一种抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及IPC C07K14，更具体的，涉及一种抗菌肽及其应用。

背景技术

抗菌肽，广泛地存在于多种生物体，是一种具有生物活性的小分子多肽，这类活性小分子多肽普遍具有强碱性、热稳定性和光谱抗菌等特点，可以作为抵抗病原微生物入侵的重要防线。

现有专利CN201910381420.1公开了分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽和植物抗菌肽的用途。该抗菌肽从黑芝麻中分离获得，具有抑制白色念珠菌和流感嗜血杆菌的作用。但未显示对其它细菌的抑制作用。

现有专利CN201811277061.7公开了一种纯化制备抗菌肽的方法，通过优化步骤工艺和参数，使半透膜纯化和反向色谱法纯化相互促进，分离纯化高纯度的抗菌肽。现有分离抗菌肽的技术已得到较好的发展。

但目前抗菌肽的种类还不多，且现有部分抗菌肽的溶血性能较强，生物安全性还有待提高。本发明开发了一种新的抗菌肽及其应用，主要抑制痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌，且其生物安全性高。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明第一方面提供了一种抗菌肽，所述一种抗菌肽为抗菌肽1、抗菌肽2、抗菌肽3、抗菌肽4、抗菌肽5、抗菌肽6、抗菌肽7、抗菌肽8、抗菌肽9、抗菌肽10、抗菌肽11、抗菌肽12、抗菌肽13、抗菌肽14、抗菌肽15、抗菌肽16、抗菌肽17、抗菌肽18中的任意一种，所述抗菌肽1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述抗菌肽2的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，所述抗菌肽3的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述抗菌肽4的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，所述抗菌肽5的氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，所述抗菌肽6的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，所述抗菌肽7的氨基酸序列如SEQ ID No：7所示，所述抗菌肽8的氨基酸序列如SEQ ID No：8所示，所述抗菌肽9的氨基酸序列如SEQ ID No：9所示，所述抗菌肽10的氨基酸序列如SEQ ID No：10所示，所述抗菌肽11的氨基酸序列如SEQID No：11所示，所述抗菌肽12的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示，所述抗菌肽13的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示，所述抗菌肽14的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示，所述抗菌肽15的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示，所述抗菌肽16的氨基酸序列如SEQ ID No：16所示，所述抗菌肽17的氨基酸序列如SEQ ID No：17所示，所述抗菌肽18的氨基酸序列如SEQ IDNo：18所示。

本发明基于机器学习的方法生成抗菌肽。利用生成模型从大规模多肽数据库学习多肽的特征向量表示，然后利用抗菌肽数据库训练机器模型分类器，筛选出具有抗菌功能的预测序列。

本发明第二方面，提供了所述抗菌肽的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，并从细胞中通过分离纯化的方法直接获得或直接通过化学合成制备得到。

优选地，所述合成步骤如下所述：

(1)多肽合成顺序是从C端到N端：将2-Chlorotrityl Chloride Resin 10g放入反应管中，加15mL/g(毫升/克)DCM(二氯甲烷)，震荡30分钟。

(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-氨基酸-OH氨基酸，加入DMF(二甲基甲酰胺)溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，震荡90分钟。用甲醇封闭。

(3)脱保护：除去DMF，加15ml/g 20％哌啶DMF溶液，洗涤5分钟后，除去20％哌啶DMF溶液，再加入15ml/g 20％哌啶DMF溶液，洗涤15分钟。

(4)检测：抽去哌啶溶液，取10～20粒树脂，用乙醇洗涤三次，加入检测试剂检测。105～110℃加热5分钟，颜色变为深蓝色即为阳性反应。

(5)冲洗树脂：分别依次用DMF(10ml/g)，DCM(10ml/g)，DMF(10ml/g)冲洗树脂两次。

(6)缩合：加入保护氨基酸三倍摩尔过量，HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)三倍摩尔过量，均用少量DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍摩尔过量，反应30分钟。

(7)检测：取10～20粒树脂，用乙醇洗涤三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5分钟，无色即为阴性反应。

(8)冲洗树脂：分别依次用DMF(10ml/g)，DCM(10ml/g)，DMF(10ml/g)冲洗树脂两次。

(9)重复(3)至(6)操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

(10)抽干，并按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10分钟。

(11)从树脂上切割多肽：所用切割液成分为：95％TFA(三氟乙酸),1％水，2％EDT(巯基乙醇)，2％TIS(三异丙基硅烷)；切割时间为：120分钟。

(12)吹干洗涤：将裂解液用氮气吹干，乙醚洗涤六次，然后放置常温挥发。

(13)分析提纯冻干：用高效液相色谱提纯多肽粗品；收集多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，并冻干制成白色粉末。

本发明第三方面，提供了一种上述抗菌肽在制备抗菌剂方面的应用。

优选地，所述抗菌剂作用的细菌为痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种；进一步优选地，为痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌中的任意一种。

优选地，所述抗菌肽对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度为1～25μg/mL。

优选地，所述抗菌肽对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为1～25μg/mL。

优选地，所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为1～25μg/mL。

优选地，所述抗菌肽的最小溶血浓度大于等于500μg/mL。

抗菌肽的对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌抑制效果的测定方法。

1、抗菌肽的对细菌的抑制效果的测定方法

(ⅰ)抗菌肽的准备

液体培养初筛：用排枪或加样机直接取10μL用纯水溶解成1mg/mL的抗菌肽，按顺序从左到右加入到新的96孔板中，补全正负对照，备用。96孔板横向摆放，对照分别为与抗菌肽相同浓度的纯水和细菌、对照的抗菌肽和细菌，环丙沙星和细菌，无菌培养基。

液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度：稀释四个浓度测试，即用排枪取10μL无菌水到新的细胞培养96孔板中的B、C、D排，用排枪直接取10μL小肽到新的细胞培养96孔板中的A，B两排。B排用排枪混匀，取10μL到C排。C排混匀取10μL到D排。D排混匀，弃掉10μL。E、F、G、H依次类推。补全正负对照(体积10μL)，备用。

(附加：若用96孔深孔板培养细菌，则所有孔中再加入100μL无菌培养基)

(ⅱ)细菌复苏与菌悬液制备

取痤疮丙酸杆菌接种于厌氧血琼脂平板，置厌氧袋内，37℃厌氧培养48h。挑痤疮丙酸杆菌克隆于液体厌氧菌肉汤培养基中37℃厌氧培养48h，测细菌浓度，用培养基稀释至10

(ⅲ)液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度

制备好的新鲜细菌悬液稀释到10

(ⅳ)步骤3，4重复两次，根据实验可重复性决定是否做第三次。

(ⅴ)根据结果，做进一步的抗菌肽最小抑菌浓度检测，调整浓度最小浓度为1μg/mL，做25个浓度梯度，最终确定抗菌肽的最小抑菌浓度。

(ⅵ)所有合成的抗菌肽进一步检测对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的抑制活性。方法同上，培养基改为LB培养基，正常氧气浓度(21％)下培养即可。

(2)抗菌肽溶血性的测定方法

取2％小鼠红细胞4mL，用4mLPBS冲洗2次，3000rpm离心5min，弃上清，4mLPBS重悬小鼠红细胞。称取8mg多肽溶于2mLPBS缓冲液，制备浓度为4000μg/mL的多肽母液。之后用PBS缓冲液将多肽母液稀释成2000μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL。在96孔板中每孔加入100μL2％小鼠细胞和100μL不同浓度的(4000μg/mL，2000μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL)的多肽溶液；阴性对照和阳性对照分别加入100μLPBS缓冲液和100μL0.1％(w/v)的Triton X-100；每组设置3个复孔，在37℃下孵育1h。将96孔板取出，3000rpm离心5min，吸取100μL上清液转移到一块新的96孔板中，在酶标仪540nm处测定吸光度。溶血率(％)＝(吸光度样品-吸光度阴性)/(吸光度阳性-吸光度阴性)*100％。

有益效果

本发明基于机器学习的方法筛选出具有抗菌作用的抗菌肽序列，然后通过化学合成和基因工程的方式，合成各种抗菌肽，并进行抑制细菌的测试，抗菌肽1～18均表现出较好的生物活性，且较高的生物安全性。根据商业用途，可选择合适的抗菌肽进行组合配比，可开发成潜在的广谱抗菌药物。亦可用于皮肤痤疮的修复。

具体实施方式

本发明中抗菌肽1～18的氨基酸序列如表1所示：

表1

本发明中多肽的氨基酸的通用单字母和三字母编码，如下所示：

G(Gly)甘氨酸M(Met)甲硫氨酸A(Ala)丙氨酸S(Ser)丝氨酸K(Lys)赖氨酸V(Val)缬氨酸L(Leu)亮氨酸I(Ile)异亮氨酸D(Asp)天冬氨酸E(Glu)谷氨酸H(His)组氨酸F(Phe)苯丙氨酸P(Pro)脯氨酸W(Trp)色氨酸Q(Gln)谷氨酰胺R(Arg)精氨酸。

本发明的抗菌肽由以下合成步骤合成：

(1)多肽合成顺序是从C端到N端：将2-Chlorotrityl Chloride Resin 10g加入反应管中，加(15ml/g)DCM(二氯甲烷)，震荡30min。

(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3.5倍摩尔的Fmoc-Ala-OH氨基酸，加入DMF(二甲基甲酰胺)溶解，再加入10.5倍摩尔的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，震荡90min。用甲醇封闭。

(3)脱保护：除去DMF，加入15ml/g 20％哌啶DMF溶液，洗涤5分钟后，除去20％哌啶DMF溶液，再加入15ml/g 20％哌啶DMF溶液，洗涤15分钟。

(4)检测：抽去哌啶溶液，取15粒树脂(吸附有脱保护氨基酸的2-ChlorotritylChloride Resin)，用乙醇洗涤三次，加入茚三酮检测。110℃加热5分钟，颜色变为深蓝色即为阳性反应。

(5)冲洗树脂：分别依次用DMF(10ml/g)，DCM(10ml/g)，DMF(10ml/g)冲洗树脂两次。

(6)缩合：加入3.5倍摩尔的下一个氮端被保护的氨基酸，3.5倍摩尔的HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，均用10ml DMF溶解，加入反应管，立刻加入11倍摩尔的DIEA，反应30分钟。

(7)检测：取15粒树脂，用乙醇洗涤三次，加入茚三酮检测，110℃加热5分钟，无色即为阴性反应。

(8)冲洗树脂：分别依次用DMF(10ml/g)，DCM(10ml/g)，DMF(10ml/g)冲洗树脂两次。

(9)重复(2)至(8)操作，从右到左依次连接表1中序列号为SEQ ID No：1所示的氨基酸。

(10)抽干，并按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10分钟。

(11)从树脂上切割多肽：所用切割液成分为：95％TFA(三氟乙酸),1％水，2％EDT(巯基乙醇)，2％TIS(三异丙基硅烷)；切割时间为：120分钟。

(12)吹干洗涤：将裂解液用氮气吹干，乙醚洗涤六次，然后放置常温挥发。

(13)分析提纯冻干：用高效液相色谱提纯多肽粗品；收集多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，并冻干制成白色粉末，得到抗菌肽1。

(14)按照表1中多肽序列，通过(1)～(13)的方法，调整添加的氨基酸的种类和数量，分别制备得到抗菌肽2～18。用于抑制抗菌的实验。

实施例1

抗菌肽的对痤疮丙酸杆菌抑制效果的测定方法

(ⅰ)抗菌肽的准备

液体培养初筛：用排枪直接取10μL用纯水溶解成1mg/mL的抗菌肽，按顺序从左到右从第二个格子开始加入10个抗菌肽到新的96孔板中，补全正负对照，备用。96孔板横向摆放，对照分别为与抗菌肽相同浓度的纯水和细菌、对照的抗菌肽和细菌，环丙沙星和细菌，无菌培养基。

液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度：稀释四个浓度测试，即用排枪取10μL无菌水到新的细胞培养96孔板中的B、C、D排，用排枪直接取10μL小肽到新的细胞培养96孔板中的A，B两排。B排用排枪混匀，取10μL到C排。C排混匀取10μL到D排。D排混匀，弃掉10μL。E、F、G、H依次类推。补全正负对照(体积10μL)，备用。

(附加：若用96孔深孔板培养细菌，则所有孔中再加入100μL无菌培养基)

(ⅱ)细菌复苏与菌悬液制备

取痤疮丙酸杆菌接种于厌氧血琼脂平板，置厌氧袋内，37℃厌氧培养48h。挑痤疮丙酸杆菌克隆于液体厌氧菌肉汤培养基中37℃厌氧培养48h，测细菌浓度，用培养基稀释至10

(ⅲ)液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度

制备好的新鲜细菌悬液稀释到10

(ⅳ)步骤3，4重复两次，根据实验可重复性决定是否做第三次。

(ⅴ)根据结果，做进一步的抗菌肽最小抑菌浓度检测，调整浓度最小浓度为(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml)，做25个浓度梯度，最终确定抗菌肽的最小抑菌浓度。

所述厌氧血琼脂平板为CDC厌氧血琼脂平板。

所述CDC厌氧血琼脂平板购自河南美凯生物科技有限公司。

18种抗菌肽对痤疮丙酸杆菌抑制效果如表2所示。

实施例2

抗菌肽的对表皮葡萄球菌抑制效果的测定方法

(ⅰ)抗菌肽的准备

液体培养初筛：用排枪直接取10μL用纯水溶解成1mg/mL的抗菌肽，按顺序从左到右从第二个格子开始加入10个抗菌肽到新的96孔板中，补全正负对照，备用。96孔板横向摆放，对照分别为与抗菌肽相同浓度的纯水和细菌、对照的抗菌肽和细菌，环丙沙星和细菌，无菌培养基。

液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度：稀释四个浓度测试，即用排枪取10μL无菌水到新的细胞培养96孔板中的B、C、D排，用排枪直接取10μL小肽到新的细胞培养96孔板中的A，B两排。B排用排枪混匀，取10μL到C排。C排混匀取10μL到D排。D排混匀，弃掉10μL。E、F、G、H依次类推。补全正负对照(体积10μL)，备用。

(附加：若用96孔深孔板培养细菌，则所有孔中再加入100μL无菌培养基)

(ⅱ)细菌复苏与菌悬液制备

取表皮葡萄球菌接种于LB培养基，正常氧气浓度(21％)，培养48h。挑表皮葡萄球菌克隆于LB培养基中37℃正常氧气浓度(21％)培养48h，测细菌浓度，用培养基稀释至10

(ⅲ)液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度

制备好的新鲜细菌悬液稀释到10

(ⅳ)步骤3，4重复两次，根据实验可重复性决定是否做第三次。

(ⅴ)根据结果，做进一步的抗菌肽最小抑菌浓度检测，调整浓度最小浓度为(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml)，做25个浓度梯度，最终确定抗菌肽的最小抑菌浓度。

所述的LB培养基购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

18种抗菌肽对表皮葡萄球菌抑制效果如表2所示。

实施例3

抗菌肽的对金黄色葡萄球菌抑制效果的测定方法

(ⅰ)抗菌肽的准备

液体培养初筛：用排枪直接取10μL用纯水溶解成1mg/mL的抗菌肽，按顺序从左到右从第二个格子开始加入10个抗菌肽到新的96孔板中，补全正负对照，备用。96孔板横向摆放，对照分别为与抗菌肽相同浓度的纯水和细菌、对照的抗菌肽和细菌，环丙沙星和细菌，无菌培养基。

液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度：稀释四个浓度测试，即用排枪取10μL无菌水到新的细胞培养96孔板中的B、C、D排，用排枪直接取10μL小肽到新的细胞培养96孔板中的A，B两排。B排用排枪混匀，取10μL到C排。C排混匀取10μL到D排。D排混匀，弃掉10μL。E、F、G、H依次类推。补全正负对照(体积10μL)，备用。

(附加：若用96孔深孔板培养细菌，则所有孔中再加入100μL无菌培养基)

(ⅱ)细菌复苏与菌悬液制备

取金黄色葡萄球菌接种于LB培养基，正常氧气浓度(21％)，培养48h。挑金黄色葡萄球菌克隆于LB培养基中37℃正常氧气浓度(21％)培养48h，测细菌浓度，用培养基稀释至10

(ⅲ)液体培养检测抗菌肽最小抑菌浓度

制备好的新鲜细菌悬液稀释到10

(ⅳ)步骤3，4重复两次，根据实验可重复性决定是否做第三次。

(ⅴ)根据结果，做进一步的抗菌肽最小抑菌浓度检测，调整浓度最小浓度为(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml)，做25个浓度梯度，最终确定抗菌肽的最小抑菌浓度。

所述的LB培养基购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

18种抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑制效果如表2所示。

实施例4

抗菌肽溶血性的测定方法

取2％小鼠红细胞4mL，用4mLPBS冲洗2次，3000rpm离心5min，弃上清，4mLPBS重悬小鼠红细胞。称取8mg多肽溶于2mLPBS缓冲液，制备浓度为4000μg/mL的多肽母液。之后用PBS缓冲液将多肽母液稀释成2000μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL。在96孔板中每孔加入100μL2％小鼠细胞和100μL不同浓度的(4000μg/mL，2000μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL)的多肽溶液；阴性对照和阳性对照分别加入100μLPBS缓冲液和100μL0.1％(w/v)的Triton X-100；每组设置3个复孔，在37℃下孵育1h。将96孔板取出，3000rpm离心5min，吸取100μL上清液转移到一块新的96孔板中，在酶标仪540nm处测定吸光度。溶血率(％)＝(吸光度样品-吸光度阴性)/(吸光度阳性-吸光度阴性)*100％。

18种抗菌肽溶血性的测试结果如表2所示。

表2

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