治疗糖尿病及相关病症的两歧双歧杆菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及治疗糖尿病及相关病症的两歧双歧杆菌（

背景技术

随着社会的发展，人们生活水平的不断提高和饮食结构的调整，饮食呈富余化趋势，且多大鱼大肉，高脂饮食已成为一种重要的日常膳食方式，然而由此导致代谢类疾病的发病率不断提高，其中以肥胖、糖尿病等代谢综合症最为常见，严重影响人们的身心健康。

在肠道中约有1.5 kg的细菌，数量浩瀚的肠道菌群通过与宿主长期的共同进化，已经形成了密不可分的结构、功能联系，它通过消化营养成分、提供宿主维生素及能量、参与正常免疫构建等一系列功能参与宿主稳态平衡。肠道菌群的失调已经被认为与超过50种疾病有关。近年来研究发现代谢性疾病，尤其是肥胖和糖尿病与肠道菌群密切相关，肠道菌群可以调节宿主的脂肪积累和胰岛素敏感性。临床FMT的研究表明，肥胖患者接受来自正常个体的肠道FMT6周后，胰岛素抵抗得到了显著改善。另一项研究在对171名中国成人2型糖尿病患者和174名健康志愿者的肠道菌群研究中，共识别出52484个与2型糖尿病相关的肠道细菌基因。因此益生菌在治疗肥胖、糖尿病中具有巨大的潜力。

GPR120是长链不饱和游离脂肪酸受体，具有调节胃肠道激素分泌、调节脂肪细胞发育和分化等多种生理功能。动物实验显示，高脂饮食诱导GPR120缺失小鼠会产生更为严重的肥胖、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性。一系列临床前研究显示GPR120激动剂能够调节葡萄糖和能量稳态，包括改善肥胖引起的慢性炎症及胰岛素抵抗、调节脂肪细胞生热和调节食欲等。人的队列研究也显示，GPR120L氨基酸序列中R270H突变与肥胖显著相关。因此，GPR120是治疗肥胖、糖尿病等代谢综合症的潜在重要靶点。

脂肪组织中有两种甘油三酯脂肪酶，脂肪组织甘油三酯脂肪酶（adiposetriglyceride lipase，ATGL）和激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）。前者不需要激素激活即有活性，所以在基础脂解中非常重要，也是最主要的脂解酶。后者则需由脂解激素激活才有活性。二者水解的甘油三酯（TG）约占水解总量的95%。

HSL是1962年发现的，因其脂肪酶活性受激素影响很大而得名。研究表明，HSL激活剂可以通过PKA将HSL磷酸化，使其易位到脂滴中，从而促进脂解过程。胰岛素是其最重要的抑制剂。

ATGL是2004年发现的。其C端含有疏水性脂滴结合区，所以主要定位于脂滴表面。ATGL能特异性地水解TG的第一酯键，被认为是TG水解过程的限速酶，其表达减少会导致脂肪细胞和其他组织的TG大量积累，造成肥胖和其他代谢并发症。

发明内容

本发明的目的是提供治疗糖尿病及相关病症的两歧双歧杆菌（

本发明是通过以下技术方案实现的：

两歧双歧杆菌（

两歧双歧杆菌（

本发明还保护所述的两歧双歧杆菌（

（a）糖尿病；

（b）代谢综合症；

（c）糖化血红蛋白含量异常；

（d）胰岛素敏感度异常；

（e）空腹血糖值异常；

（f）口服糖耐量异常；

（g）空腹胰岛素含量异常；

（h）肥胖；

（i）体重增长；

（j）脂肪组织重量增长。

本发明还保护所述的两歧双歧杆菌（

本发明还保护所述的两歧双歧杆菌（

进一步的，所述糖尿病为2型糖尿病。

进一步的，所述哺乳动物为高脂饮食哺乳动物。

本发明还保护所述的两歧双歧杆菌（

本发明还保护一种组合物，所述组合物包括所述的两歧双歧杆菌（

进一步的，所述在药学上可接受的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、稀释剂、促吸收剂中的一种或两种以上。

本发明的有益效果在于：

灌胃本发明的两歧双歧杆菌（

生物保藏说明

两歧双歧杆菌（

附图说明

图1为本发明ibiome001的涂片镜检图（40X）。

图2为本发明ibiome001在固体培养基上的菌落形态。

图3为本发明ibiome001与其他两歧双歧杆菌的基因比对图。

图4-7为本发明ibiome001与其他两歧双歧杆菌的基因比对在SEQ ID NO.2-5处的放大图。

图8为不同株的两歧双歧杆菌激活GPR120的结果。

图9为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠体重的影响，其中，a为体重变化率，b为体重值；*表示

图10为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠血糖值的影响，其中，*表示

图11为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）及曲线下面积（AUC of OGTT）的影响，其中，*表示

图12为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠脂肪含量的影响，其中，*表示

图13为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠白色脂肪中脂解基因表达的影响，其中，*表示

图14为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠糖化血红蛋白含量的影响，其中，**表示

图15为本发明ibiome001及其他3组对照对肥胖、糖尿病小鼠血浆胰岛素含量的影响，其中，*表示

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1 菌种的分离和鉴定

1 分离

取10名健康志愿者粪便样品，用20%体积分数的甘油磷酸盐缓冲液保存，对粪便样品分别梯度稀释至10

将各浓度涂布于MRS肉汤培养基上（购自Solarbio，货号M8540），37℃，厌氧培养48小时。

挑取单克隆至MRS肉汤液体培养基中进行培养，通过16s rRNA通用引物进行PCR扩增（上游引物27F：AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG，下游引物1492R：GGTTA CCTTGTTACGACTT）。

2 鉴定

2.1 16s rRNA测序

扩增产物送测序，通过16s rRNA基因序列比对选取两歧双歧杆菌进行体外筛选，编为两歧双歧杆菌（

实验方法：

取100μL菌液，12000rpm离心2min，弃培养基，加灭菌ddH

PCR体系（20μL）： 2 × Taq Master Mix：10μL； 引物1（341F）：1μL； 引物2（1492R）：1μL；ddH

PCR反应程序：95℃ 3min；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，step2-4 35×；72℃5min。

将16S rRNA基因的PCR产物进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示。

2.2 涂片镜检

使用显微镜将ibiome001在40X下进行涂片镜检，得到如图1所示镜检图。由图中可看出，ibiome001革兰氏染色阳性，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉等多形态，无芽孢，无动力。

2.3 单菌落照片

将ibiome001在MRS培养基上培养48h后拍照，单菌落照片如图2所示，菌落呈白色，圆形，边缘整齐，表面湿润。

2.4 过氧化氢酶试验和糖醇发酵生化反应检测

取300μL冻存的ibiome001到1mL MRS培养基中复苏菌株，取液体培养的ibiome001在MRS固体培养基划线中纯化，挑取单菌落接种于1mL MRS液体培养基中培养24h，再取液体培养的菌株，经过梯度稀释，涂布于MRS固体培养基中，培养72h。再分别进行过氧化氢酶试验和糖醇发酵生化反应检测。

过氧化氢酶试验：滴加2-3滴过氧化氢酶反应试剂（购自青岛海博生物，货号HB8650）至ibiome001的菌落上，结果无气泡，即阴性。

糖醇发酵生化反应检测：用灭菌的枪头挑取单个菌落到商品化的细菌生化检测的安瓿瓶（购自青岛海博生物，货号GB057、GB102-1、GB104-1、GB176、GB178、GB188、GB189、GB193、GB195、GB196、GB197、GB199、GB200、GB201、GB202、GB203、GB204、GB206、GB207）中，接种后置于37℃厌氧培养48h，根据试剂盒说明书判断检测结果，如表1所示：

表1. 两歧双歧杆菌生化反应鉴定结果

注：＋表示阳性；－表示阴性。

2.5 全基因组测序

将ibiome001送至基因检测公司进行全基因组测序，将得到的全基因组序列与ATCC 29521（=JCM 1255，GenBank Assembly Accession：GCA_001025135.1）、YIT 10347（GenBank Assembly Accession：GCA_020892075.1）、TMC 3115（GenBank AssemblyAccession：GCA_003573895.1）、NCTC13001（GenBank Assembly Accession：GCA_900637095.1）、JCM 7004（GenBank Assembly Accession：GCA_003573955.1）、PRL2010（GenBank Assembly Accession：GCA_000165905.1）、HN002（GenBank AssemblyAccession：GCA_016838705.1）、BGN4（GenBank Assembly Accession：GCA_000265095.1）、BF3（GenBank Assembly Accession：GCA_001281345.1）、S17（GenBank AssemblyAccession：GCA_000164965.1）、S6（GenBank Assembly Accession：GCA_003390735.1）等两歧双歧杆菌菌株序列比对，得到如SEQ ID NO.2-5所示特异性序列片段，如图3-7所示。

实施例2 不同两歧双歧杆菌激活GPR120比较

（1）将稳定表达β-arrestin-TEV和tTA-luciferase的HEK293细胞株放到含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养；

（2）转染混合物制备：200ng/孔GPR120-tango质粒在20μL DMEM中与400ngpolyethylenimine（溶于20μL的DMEM中）混合，室温孵育20分钟；

（3）将步骤（1）的HEK293细胞培养两天（达到大约90%融合）后，将步骤（2）的转染混合物加入步骤（1）的HEK293细胞中；

（4）转染24小时后，用180mL含1%青霉素/链霉素和10mM HEPES的DMEM培养基和20μL细菌培养上清液（Bb-1、Bb-2、Bb-3或ibiome001，其中Bb-1、Bb-2、Bb-3均为实验室筛选的其他两歧双歧杆菌，16s rDNA序列与SEQ ID NO.1一致）替换培养基；

（5）细菌培养上清液刺激24小时后弃上清，每孔加入50μL 用含20mM HEPES的PBS稀释20倍的Bright-Glo溶液（Promega公司产品）；

（6）室温孵育20分钟后，使用 Spectramax i3进行荧光定量。

实验结果如图8所示，与培养基相比，ibiome001对GPR120的激活作用最强，是培养基对照的4倍，其他的两歧双歧杆菌菌株激活作用均小于2倍，证明ibiome001对GPR120的激活作用明显优于其他两歧双歧杆菌菌株。

实施例3菌株对小鼠体重、脂肪组织重量、脂解基因表达、口服葡萄糖耐量、禁食血糖、糖化血红蛋白、血浆胰岛素的影响

选取C57BL/6J（10周，雄性）小鼠，SPF级，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠适应一周后，给予小鼠60%高脂饲料（购自美迪森，货号MD12033），并同时给药，实验共分为4组：

（1）control组：对照组，灌胃0.2mL PBS溶液；

（2）Bb组：灌胃10

（3）Bb+BI组：灌胃两歧双歧杆菌ibiome001+长双歧杆菌（菌株按照1:1混合，菌落数共10

（4）5mix（Ba+Bf+BI+Bb+Bp）组：五种双歧杆菌混合，分别为两歧双歧杆菌ibiome001（Bb），长双歧杆菌（BI），青春双歧杆菌（Ba），粪双歧杆菌（Bf）和假链双歧杆菌（Bp）（菌株按照1:1:1:1:1混合，菌落数共10

对小鼠体重的影响

实验开始前将上述小鼠按体重分组，实验开始后每周记录小鼠体重，共记录13周。小鼠的体重变化率和体重绝对值如图9所示。

从图9a中可看出，灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）从第四周开始就可以显著抑制小鼠体重增长，并且这种效果一直持续到实验结束；而与其他双歧杆菌组合后，抑制体重增长的效果不显著。从图9b可以看到在灌胃两歧双歧杆菌ibiome001 13周后，小鼠的绝对体重与对照组（control）相比降低了5.53g。

对小鼠禁食血糖值和口服葡萄糖耐量的影响

实验第10周时检测小鼠的禁食血糖值并进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。

OGTT实验方法：动物禁食12小时，小鼠尾尖取血用血糖试纸检测小鼠空腹血糖值（0时）同时按照2g/kg的剂量给小鼠灌胃葡萄糖溶液，然后分别在灌胃葡萄糖后的30、60、120min尾尖取血测量血糖值，绘制血糖随时间变化曲线，计算曲线下面积。

禁食血糖值结果如图10所示：灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）可以显著降低高脂饲料诱导的肥胖、糖尿病小鼠的禁食血糖值，而与其他双歧杆菌组合后没有改善作用。

口服葡萄糖耐量（OGTT）的结果如图11a所示：与对照组（control）相比，灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）大幅降低了糖负荷后30 min的血糖水平（

对小鼠脂肪组织重量的影响

给药13周后小鼠禁食12小时，牺牲小鼠，取血浆、脂肪组织（肠系膜白色脂肪，皮下白色脂肪，附睾白色脂肪和棕色脂肪），将脂肪组织分别称重，结果如图12所示：灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）能够显著降低小鼠皮下白色脂肪和肠系膜白色脂肪的重量。灌胃两歧双歧杆菌和长双歧杆菌的组合（Bb+BI）仅能够显著降低小鼠的皮下白色脂肪重量。灌胃5种双歧杆菌混合物对小鼠各部位脂肪均没有影响。

对小鼠脂解基因表达的影响

取上述白色脂肪组织提取RNA，用qPCR方法检测脂解相关基因的表达量。具体方法如下：

组织RNA的提取：采用动物组织的总RNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司，货号DP424）对组织中的RNA进行提取，具体操作参考试剂盒说明书，接着，利用NanoDrop及琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和纯度。

逆转录：将2

qPCR：2

qPCR的结果如图13所示，结果表明：灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）能够提高脂解基因ATGL和HSL的表达，其中ATGL的升高程度达到了显著性差异（

对小鼠糖化血红蛋白和血浆胰岛素的影响

取上述血浆，用试剂盒（购自华美生物，货号CSB-E08141m和CSB-E05071m）检测血浆中糖化血红蛋白、胰岛素含量。

糖化血红蛋白水平是衡量血糖控制的金标准，如图14所示，灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）显著降低高脂饲料诱导的肥胖、糖尿病小鼠血浆中糖化血红蛋白的含量，而与其他双歧杆菌组合后对血浆中糖化血红蛋白的含量没有影响。

如图15所示，灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）显著降低高脂饲料诱导的肥胖、糖尿病小鼠血浆中胰岛素的含量，而灌胃两歧双歧杆菌和长双歧杆菌的组合（Bb+BI）对血浆胰岛素含量没有影响。

综上所述，灌胃两歧双歧杆菌ibiome001（Bb）能够显著降低高脂饲料诱导的肥胖、糖尿病小鼠的体重、白色脂肪重量，提高脂解基因ATGL和HSL的表达；并且显著降低小鼠禁食血糖、口服葡萄糖耐量曲线下面积、血浆糖化血红蛋白和胰岛素含量。两歧双歧杆菌ibiome001是潜在的治疗肥胖、糖尿病等代谢综合症的功能菌株，效果优于与其他两歧双歧杆菌的组合。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。