METTL3或METTL14的抑制剂在制备治疗黑棘皮病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及METTL3或METTL14的抑制剂在制备治疗AN药物中的应用。

背景技术

黑棘皮病(acanthosis nigricans,AN)是一种以角化过度、色素沉着、乳头状瘤样增生和天鹅绒样皮疹为特征的皮肤病。它主要发生在颈部、腋窝、外生殖器和面部的皮肤褶皱处。它通常与肥胖、糖脂代谢紊乱、性激素紊乱和高胰岛素血症有关，并严重影响患者的身心健康和生活质量。目前，AN被认为是胰岛素抵抗和早期糖尿病等代谢紊乱的特异性表皮标志物。已有研究表明，高胰岛素血症、持续低水平的炎症因子和异常分泌的脂肪细胞因子可促进肥胖患者皮肤角质形成细胞(keratinocytes,KCs)的增殖和黑色素细胞(melanocytes,MCs)的激活，导致AN的发生。然而，AN的致病机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗方法。

迄今为止，表观遗传学研究表明环境因子可以通过表观遗传调控机制改变靶基因的选择性表达。N6-甲基腺嘌呤(m

研究一种治疗AN的新药物或者新方法具有重要意义。

发明内容

本发明旨在提供一种可以用于制备治疗AN药物的新靶点。在本研究中，我们研究了m

本发明的技术方案是：

METTL3或METTL14的抑制剂在制备治疗黑棘皮病药物中的应用。

优选的，所述METTL3的抑制剂或METTL14的抑制剂为siRNA。进一步优先的，所述METTL3的抑制剂如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52或SEQ ID NO.53所示，METTL14的抑制剂如所SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55或SEQ ID NO.56所示。

本发明还提供了METTL3或METTL14作为分子标志物在制备诊断黑棘皮病检测试剂盒中的应用。

本发明研究表明，对黑棘皮病患者皮损组织及正常人皮肤组织进行m

在本发明的研究中，我们收集了3例黑棘皮病患者皮损和3例正常人皮肤组织完善ArrayStar表观转录组测序，通过对芯片结果进行分析，我们发现ADRA2A和INHBA mRNA表达及m

本发明使用体内试验来研究敲低或过表达METTL3和METTL14在调节KCs增殖和凋亡及MCs色素合成中的作用。结果显示，在细胞水平上验证了METTL3和METTL14调控ADRA2A和INHBA的表达，同时可改变细胞增殖、色素沉着和凋亡的生物标志物的表达水平。

总之，本发明描述了m

附图说明

图1是AN皮损和健康对照皮肤ArrayStar表观转录组测序分析图，其中图1(A)是显示GO功能和KEGG通路富集分析确定了与病理生理学密切相关的三个通路，每个富集通路中差异表达的候选基因(对照vsAN)的图；图1(B)是显示维恩图描述了涉及炎症、激素调节和色素信号的7个候选基因的图。

图2是METTL3和METTL14促进m

图3是敲低METTL3或METTL14，降低了ADRA2A、INHBA表达和KCs细胞增殖和色素沉着的生物标志物的表达，同时增加了KCs细胞凋亡的图，其中图3(A):是特定siRNA敲低METTL3或METTL14后，KCs中ADRA2A和INHBA的mRNA、m6A和蛋白水平下调的图(n＝3)；图3(B)是在KCs中，METTL3或METTL14基因敲低后，keratin 14,cyclin E1,cyclin D1,and cyclinB1的mRNA和蛋白水平下调的图(n＝3)；图3(C):是METTL3或METTL14敲低后，endothelin 1的mRNA和蛋白质水平下调的图(n＝3)；图3(D):是在KCs中使用siRNAs敲除METTL3或METTL14后，PARP的mRNA和蛋白的水平下降(n＝3)，但在KCs中敲除METTL3或METTL14后，caspase-3水平增加，凋亡增加的图，数据以平均值±SEM表示，*表示与空载体(EV)的比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4是过表达METTL3或METTL14，增强了ADRA2A、INHBA表达和KCs细胞增殖和色素沉着的生物标志物的表达，同时减少了KCs细胞凋亡的图，其中图4(A)是腺病毒过表达METTL3或METTL14后，KCs中ADRA2A和INHBA的mRNA、m6A和蛋白水平上调的图(n＝3)；图4(B)是在KCs中，METTL3或METTL14基因过表达后，keratin 14,cyclin E1,cyclin D1,andcyclin B1的mRNA和蛋白水平上调的图(n＝3)；图4(C):是METTL3或METTL14过表达后，endothelin 1的mRNA和蛋白质水平上调的图(n＝3)；图4(D):是在KCs中使用siRNAs敲除METTL3或METTL14后，PARP的mRNA和蛋白的水平增加(n＝3)，但在KCs中敲除METTL3或METTL14后，caspase-3水平降低，凋亡减少的图，数据以平均值±SEM表示，*表示与空载体(EV)的比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5是METTL3和METTL14调节人原代KCs对MCs色素代谢的旁分泌影响图，其中图5(A):是敲低METTL3或METTL14抑制了KC和MC共培养系统中的细胞活力和色素代谢的图；图5(B)是过表达METTL3或METTL14刺激了KC和MC共培养系统中的细胞增殖和色素代谢的图；图5(C)是AN病理生理机制的假说图，数据以平均值±SEM表示，*表示与siCtrl的比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6是m

图7是基于GTEx数据库的基因表达谱交互分析，对m6A RNA甲基化调控因子(METTL3、METTL14)及其潜在靶点(ADRA2A、INHBA)的相关性分析图。

图8是抑制METTL3和METTL14表达的siRNA筛选图，其中图8(A):是经三种不同的siRNA沉默后，采用WB检测原代KCs中METTL3或METTL14蛋白水平的图；图8(B):是根据免疫印迹结果图，三条siRNA序列都有明显的效果，我们选择效果最好的siRNA进行后续实验。

具体实施方式

下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明

表1：RT-qPCR引物序列以及说明书中的其它序列。

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1、材料及方法

qRT-PCR分析，蛋白质印迹(WB)分析，免疫组化(IHC)测定，酪氨酸酶和黑色素含量测定以上方法均是现有方法，在此不再累述。

2、患者组织标本

本研究采用来自中南大学湘雅三医院病理组织学诊断为AN患者和正常对照患者。将10个AN皮损组织标本和相应的正常对照皮肤组织标本立即储存在-80℃，并用于qRT-PCR和/蛋白质印迹等。

3、m

转录组微阵列(Arraystar)用于RNA样本的制备和微阵列杂交。从AN组(n＝3)或对照组(n＝3)的皮肤组织中提取总RNA。阈值设定为大于1.5倍变化和具有统计学意义(p<0.05)来比较AN组和正常组之间的RNA甲基化差异。利用m

4、m

使用比色法m

5、人KCs培养和功能表型分析

从手术切除的包皮标本中分离出分离培养KCs。对于KCs(2.5×10

为了进行RNA干扰实验，最佳干预效果的SiRNA分别从3条Si-METTL3(Si-METTL3-1(5'-GCCAAGGAACAAUCCAUUGUUTT-3')；Si-METTL3-2(5'-GCCUUAACAUUGCCCACUGAUTT-3')；Si-METTL3-3(5'-CCAGUCAUAAACCAGAUGAAATT-3'))或Si-METTL14(Si-METTL14-1(5'-GCCGUGUUAAAUAGCAAAGAUTT-3')；Si-METTL14-2(5'-GCUAAUGUUGACAUUGACUUATT-3')；Si-METTL14-3(5'-CCAUGUACUUACAAGCCGAUATT-3'))中选择，随后进行正式敲低后功能表型验证：细胞被铺在24孔板中。将siRNA用lipo2000(Invitrogen)转染KCs,。对于过表达实验，采用腺病毒干预：将CMV-MCS-SV40-EGFP腺病毒载体插入人METTL3(GenBank：NM_019852，靶序列：5'-ACATTCCACAGTTAGCTA-GCTATAAATTCTTAGGTTTAGAGATG-3')或人METTL14(GenBank：NM_020961，靶序列：5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGCGCCACCATGGATAGCCGCTTGCAGGAG-3')基因编码序列中。对于病毒感染，细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中培养过夜，第二天用含有HitransGA(GeneChem)的培养基替换。将腺病毒以最佳的感染多样性(MOI)加入到井中。在感染8-16小时后，用完全的培养基替换该培养基。在感染72h后检测蛋白和mRNA的表达水平。使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(Elabscience)检测细胞凋亡。随后进行流式细胞仪分析。敲低或过表达干预后细胞的增殖，凋亡分子标志物检测采用RT-qPCR和WB检测。

6、结果

6.1在AN皮损中差异表达的m

正常对照(n＝3)和AN皮损(n＝3)活检后进行m

接下来，我们证实了AN病变中m

根据GTEx数据库测序结果的相关性分析显示，METTL14的表达水平与ADRA2A或INHBA之间存在显著的正相关关系(图7)；METTL3水平与INHBA水平呈显著正相关(图7)。这些数据表明，ADRA2A和INHBA是m

6.2 METTL3和METTL14调控ADRA2A和INHBA的表达，以及细胞增殖、色素沉着和凋亡的生物标志物

为了验证METTL3和METTL14在ADRA2A和INHBA表达中的潜在调控作用，我们筛选并确定了KCs中METTL3或METTL14表达的siRNA序列(图8)，3条siRNA序列对METTL3或METTL14均有明显作用，后续选取si-METTL3-3和Si-METTL14-3进行进一步的后续实验。METTL3或METTL14的敲低导致ADRA2A和INHBA的mRNA、m

随后我们通过在KCs中过表达METTL3或METTL14进行了功能表型研究(图4)。结果显示过表达METTL3或METTL14导致ADAR2A和INHBAmRNA水平，m

总之，本发明研究表明，黑棘皮病(Acanthosis nigricans，AN)皮损的m