铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯、电化学免疫传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明专利涉及新型的双金属纳米复合材料与生物免疫传感检测技术领域，尤其是指一种信号放大的铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的制备及应用。

背景技术

心脑血管疾病通常是指大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病，该疾病具有患病率高、致残率高、死亡率高等特点。因此，心脑血管疾病严重影响人类的身体健康。心肌肌钙蛋白I(cTnI)具有较高的心脏特异性，被认为是心脑血管疾病最主要的生物标志物，是诊断心脑血管疾病的金标准。

因此，需要制备开发出一种高灵敏度、高分析检测的免疫传感器实现对cTnI的准确检测。

发明内容

纳米金和纳米铂作为金属纳米材料具有良好的导电性、生物相容性和较高的电催化活性。在生物医学、纳米药学、生物免疫方面有良好的应用前景。因此将纳米金与纳米铂修饰在硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯上，利用双金属之间协同效应，双金属相比单金属表现出更强的催化和导电性能。此外，纳米金与纳米铂分别通过金硫键和铂氮键很容易修饰到硼/硫/氮修饰的还原氧化石墨烯，增强了纳米复合材料的导电性和催化活性。以铂/金修饰的硼、硫、氮掺杂还原氧化石墨烯作为基底构建的具有信号放大功能的电化学免疫传感器具有高的生物相容性、高导电性等优点，使其在疾病诊断方面有巨大的应用前景。

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：将石墨粉与硝酸钠加入硫酸中，搅拌1-2h，加入高锰酸钾，搅拌1-2h，加入水，继续搅拌1-2h，加热回流反应1-3h，加入过氧化氢终止反应，洗涤，冻干，研磨，获得氧化石墨烯；

步骤二：将步骤一得到的氧化石墨烯、L-半胱氨酸和硼酸混合，加入去离子水，超声，pH调至8-9，转移至反应釜中，水热反应，冷却，洗涤，冻干，得到硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)；

步骤三：将步骤二得到的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)分散在水中，超声1-2h形成悬浮液，向所述悬浮液中添加氯金酸(HAuCl

步骤四：将步骤三得到的金修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯(Au-BSN-rGO)均匀分散在水中，得到分散液，向上述分散液中加入H

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤三中，硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)与氯金酸(HAuCl

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤三中，所述微波反应的反应时间控制为10～60min，反应温度控制为70-110℃，反应功率控制为600-900W，优选为700-800W。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤四中，Au-BSN-rGO与H

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤四中，H

在本发明的第二方面，本发明提供一种由本发明第一方面所述的制备方法得到的铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)。

在本发明的第三方面，本发明提供一种电化学免疫传感器的制备方法，所述方法包括：将包含本发明第二方面所述的铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的悬浮液滴涂于GCE表面，并烘干后依次结合抗体、封闭剂和抗原，获得所述电化学免疫传感器。

在本发明的一个或多个实施例中，包含本发明第二方面所述的铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的悬浮液由铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)加入EDC和NHS溶液，搅拌1-5h得到。

在本发明的一个或多个实施例中，所述封闭剂为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的质量浓度3％；所述抗体为心肌肌钙蛋白I、Aβ蛋白、细胞角蛋白21-1、嗜铬粒蛋白A、降钙素、β2微球蛋白对应的抗体；所述抗原孵育时间为10-190min。

在本发明的第四方面，本发明提供一种本发明第三方面所述的制备方法制备得到的电化学免疫传感器在人血清样本中生物标志物的检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)纳米金和纳米铂修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯，由于双金属纳米粒子协同作用，能进一步增强纳米复合材料的导电性和催化活性。同时，硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯能改善氧化石墨烯堆叠现象，增强氧化石墨烯导电性。硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯具有较大的表面积，同时，氧化石墨烯上的硫和氮原子可以通过金硫键和铂氮键负载更多的金属纳米粒子，进一步增强电流信号，提高免疫传感器的灵敏度。

(2)基于铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯复合材料构建的电化学免疫传感器，具有生物相容性好，导电性高、检测限低、灵敏度高等优点，可以进一步将其应用于各种疾病生物标志物的检测。

附图说明

图1为中Pt/Au-BSN-rGO纳米复合材料及基于Pt/Au-BSN-rGO纳米复合材料电化学免疫传感器制备过程示意图；

其中图1A为Pt/Au-BSN-rGO纳米复合材料制备的示意图；图1B为基于Pt/Au-BSN-rGO纳米复合材料电化学免疫传感器构建的示意图。

图2是Pt/Au-BSN-rGO的XPS图像。

图3A为不同材料对电极修饰后的循环伏安图对比结果。图3B为不同材料对电极修饰后的i-t曲线对比结果；

图3中：(a)Bare GCE电极(b)BSN-rGO修饰电极,(c)Au-BSN-rGO修饰电极,(d)Pt-BSN-rGO修饰电极(e)Pt/Au-BSN-rGO修饰电极

图4A为Pt/Au-BSA-rGO/anti-cTnI/BSA/cTnI电化学免疫传感器i-t曲线电流响应图，图4B为cTnI浓度对数和响应电流之间建立的标准曲线。

Bare GCE为空白玻碳电极；BSN-rGO为硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯；Pt-BSN-rGO为铂修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯；Au-BSN-rGO为金修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯；Pt/Au-BSN-rGO为铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的制备方法

铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：将石墨粉与硝酸钠加入硫酸中，搅拌1～2h，加入高锰酸钾，搅拌1～2h，加入水，继续搅拌1～2h，加热回流反应1～3h，加入过氧化氢终止反应，洗涤，冻干，研磨，获得氧化石墨烯；

步骤二：将步骤一得到的氧化石墨烯、L-半胱氨酸和硼酸混合，加入去离子水，超声，pH调至8-9，转移至反应釜中，水热反应，冷却，洗涤，冻干，得到硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)；

步骤三：将步骤二得到的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)分散在水中，超声1～2h形成悬浮液，向所述悬浮液中添加氯金酸(HAuCl

步骤四：将步骤三得到的金修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯(Au-BSN-rGO)均匀分散在水中，得到分散液，向上述分散液中加入H

其中，所述步骤三中，硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)与氯金酸(HAuCl

所述步骤三中，所述微波反应的反应时间控制为10～60min，反应温度控制为70-110℃，反应功率控制为600-900W。

所述步骤四中，Au-BSN-rGO与H

所述步骤四中，H

铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)

本发明还提供一种上述制备方法得到的铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)。

电化学免疫传感器的制备方法

本发明还提供一种电化学免疫传感器的制备方法，所述方法包括：将包含上述铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的悬浮液滴涂于GCE表面，并烘干后依次结合抗体、封闭剂和抗原，获得所述电化学免疫传感器。

包含上述的铂/金纳米粒修饰的硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)的悬浮液由铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯(Pt/Au-BSN-rGO)加入EDC和NHS溶液，搅拌1-5h得到。

所述封闭剂为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的质量浓度3％；所述抗体为心肌肌钙蛋白I、Aβ蛋白、细胞角蛋白21-1、嗜铬粒蛋白A、降钙素、β2微球蛋白对应的抗体；所述抗原孵育时间为10～190min。

具体地，以下实施例中，具有信号放大功能的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：

(1)将10μLPt/Au-BSN-rGO悬浮液滴涂在处理好的玻碳电极表面，自然干燥后，将5μL心肌肌钙蛋白I抗体(anti-cTnI)滴涂于Pt/Au-BSN-rGO电极表面，孵育12h后，用0.1mol/LPBS溶液进行洗涤以除去未固定的抗体。将3.0μL1％的牛血清白蛋白(BSA)滴涂在Pt/Au-BSN-rGO/anti-cTnI电极表面，孵育1h以阻断非特异性活性位点，自然晾干，制备具有信号放大的Pt/Au-BSN-rGO/anti-cTnI/BSA电化学传感器。

(2)免疫传感器采用的是上海辰华CHI660E电化学工作站Pt/Au-BSMN-rGO为工作电极，饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，在0.1mol/L K3[Fe(CN)6]3-/4-/KCl溶液中进行循环伏安和电化学阻抗谱检测，来测试所制备的传感器的电子传递能力。

基于以上的制备方法，进一步的，步骤(1)中可选的标准抗原孵育时间为10-190min，最优的孵育温度为90min。

上述电化学免疫传感器在人血清样本中生物标志物的检测中的应用

本发明还提供一种上述制备方法制备得到的电化学免疫传感器在人血清样本中生物标志物的检测中的应用。

具体地，具有信号放大功能的电化学免疫传感器检测人血清样本中生物标志物的方法，步骤如下：

将不同浓度的cTnI抗原滴涂于Pt/Au-BSN-rGO/anti-cTnI/BSA修饰的工作电极上，将制备的cTnI电化学免疫传感器在含有5M的H

以下实施例中，不同材料修饰至电极后进行电化学性能评价，包括以下步骤：

(1)将玻碳电极分别用0.3μm和0.05μm的Al

(2)在预处理好的玻碳电极上分别滴加10μL BSN-rGO悬浮液，自然干燥，制备BSN-rGO修饰电极。用同样的方法将Au-BSN-rGO悬浮液、Pt-BSN-rGO悬浮液和Pt/Au-BSN-rGO悬浮液分别滴加在处理好的玻碳电极上，制备了Au-BSN-rGO修饰电极、Pt-BSN-rGO修饰电极和Pt/Au-BSN-rGO修饰电极。用电化学工作站进行循环伏安检测和安培电流时间曲线检测。

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1：

铂/金修饰硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯的制备方法，包括如下步骤：

(1)氧化石墨烯的制备

称取1g石墨粉与0.5g硝酸钠混合在15mL浓硫酸中，在冰浴条件下搅拌1.5h。之后缓慢加入4g高锰酸钾，室温搅拌1h，待溶液呈墨绿色后加入40mL的去离子水，37℃搅拌1h。将所得的混合物在95℃条件下回流2h。最后缓慢加入30mL 30％过氧化氢终止反应。将制备的氧化石墨烯离心，冻干，研磨后备用。

(2)硼/硫/氮共掺杂的还原氧化石墨烯的制备

称取30mg氧化石墨烯、90mg L-半胱氨酸和1g硼酸混合，加入去离子水超声40min使其分散均匀，将上述混合液的pH调至7-8。后将混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜中200℃水热反应12h时间，反应完成后，冷却至室温，洗涤、冻干，即可得到硼/硫/氮掺杂还原氧化石墨烯粉末(BSN-rGO)。

(3)铂修饰的硼/硫/氮共掺杂的还原氧化石墨烯的制备

将10mg BSN-rGO在80mL分散在水中。向上述混合物中加入80mL 2mmol/L H

(4)金修饰的硼/硫/氮共掺杂的还原氧化石墨烯的制备

将20mg BSN-rGO分散在40mL水中，超声2h形成悬浮液。向悬浮液中添加1mL1％HAuCl

(5)铂/金修饰的硼/硫/氮掺杂的还原氧化石墨烯的制备

将10mg Au-BSN-rGO分散在80mL水中超声分散30min，得到墨汁状均匀分散的悬浮液。向上述混合物中加入80mL 2mmol/L H

实施例2

不同材料修饰电极的电化学性能评价，包括如下步骤：

将1mg的BSN-rGO粉末分散在1mL水中得到1mg/mL的BSN-rGO悬浮液，在预处理好的玻碳电极上滴加10μL BSN-rGO悬浮液，室温下自然干燥，制备BSN-rGO修饰电极。用同样的方法将Au-BSN-rGO悬浮液、Pt-BSN-rGO悬浮液和Pt/Au-BSN-rGO悬浮液分别滴加在处理好的玻碳电极上，制备Au-BSN-rGO修饰电极、Pt-BSN-rGO修饰电极和Pt/Au-BSN-rGO修饰电极。用电化学工作站检测不同修饰电极的循环伏安和安培电流时间曲线。Bare GCE，BSN-rGO，Pt-BSN-rGO，Au-BSN-rGO和Pt/Au-BSN-rGO修饰电极的循环伏安图和安培电流时间曲线分别见附图3A、附图3B，结合附图3A、附图3B实验结果表明，Bare GCE修饰电极、BSN-rGO修饰电极、Pt-BSN-rGO修饰电极、Au-BSN-rGO修饰电极和Pt/Au-BSN-rGO修饰电极的氧化还原峰电流逐渐增大，此外其相应的i-t电流响应逐渐增大。由此证明Pt/Au-BSN-rGO由于双金属纳米粒子和BSN-rGO协同导电作用，其导电性强于Au-BSN-rGO和BSN-rGO。同时，纳米金与纳米铂协同催化作用，增强了纳米复合材料对H

实施例3

一种具有信号放大功能的电化学免疫传感器的制备方法及应用，包括如下步骤：

(1)称取2mg上述实施例1中制备的Pt/Au-BSN-rGO复合材料，在高速搅拌的条件下加200μL 0.03mmol/L EDC和NHS于37℃搅拌3h，对羧酸基团进行活化，得到Pt/Au-BSN-rGO悬浮液。

(2)将10μLPt/Au-BSN-rGO悬浮液滴涂在处理好的玻碳电极表面，室温下自然干燥后，将5μL心肌肌钙蛋白I抗体(anti-cTnI)滴涂于Pt/Au-BSN-rGO电极表面，4℃孵育12h后，用0.1mol/L PBS溶液进行洗涤以除去未固定的抗体。将3.0μL1％的牛血清白蛋白(BSA)滴涂在Pt/Au-BSN-rGO/anti-cTnI电极表面，于37℃孵育1h以阻断非特异性活性位，晾干。即可构建Pt/Au-BSN-rGO/anti-cTnI/BSA电化学免疫传感器。基于Pt/Au-BSN-rGO纳米复合材料构建的电化学免疫传感器示意图见附图1(B)。

(3)一种具有信号放大功能的电化学免疫传感器对于心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量的测定，包括如下步骤：

标准曲线的绘制：

使用所制备的电化学免疫传感器对不同浓度(50ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.001ng/mL和0.0001ng/mL)的cTnI抗原用安培电流时间进行检测，扫描电压：-0.4V，采样间隔为1s，检测时间为180s。不同浓度的cTnI所对应的电流响应及不同浓度的cTnI与电流响应之间建立的标准曲线见附图4。图4A为Pt/Au-BSA-rGO/anti-cTnI/BSA/cTnI电化学免疫传感器i-t曲线电流响应图，图4B为cTnI浓度对数和响应电流之间建立的标准曲线。结合附图4，该电化学免疫传感器的线性范围50ng/mL-0.1pg/mL，线性回归方程为I＝4.2435lgCcTnI–27.076，(n＝3R

实际样品分析应用

为了评价实施例3制备的基于Pt/Au-BSN-rGO具有信号放大功能的电化学免疫传感器在人血清检测中的应用，采用在血清中加标法作进一步探究。将血液样本在3000rpm离心15min，清除细胞碎片收集上清液置离心管中，后用缓冲液将血清稀释100倍，采用传统三电极体系进行检测。通过向空白血清中依次加入5ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL血清样本，并计算血清中cTnI的回收率。实验结果如表1所示。表1结果表明，该方法的回收率在95～109％之间，且每支传感器反复测定三次相对标准偏差均小于4.5％。因此，所制备的电化学免疫传感器有望应用于cTnI的临床测定。

表1cTnI的加标回收的实验结果

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。