉴定棉花花冠颜色性状的分子标记及方法和应用

技术领域

本发明属于分子标记领域，特别涉及一种鉴定棉花花冠颜色性状的分子标记及方法和应用。

背景技术

花色的多样性为自然界增添了不同的色彩，提升了植物的观赏性，增加了商业价值。其次，花色可以减少紫外线和可见光对植物引起的损害。作为植物重要的繁殖器官，其重要的生物学功能即繁衍后代。花色在植物授粉过程中提供了重要的视觉信号，可以吸引昆虫，在自然传粉时增加传粉者的偏好性。花色作为花蜜存在的可靠指标，直接影响了传粉者的访问率。

棉花是世界最主要的农作物之一。棉花结实吐絮，是世界上纺织纤维的主要来源，产量、品质及优质性状的改良受到育种工作者的热切关注。利用生物技术改良棉花已经被证明是非常有用的手段。近年来，三代测序技术不断发展，单分子DNA测序分辨率高，对特定序列的SNP和InDel识别更加精确，这极大的推进了分子标记在育种中的应用。分子标记辅助选择育种可快速且定向的改良农作物的产量、品质和优质性状，为推进棉花遗传改良提供了新策略。栽培型陆地棉花冠颜色多为白色，粉色花极其少见，这个特征是一种可识别的标记，可应用于棉花的杂交和常规品种的选育，增加新品种的观赏性和商业价值，提高虫媒授粉机率。

InDel(Insertion-Deletion)多态性分子标记是指在同物种或近缘种不同个体之间基因组的同一位点序列发生变化的现象，主要表现为不同大小核苷酸片段的插入或缺失。 InDel标记多态性丰富，覆盖全基因组，数量仅次于SNP，远高于SSR。且具有准确性高、变异稳定，易于分型的特点，被广泛应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种和医学诊断等领域。随着功能基因上InDel标记的开发，结合基因精细定位，可将标记应用于筛选功能基因,进一步开发和利用优良基因。本发明的目的是发现一个与粉色花冠性状紧密相关的InDel标记，并对此标记在大量品种中进行检测，为粉色花冠性状的分子检测提供新方法，同时推进分子标记辅助育种在花冠颜色多样性方面的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种鉴定棉花粉色花性状的InDel分子标记，以及该InDel分子标记在鉴定棉花粉色花性状上的应用。

通过以下制备工艺来实现上述目的：

本发明提供了一种鉴定棉花花冠颜色性状的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记为棉花第A07号染色体上第10920236位碱基的基因型为 ATAACAATAACAACGA或A。

本发明还提供了一种上述InDel分子标记在鉴定棉花花冠颜色性状中的应用，进一步优选地，所述棉花为TM-1陆地棉标准系参考基因组。

作为上述技术方案的进一步改进，当基因型为A时为粉色花冠棉花品种，当基因型为ATAACAATAACAACGA时为白色花冠棉花品种。

本发明还提供了一种鉴定棉花花冠颜色性状的方法，包括以下步骤：

步骤S1、提取待检测棉花组织DNA；

步骤S2、以所述InDel分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述DNA为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

步骤S3、对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得扩增条带；

步骤S4、根据扩增条带判断棉花花冠颜色性状。

作为上述技术方案的进一步改进，若扩增条带大小为90bp，该材料为粉色花品种；若扩增条带大小为105bp，该材料为白色花品种。

作为上述技术方案的进一步改进，所述特异性扩增引物序列为：

上游引物InPF15F：AGCCTCGGCCTCAGATCTTA；

下游引物InPF15R：TGTTGCTTGTTTCTGCACGG。

本发明还提供了一种用于检测棉花粉色花性状的InDel标记引物，所述InDel标记引物以所述的InDel分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计，所述InDel标记引物序列为：

上游引物InPF15F：AGCCTCGGCCTCAGATCTTA；

下游引物InPF15R：TGTTGCTTGTTTCTGCACGG。

本发明还提供了一种用于检测棉花粉色花性状的试剂盒，该试剂盒包含上述InDel 标记引物。

本发明还提供了一种上述InDel标记引物在棉花分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种上述InDel标记引物在选育棉花粉色花品种中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明找到了与陆地棉粉色花冠性状紧密连锁的1个优异InDel位点。可用于观察植株花色，快速筛选花冠颜色艳丽具有观赏价值的棉花新品种，还可用于棉花遗传背景分析和筛选，推动杂交品种选育，鉴定具有潜在应用价值的优异位点及花色分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。

本发明提供的与棉花粉色花性状关联的InDel分子标记，直接以DNA的形式表现，可在棉花的各个发育阶段以及不同的组织器官中检测，且不受环境和季节的限制，不存在表达与否等问题影响。通过提取棉花组织DNA，使用本发明中的特异性引物进行PCR 扩增，扩增产物大小为90bp是粉色花冠的材料，扩增产物大小为105bp的则为白色花冠的材料，从而达到对待测样本的快速、规模化、自动化检测。

本发明的InDel分子标记于粉色花冠性状紧密连锁，可以精确的筛选粉色花冠与白色花冠，对于解析棉花进化过程中花色的演变及花色形成的分子机制具有深远意义。

附图说明

图1为新陆早74(左，白色)和浙Y52(右，粉色)花冠；

图2为利用InPF15F/InPF15R引物扩增两个亲本与30个F

图3利用InPF15F/InPF15R引物扩增7个具有不同花冠颜色棉花DNA的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；(备注：M:DS2000；1：粉色花冠陆地棉(浙Y52)；2-3：白色花冠陆地棉(新陆早74、新陆早33)；4-5：红色花冠陆地棉(红叶棉、亚红株)； 6-7：黄色花冠海岛棉(新海3、新海21)；红色箭头指示粉色花冠材料特有的PCR产物电泳条带(90bp))。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。

1.材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2.方法

2.1.与粉色花冠性状相关的InDel分子标记的筛选

2.1.1.实验材料及群体构建

从棉花种质资源库引进的粉色花冠品种浙Y52，与新疆早熟陆地棉品种新陆早74进行杂交(图1)，获得F

2.1.2.棉花粉色花冠性状田间调查

对F

2.1.3.BSR高通量测序

基于以上遗传分析结果，对F

2.1.4.InDel检测

利用基因分型技术，在F

表1.InDel位点

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表2.InDel特异性引物

上述特异性引物还可以用来制作检测棉花粉色花性状的试剂盒，该试剂盒包含上述 InDel标记引物，应用于选育棉花粉色花品种、棉花分子标记辅助育种。

然后通过PCR扩增目标序列，具体反应体系和程序如下：

表3.PCR反应体系

PCR反应程序为：

表4.PCR反应程序

结果显示，以上待检测的1246株F

2.2.利用InDel标记鉴定棉花粉色花冠性状的方法

本实施例提供了一种利用棉花粉色花冠性状紧密连锁InDel分子标记检测棉花粉色花冠的方法，包括以下步骤：

(1)利用CTAB法提取待测棉花叶片DNA；

①称取2g叶片于离心管中，液氮冷激后迅速使用组织研磨仪充分研磨，加入65℃水浴之后的CTAB溶液1ml，混匀后放置在水浴锅中，65℃加热水浴30min，每8min颠倒一次。

②水浴后，取出离心管，4℃离心10min，取上清加入800μl体积比24：1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢上下颠倒，至混匀不分层为止，4℃条件下12000rpm离心10min。

③重复上一步

④吸取上清液应转移至另一个1.5ml离心管中。加入2倍体积的冰冷异戊醇(提前放 -20℃冰箱)和200μl乙酸钠溶液，缓慢颠倒，直至出现絮状DNA生成，静止30min。

⑤在4℃条件下12000rpm离心10min，倒掉废液，加入70％(v/v)乙醇溶液洗2次，无水乙醇洗1次。

⑥过夜干燥，加ddH

(2)利用基因分型技术，根据所述InDel分子标记设计特异性引物，序列如下：

上游引物InPF15F：AGCCTCGGCCTCAGATCTTA；

下游引物InPF15R：TGTTGCTTGTTTCTGCACGG；

(3)以棉花组织DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增体系和程序同2.1.4。

(4)聚丙烯凝胶电泳

将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体方法为：

①将制胶用玻璃板用水洗净并用酒精擦拭，保证不留水渍和污渍；

②分别将一块毛玻璃和一块光玻璃用夹子固定好毛面向下水平放置于桌面上，用胶带封边，确保原胶溶液不会渗漏；

③将配制好的聚丙烯酰胺凝胶缓慢倒入玻璃模具中，快速的插入梳子；

④室温放置直至凝固，大约8min；

⑤拔去梳子，并用注射器调整孔道保证孔道无弯曲现象；

⑥将玻璃板用夹子固定在电泳槽内，加入事先配好的1×TBE电泳缓冲液；

⑦PCR产物加入2μl 5×Loading Buffer上样缓冲液充分混匀后离心待用；

⑧使用微量进样器上样3μl，完成后接通电源220V 1.5h，进行电泳。

(5)电泳产物固定及显色

①电泳完成后，将玻璃磨具内的凝胶小心取出放置在固定液中，于摇床上缓慢固定 8min；

②将凝胶从固定液中取出，放入银染液中，于摇床上缓慢染色6min；

③将凝胶置入去离子水中快速清洗；

④将凝胶置入显影液中，于摇床上缓慢显色直到有条带出现为止；

⑤显色完成后用蒸馏水将凝胶清洗两遍；

⑥使用凝胶成像仪进行观察和拍照。

结果表明，粉色花冠材料具有其独特的带型，相对于白色、红色、黄色花冠材料的电泳带型完全不同，InPF15F/InPF15R标记在粉色花材料和其它花色材料中表现出多态性。PAGE凝胶电泳可清晰的分辨出粉色花冠DNA扩增产物的条带(90bp)，电泳条带明显小于其他花冠色(白色、红色、黄色)材料DNA扩增产物的条带(105bp)(图3)，InPF15F/InPF15R标记与棉花粉色花冠性状存在紧密连锁关系(共分离)。利用基因组可视化软件对粉色花材料和白色花材料DNA序列比对，可以明显看到粉色花材料相对白色花材料在第70个碱基位置缺失了15个碱基TAACAATAACAACGA，InDel标记扩增产物的核苷酸序列为：

AGCCTCGGCCTCAGATCTTA

其中，下划线标示为引物结合位置，加粗为粉色花冠材料基因组15个碱基的缺失位置。未缺失碱基的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，缺失了15个碱基的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。