一种小反刍兽疫病毒（PPRV）F蛋白纳米抗体和纳米抗体的制备、纯化及中和试验方法

技术领域

本发明涉及小反刍兽疫病毒F蛋白纳米抗体和纳米抗体的制备、纯化及中和试验方法。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)又名小反刍兽伪牛瘟、羊瘟等,是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染绵羊、山羊等反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。易感动物发病率可达100％，死亡率可达50％～100％。PPR以较高的发病率和病死率被世界动物卫生组织(OIE)[《国际动物卫生法典》(1999)]动物卫生法典列为必须报告的动物疫病，我国《法定动物疫病病种名录》中将其列为一类动物疫病，属于危害严重，需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭措施的动物疫病之一。

F基因在PPRV毒株中非常保守，编码由546个氨基酸组成的富含GC的F蛋白(融合蛋白)，预测分子量大小为59.137kDa。这种高水平的序列保守性可以解释麻疹病毒属中不同成员之间存在的广泛交叉保护，例如针对RPV(Rinderpest virus)的疫苗可以使动物产生抗PPRV的免疫力。副黏病毒科间F基因序列同源性也解释了常见的融合性质和基于F蛋白的保守生物学活性。在麻疹病毒中，F蛋白在H蛋白的帮助下介导病毒囊膜在细胞表面与胞膜融合，从而使病毒进入哺乳动物细胞，随后病毒基因组获得了进入宿主细胞的通道。

目前小反刍兽疫尚未形成有效的治疗方法，只能通过疫苗预防，当小反刍疫发生在某个国家和地区时，需要第一时间对疫病进行确诊，并采取措施防止其进一步的扩散与蔓延，对现有的患病动物进行最快速的捕杀与封锁处理，划定疫区，对周边动物进行病原监测。

1993年，比利时学者Hamers－Casterman等报道骆驼中存在天然缺失轻链的重链抗体，随后发现在羊驼和一些软骨鱼等动物体内也存在类似的抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区构成的单域抗体(variable domain of heavy chain ofheavy－chain antibody，VHH)，由于VHH相对分子质量约为15KD，仅为常规抗体的1/15，因此现已被重新命名为纳米抗体(Nanobody，Nb)。它是目前天然来源的相对分子质量最小的抗体。纳米抗体由于其理化性质稳定、易于基因操作和克隆等优势，在疾病诊断、分子检测和治疗等方面受到广泛关注。目前纳米抗体主要通过噬菌体展示技术获得，该技术通过PCR扩增出抗体的全套可变区基因，并将其克隆到噬菌粒载体上，利用E.coli构建包含纳米抗体全部基因序列的抗体文库；辅助噬菌体感染纳米抗体文库后释放包含有重组噬菌粒的噬菌体，形成噬菌体抗体文库，VHH表达在重组噬菌体表面，该技术将表型与基因型直接联系在一起，将抗体识别抗原的能力与噬菌体扩增的能力结合在一起，对特异性抗体的筛选更为高效。

发明概述

本申请为通过快速检测PPRV诊断小反刍兽疫及通过中和抗体治疗或预防小反刍兽疫提供了一种易于合成和稳定保存的靶向PPRV的抗体。同时，本申请还提供了所述靶向PPRV的抗体的制备、纯化及中和试验方法。通过所述制备及纯化方法，可以获得高效价的PPRV-F纳米抗体。

具体地，本申请涉及：

1.一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的中和抗体或其抗原结合片段，其特异性结合小反刍兽疫病毒F蛋白(PPRV-F)，包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，其中：

(a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：9(SGSTFSNLAMG)所示；

(b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：10(SRGGGNTFYRDSVKGRFT)所示；

(c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：11(AARDGEYAVSVYYEYHYWG)所示；

2.项1所述的重链可变区序列包含如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，或所述重链可变区包含与SEQ ID NO：1具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

3.项1或2所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自：HcAb、纳米抗体、嵌合抗体、双价纳米抗体、多价纳米抗体、或融合纳米抗体。其中所述融合纳米抗体可以由VHH与可延长纳米抗体在血液中的半衰期的物质融合而成，具体方案可以选自，例如：VHH的聚乙二醇化、与白蛋白结合、或与抗体的Fc端融合等。

4.项1～3任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为驼源VHH抗体。

5.一种复合物，其包含项1-4中任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段，以及功能化合物，其中所述功能化合物选自：治疗药物、标记分子。其中所述标记分子可以选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记分子，荧光蛋白分子，荧光素分子，生物素分子，同位素等。

6.一种核酸分子，其包含编码项1-4中任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。

7.如项6所述的核酸分子，其包含：如SEQ ID NO：2中所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：2中所示的多核苷酸序列具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

8.一种构建体，其包含项6或7所述的核酸分子，其中所述构建体选自：噬菌粒、质粒、病毒载体、或线性核酸。

9.一种病毒、噬菌体或细胞，其表达或展示有项1-4中任一项所述的PP RV的中和抗体或其抗原结合片段，或包含项6或7所述的核酸分子，或包含项8所述的构建体。

10.一种用于治疗或预防小反刍兽疫的药物组合物或检测PPRV的试剂盒，其包含：项1-4中任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段、项4中所述的复合物、项6或7中所述的核酸分子、项8中所述的构建体或项9中所述的病毒、噬菌体或细胞。

11.一种如项1～4中任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括如下步骤：

1)使用PPRV-F免疫驼科动物；

2)鉴定并采集1)中PPRV-F免疫的驼科动物包含VHH编码核酸序列的核酸，并使用噬菌体展示技术，利用所述核酸，构建展示所述VHH的噬菌体文库；

3)通过噬菌体淘筛技术对2)中所述的噬菌体文库进行N次噬菌体淘筛，以获取具有PPRV-F特异性的噬菌体文库；

4)从所述具有PPRV-F特异性的噬菌体文库中获取单克隆，并使用PCR、和/或噬菌体ELISA技术鉴定对PPRV-F具有高特异性的噬菌体阳性单克隆，从所述噬菌体阳性单克隆中鉴定并获取VHH或其抗原结合片段的氨基酸序列和/或其编码核酸序列；

5)将步骤4)所述的编码核酸序列表达成蛋白，并通过蛋白纯化技术从所述蛋白中纯化VHH。

12.如项11所述的制备方法，其中所述驼科动物为羊驼。

13.如项11或12所述的制备方法，其中2)中鉴定并采集包含VHH编码核酸序列的核酸包括两次PCR，所述两次PCR分别使用的两对引物如SEQ ID NO：3和4以及SEQ ID NO：5和6中所示。

14.如项11～13所述的制备方法，其中3)中的N等于3，所述N次噬菌体淘筛中使用的PPRV-F浓度依次为：1～100μg/mL、0.1～50μg/mL、0.01～50μg/mL。

15.如项11～13所述的制备方法，其中所述噬菌体需要与辅助噬菌体共同感染才能获得下一代噬菌体，其中所述辅助噬菌体为M13辅助噬菌体。

16.一种纯化项1～4中任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的方法，包括：

1)将包含有所述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的混合物加入镍柱中，其中所述镍柱的填料类型为Smart-NI；

2)通过250mM的咪唑溶液洗脱出所述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。

17.测定项1-4中任一项所述的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的抗体效价的方法。

在一些具体的实施方案中，项11中所述的制备方法包括如下步骤：

A)使用PPRV-F免疫驼科动物；

B)采集经过步骤A)的驼科动物的淋巴细胞，提取所述淋巴细胞的总RNA并将所述总RNA反转录制备cDNA；

C)使用针对所述驼科动物抗体可变区编码序列的引物，对B)中的cDNA进行PCR，扩增包含所述驼科动物抗体可变区核酸编码序列的DNA，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收与包含所述驼科动物抗体可变区核酸编码序列的DNA大小对应的条带，即为第一轮PCR产物；

D)使用针对所述驼科动物高变区VHH编码序列的引物，对第一轮PCR产物进行PCR，扩增包含所述驼科动物高变区VHH编码核酸序列的DNA，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收与包含所述驼科动物高变区VHH编码核酸序列的DNA大小对应的条带，即为第二轮PCR产物；

E)通过基因重组的方法将第二轮PCR产物连接至第一表达载体，并将所述第一表达载体转化至第一宿主菌的感受态细胞，这些包含所述第一表达载体的第一宿主菌混合物即初级抗体库；

F)鉴定E)的初级抗体库中包含驼科动物VHH编码核酸序列的阳性第一宿主菌比例及所述阳性第一宿主菌中驼科动物VHH编码核酸序列的多样性；

G)当满足下述条件时则将所述初级抗体库用于步骤8)，当不满组下述条件则重复A)至G)或C)至G)中的步骤：

所述阳性第一宿主菌比例为：大于90％，且

所述多样性为30个测序结果均为独立序列，多样性良好；

H)用满足G)中条件的初级抗体库包装噬菌体，即获得包含驼科动物VHH编码核酸序列的噬菌体，以一定浓度的PPRV-F为抗原包被容器，将所述包含驼科动物VHH编码核酸序列的噬菌体放置于所述容器中进行噬菌体淘筛，通过N次噬菌体淘筛筛选具有PPRV-F特异性的噬菌体，并用所述具有PPRV-特异性的噬菌体感染第一宿主菌，经所述噬菌体感染的第一宿主菌混合物称为经淘筛的抗体库；

I)将H)中所述经淘筛的抗体库涂布于平板培养基上，培养并挑取单克隆，PCR鉴定包含驼科动物VHH编码核酸序列的第一阳性单克隆；

J)使用所述第一阳性单克隆包装噬菌体，通过噬菌体ELISA技术筛选对PPRV-F特异性高的噬菌体，所述对PPRV-F特异性高的噬菌体所源自的单克隆即第二阳性单克隆；

K)对第二阳性单克隆或其包装的PPRV-F特异性的噬菌体进行测序，获得特异性结合PPRV-F的VHH或其抗原结合片段的氨基酸序列或其编码核酸序列。

L)将步骤K)的所述编码核酸序列连接至第二表达载体，并将所述第二表达载体转染至第二宿主菌中进行表达，获得表达特异性结合PPRV-F的VHH或其抗原结合片段的第二宿主菌；

M)提取所述表达特异性结合PPRV-F的VHH或其抗原结合片段的第二宿主菌中的蛋白，并从中纯化出VHH。

在一些特定的实施方案中，C)中针对所述驼科动物抗体编码序列的引物如SEQ IDNO：3和4中所示。

在一些特定的实施方案中，其中D)中针对所述驼科动物VHH编码序列的引物如SEQID NO：5和6中所示。

在一些特定的实施方案中，其中所述鉴定E)的初级抗体库中包含驼科动物VHH编码核酸序列的阳性第一宿主菌比例的方法包括如下步骤：

a)将所述初级抗体库涂布于平板培养基上进行培养，获得第一宿主菌的单克隆；

b)挑取第一宿主菌单克隆，并使用PCR对所述驼科动物VHH编码核酸序列进行扩增；

c)计算可获得所述驼科动物VHH编码核酸序列目的条带的第一宿主菌单克隆占全部挑取的第一宿主菌单克隆的比例，即为所述初级抗体库中包含驼科动物VHH编码核酸序列的阳性第一宿主菌比例。

在一些特定的实施方案中，其中b)中PCR使用的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

在一些特定的实施方案中，其中H)中的N为大于或等于3的整数。

在一些特定的实施方案中，其中H)中的N等于3，所述N次噬菌体淘筛中使用的所述一定浓度的PPRV-F依次为：1～100μg/mL、0.1～50μg/mL、0.01～50μg/mL。

在一些特定的实施方案中，其中所述第一宿主菌为含有F质粒的大肠杆菌，所述第一表达载体为噬菌粒，并且H)中包含驼科动物VHH编码核酸序列的噬菌体以及具有PPRV-F特异性的噬菌体均为需要与辅助噬菌体共同感染第一宿主菌，才能获得用于下一次噬菌体淘筛的噬菌体。在一些特定的实施方案中，其中所述噬菌粒为M13噬菌粒，所述辅助噬菌体为M13辅助噬菌体。在一些特定的实施方案中，其中所述含有F质粒的大肠杆菌为TG1大肠杆菌。

在一些特定的实施方案中，其中L)中的第二表达载体选自：大肠杆菌原核表达载体、酵母表达载体和杆状病毒表达载体，优选地为大肠杆菌表达载体，且其中所述第二宿主菌选自：大肠杆菌、酵母及昆虫细胞，优选地为大肠杆菌。

附图说明

图1为第一轮PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M：DL2000 DNA Marker；n：PCR阴性对照；1：VHHpprv第一轮PCR产物；

图2为第二轮PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1～5：VHHpprv第二轮PCR产物；

图3为鉴定初级纳米抗体库容度的凝胶电泳图，其中，M：DL2000 DNA Marker；n：PCR阴性对照；1-52：VHHpprv-p5E/TG1文库阳性率鉴定PCR产物；

图4为小反刍兽疫F蛋白纳米抗体在第二宿主菌中表达后宿主菌裂解液的蛋白的凝胶电泳图，其中，1:蛋白Marker；2:阴性对照破碎上清；3:阴性对照破碎沉淀；4:小反刍兽疫F蛋白纳米抗体破碎上清；5:小反刍兽疫F蛋白纳米抗体破碎沉淀；

图5重组表达载体PPRV-Nb-pCSF图；

图6为小反刍兽疫F蛋白纳米抗体纯化后的蛋白凝胶电泳图，其中，1:蛋白Marker；2:纳米抗体离心上清；3:纳米抗体离心沉淀；4:纳米抗体流穿液；5-12:纳米抗体纯化蛋白。

发明详述

目前小反刍兽疫尚未形成有效的治疗方法，只能通过疫苗预防，而建立快速、有效的PPRV检测方法，能够为消灭小反刍兽疫提供技术支撑。本申请为解决以上问题提供了方案。本申请使用噬菌体淘筛技术，创造性地获得了针对PPRV的高效价中和抗体，由于该抗体为纳米抗体，方便合成及大量生产，因此可用于小反刍兽疫的预防和治疗。基于该抗体对PPRV-F的良好的特异性，该抗体还可用于PPRV的快速检测。并且，本申请还提供了用于实现所述PPRV纳米抗体的制备及纯化方法，可用于所述PPRV纳米抗体的工业化生产。

定义

如本文所用，术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体也可以是免疫球蛋白分子的多聚体。术语“重链”(“CH”)、“轻链”(“CL”)、“重链恒定区”、“轻链恒定区”、“轻链可变区”(“VL”)、“重链可变区”(“VH”)、“骨架区”(“Framework Region，FR”)、“互补决定区”(“CDR”)是抗体的组成部分，通过不同的组合可以形成不同种类的抗体。例如常规IgG抗体是由两条轻链和两条重链组成的四聚体。其中，VL及VH均由不同的CDR和FR组成，CDR包含与抗原接触的残基，决定VL及VH的抗原特异性，FR用于维持可变区结构并决定CDR环的位置。通常，重链可变区和重链恒定区组成一条完整的重链，而轻链可变区与轻链恒定区组成一条完整的轻链。

在本文中，术语“纳米抗体”与“重链可变区单域抗体”或“VHH”(variable domainof heavy chain of heavy-chain antibody)可互换使用，即仅由抗体重链的可变区组成的单域抗体。由于其相对分子尺寸为纳米级，故被称为纳米抗体。驼科动物重链抗体的可变区和人抗体重链可变区结构非常相似，包含三个互补决定区(CDR)和各CDR两侧的共四个骨架区(FR)。纳米抗体能像正常抗体一样与抗原紧密结合，但不像单链抗体那样容易相互粘连聚集成块。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、易于改造工程化改造等优势。

如本文所用，“双价纳米抗体”由两个VHH连接或融合而成，所述两个VH H分别包含的抗原结合位点可以相同也可以不同。同样的，“多价纳米抗体”是由多个各自具有完整抗原结合位点的VHH连接或融合而成。双价纳米抗体可以结合两个抗原表位，多价纳米抗体可以结合多个抗原表位。

在本文中，VHH的“抗原结合片段”是指仅包含完整VHH的一部分的蛋白质片段，通常包括完整VHH的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。

如本文所用，“融合纳米抗体”是指与其他结构，通过，例如基因工程技术或化学反应，结合而形成的新的融合分子。所述其他结构选自，例如：能延长VHH半衰期的分子、酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在用于临床治疗时，往往需要药物在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于其发挥作用。因此，通过将纳米抗体和寿命较长的分子(例如白蛋白、抗体Fc端等)融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。

如本文所用，术语“HcAb”即功能性重链抗体，已知可以由驼科动物和鲨鱼自然产生。相比于常规IgG抗体，HcAb不含轻链多肽，由缺乏第一恒定区(CH1)的两条重链形成二聚体。单独的HcAb的重链可变区可构成VHH。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指来源于一个物种的抗体(例如驼科动物抗体，VHH等)，其恒定区和/或FR结构被替换为来源于另一个物种的对应结构，从而形成的新的抗体。参见例如PCT/US86/02269、EP173,494。

在本文中，术语“治疗药物”是指在作用靶点对小反刍兽疫的症状有改善作用，可杀伤PPRV，或对PPRV生命周期的任意阶段有抑制作用的分子。术语“标记分子”是指与抗体结合后，可通过颜色、化学反应、激发光、质谱等指示抗体位置或量的分子。包括例如：碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、荧光素、荧光蛋白、同位素等。

如本文所用，术语“噬菌粒”是丝状噬菌体衍生的载体，其基本成分主要包括质粒的复制起点、选择标记、基因间隔区(IG区)，通常还包含负链和正链的包装序列和复制起点、噬菌体外壳蛋白的基因、限制性内切酶识别位点、启动子和编码信号肽的DNA片段。此外，噬菌粒还可以包含一个分子标签，以方便筛选基于噬菌粒的文库。噬菌粒无法独立完成子代噬菌体颗粒的组装，完成其生命周期所需的其他结构和功能蛋白质由辅助噬菌体提供。而辅助噬菌体是一种自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体突变型，因此辅助噬菌体与噬菌粒包装形成的噬菌体共同感染宿主菌时，可包装大量含有噬菌粒的噬菌体，而仅包装少量辅助噬菌体。

如本文所用，“质粒”是指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质或细胞核中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

术语“载体”是指通过其可以将多核苷酸序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等。其中“病毒载体，”是由病毒基因组改造而成的载体，其通过病毒侵染将外来基因引入宿主细胞。

如本文所用，术语“特异性结合”是指结合亲和力(抗原抗体结合的平衡解离常数KD)为至少10

本申请中,术语“多核苷酸”或“核酸”、“核酸分子”可互换使用，包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。

如本文所用序列的“同一性”是指氨基酸序列之间或核苷酸序列之间通过序列比对软件，例如BLAST，确定的相似程度。

除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

中和抗体及其复合物

一方面，本申请提供了一种PPRV的中和抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PPRV-F，包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，其中：

(a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：9(SGSTFSNLAMG)所示；

(b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：10(SRGGGNTFYRDSVKGRFT)所示；

(c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：11(AARDGEYAVSVYYEYHYWG)所示；：

在一些实施方式中，所述重链可变区序列包含如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，或所述重链可变区包含与SEQ ID NO：1具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述PPRV的中和抗体选自：HcAb、纳米抗体(VHH)、嵌合抗体、双价纳米抗体、多价纳米抗体、或融合纳米抗体。

本领域技术人员应当知晓，由于重链可变区由CDR和相对保守的FR组成，通过序列比对可以从所述重链可变区中确定CDR序列。通过将所述重链可变区的FR替换为与另一物种抗体的FR，可以降低所述重链可变区所在抗体的免疫原性，使其更加适用于在所述另一物种体内使用。通过这种方法可以构建嵌合纳米抗体。

纳米抗体本身的优势在于其高水溶性、高耐性、高稳定性、低免疫原性、及较强的组织穿透力，因此易于储藏和运输，便于体内施用。并且由于其分子质量小、结构简单，可由单一基因编码，因此易于大规模生产，且价格低廉。然而纳米抗体半衰期较短，与常规抗体相比，具有更快的血清清除速度，在疾病治疗时，难以在体内靶器官停留较长的时间，因而不利于其发挥相应功能。因此，在一些实施方案中，通过基因工程技术、抗体偶联技术等，可以容易地将VHH改造成新的融合分子，即：融合纳米抗体，从而延长其半衰期，使其达到更好的治疗效果。在一些特定的实施方案中，可以将VHH构建成双特异性抗体或多特异性抗体，即双价纳米抗体或多价纳米抗体。在一些特定的实施方案中，可将VHH与抗血清白蛋白偶联、对VHH进行聚乙二醇化、或将VHH与Ig的Fc段连接在一起，来构建融合纳米抗体。

在一些实施方案中，所述抗体为驼源抗体。在一些实施方案中，所述抗体为驼源纳米抗体。在一些实施方案中，所述抗体为羊驼源纳米抗体。

一方面，本申请还提供了一种复合物，其包含前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段，并且进一步包括功能化合物。其中所述功能化合物选自：治疗药物或标记分子。在一些实施方案中，治疗药物可以是任何可干扰PPRV复制、增殖、及PPRV生命周期中任何其它阶段的药物，例如干扰素及其它特异性抗体等。在一些实施方案中，所述标记分子可选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记分子，荧光蛋白分子，荧光素分子，生物素分子，同位素等显影剂。

核酸分子、构建体、病毒、噬菌体及细胞

一方面，本申请还提供了一种编码前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含：如SEQ ID NO：2中所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：2中所示的多核苷酸序列具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：2的简并序列，所述简并序列编码SEQ ID NO：1中的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1不同，但与SEQ ID NO：1具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

一方面，本申请还提供了一种构建体，其包含所述编码前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的核酸分子，其中所述构建体选自：噬菌粒、质粒、病毒载体、或线性核酸。所述构建体可用于前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的表达。

另一方面，本申请还提供了一种病毒、噬菌体或细胞，所述病毒、噬菌体或细胞表达或展示前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述病毒、噬菌体或细胞包含所述编码前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，所述病毒、噬菌体或细胞包含前述构建体。在一些实施方案中，所述细胞为细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如酿酒酵母)、哺乳动物细胞、或植物细胞。在一些实施方案中，所述噬菌体选自M13噬菌体或λ噬菌体。

药物组合物

一方面，本申请还提供了一种用于治疗或预防小反刍兽疫的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述药物组合物包含所述中和抗体或其抗原结合片段的复合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含编码前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，所述药物组合物包含前述构建体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含所述病毒、噬菌体或细胞。在一些特定的实施方案中，所述病毒、噬菌体或细胞将所述中和抗体或其抗原结合片段展示于其表面，从而在施用于动物体时直接发挥所述中和抗体或其抗原结合片段对PPRV的抑制或中和作用。在一些特定的实施方案中，所述病毒、噬菌体或细胞包含编码所述中和抗体或其抗原结合片段的核酸，在进入动物体并到达靶器官后，表达所述中和抗体，进而发挥对PPRV的抑制或中和作用。在一些实施方案中，所述细胞属于肠道正常菌群中的细菌或益生菌，可通过口服方式给药从而治疗或预防PPRV。

因此，另一方面，本申请还提供了一种预防或治疗PPRV感染的方法，包括向感染PPRV的动物或PPRV的易感动物施用所述药物组合物。

检测试剂盒

本申请还提供了一种用于治检测PPRV的试剂盒。在一些特定的实施方案中，所述试剂盒是体外检测试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒是免疫检测试剂盒，例如ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒，其包含前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒是体内无创诊断试剂盒，其包含前述复合物。在一些实施方案中，所述体内无创诊断试剂盒可用于选自以下的显像方法：放射免疫显像或靶向超声造影。当用于放射免疫显像时，所述复合物为前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段与放射性核素的复合物。当用于靶向超声造影时，所述复合物为前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段与超声造影剂的复合物。

在优选的实施方案中，所述检测试剂盒中包含的PPRV的中和抗体或其抗原结合片段为纳米抗体。在免疫检测试剂盒中，由于纳米抗体体积小，其可以高密度牢固地结合在固相载体上以捕捉微量的抗原，提高检测的敏感性。在体内无创诊断试剂盒中，一方面纳米抗体由于在体内半衰期短，易于代谢和快速清除，因此可降低与其复合在一起的造影剂或显像剂在体内存留的时间提高安全性；另一方面纳米抗体由于分子小，穿透性好，亲和力高，因此具有良好的组织渗透性，及较高的信噪比。

制备方法

本申请还提供了前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括如下步骤：

1)使用PPRV-F免疫驼科动物；

2)鉴定并采集1)中PPRV-F免疫的驼科动物包含VHH编码核酸序列的核酸，并使用噬菌体展示技术，利用所述核酸，构建展示所述VHH的噬菌体文库；

3)通过噬菌体淘筛技术对2)中所述的噬菌体文库进行N次噬菌体淘筛，以获取具有PPRV-F特异性的噬菌体文库，其中N取自任意正整数；

4)从所述具有PPRV-F特异性的噬菌体文库中获取单克隆，并使用PCR、和/或噬菌体ELISA技术鉴定对PPRV-F具有高特异性的噬菌体阳性单克隆，从所述噬菌体阳性单克隆中鉴定并获取VHH或其抗原结合片段的氨基酸序列和/或其编码核酸序列；

5)将步骤4)所述的编码核酸序列表达成蛋白，并通过蛋白纯化技术从所述蛋白中纯化VHH。

免疫动物、噬菌体展示技术、建立噬菌体文库、噬菌体淘筛技术、PCR、噬菌体ELISA、鉴定并获取阳性单克隆中VHH或其抗原结合片段的氨基酸序列和/或其编码核酸序列、蛋白表达以及蛋白纯化技术都是本领域内常规的技术手段，本领域技术人员均可以通过查阅相关技术手册获取其常规实施步骤。

然而，对于特定的抗体或其抗原结合片段的制备，如何恰当组合上述技术，在使用前述各种技术时各参数的设定调配都将影响最终获取抗体的质量。因此，要获取高质量的特定抗体或其抗原结合片段，所述制备方法是本领域技术人员无法通过现有技术直接推测出的。

本申请的实施例，列举了一些优选的制备方法。最终的结果数据显示了所述制备方法可以成功获取高特异性的前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。例如，在一些实施方案中，所述驼科动物为羊驼。在一些实施方案中，鉴定并采集包含VHH编码核酸序列的核酸包括两次PCR，所述两次PCR分别使用的两对引物如SEQ ID NO：3和4以及SEQ ID NO：5和6中所示。在一些实施方案中，所述N等于3，所述N次噬菌体淘筛中使用的PPRV-F浓度依次为：10～20μg/mL、5～10μg/mL、1～5μg/mL。在一些实施方案中，所述噬菌体需要与辅助噬菌体共同感染才能获得下一代噬菌体，其中所述辅助噬菌体为M13辅助噬菌体。

在一些实施方案中，所述的制备方法具体包括如下步骤：

A)使用PPRV-F免疫驼科动物；

B)采集经过步骤A)的驼科动物的淋巴细胞，提取所述淋巴细胞的总RNA并将所述总RNA反转录制备cDNA；

C)使用针对所述驼科动物抗体编码序列的引物，对B)中的cDNA进行PCR，扩增包含所述驼科动物抗体核酸编码序列的DNA，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收与包含所述驼科动物抗体核酸编码序列的DNA大小对应的条带，即为第一轮PCR产物；

D)使用针对所述驼科动物VHH编码序列的引物，对第一轮PCR产物进行PCR，扩增包含所述驼科动物VHH编码核酸序列的DNA，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收与包含所述驼科动物VHH编码核酸序列的DNA大小对应的条带，即为第二轮PCR产物；

E)通过基因重组的方法将第二轮PCR产物连接至第一表达载体，并将所述第一表达载体转化至第一宿主菌的感受态细胞，这些包含所述第一表达载体的第一宿主菌混合物即初级抗体库；

F)鉴定E)的初级抗体库中包含驼科动物VHH编码核酸序列的阳性第一宿主菌比例及所述阳性第一宿主菌中驼科动物VHH编码核酸序列的多样性；

G)当满足下述条件时则将所述初级抗体库用于步骤8)，当不满组下述条件则重复A)至G)或C)至G)中的步骤：

所述阳性第一宿主菌比例为：大于90％，且

所述多样性为30个测序结果均为独立序列，多样性良好；

H)用满足G)中条件的初级抗体库包装噬菌体，即获得包含驼科动物VHH编码核酸序列的噬菌体，以一定浓度的PPRV-F为抗原包被容器，将所述包含驼科动物VHH编码核酸序列的噬菌体放置于所述容器中进行噬菌体淘筛，通过N次噬菌体淘筛筛选具有PPRV-F特异性的噬菌体，并用所述具有PPRV-特异性的噬菌体感染第一宿主菌，经所述噬菌体感染的第一宿主菌混合物称为经淘筛的抗体库；

I)将H)中所述经淘筛的抗体库涂布于平板培养基上，培养并挑取单克隆，鉴定包含驼科动物VHH编码核酸序列的第一阳性单克隆；

J)使用所述第一阳性单克隆包装噬菌体，通过噬菌体ELISA技术筛选对PPRV-F特异性高的噬菌体，所述对PPRV-F特异性高的噬菌体所源自的单克隆即第二阳性单克隆；

K)对第二阳性单克隆或其包装的PPRV-F特异性的噬菌体进行测序，获得特异性结合PPRV-F的VHH或其抗原结合片段的氨基酸序列或其编码核酸序列。

L)将步骤K)的所述编码核酸序列连接至第二表达载体，并将所述第二表达载体转染至第二宿主菌中进行表达，获得表达特异性结合PPRV-F的VHH或其抗原结合片段的第二宿主菌；

M)提取所述表达特异性结合PPRV-F的VHH或其抗原结合片段的第二宿主菌中的蛋白，并从中纯化出VHH。

在一些特定的实施方案中，C)中针对所述驼科动物抗体编码序列的引物如SEQ IDNO：3和4中所示。

在一些特定的实施方案中，其中D)中针对所述驼科动物VHH编码序列的引物如SEQID NO：5和6中所示。

在一些特定的实施方案中，其中所述鉴定E)的初级抗体库中包含驼科动物VHH编码核酸序列的阳性第一宿主菌比例的方法包括如下步骤：

a)将所述初级抗体库涂布于平板培养基上进行培养，获得第一宿主菌的单克隆；

b)挑取第一宿主菌单克隆，并使用PCR对所述驼科动物VHH编码核酸序列进行扩增；

c)计算可获得所述驼科动物VHH编码核酸序列目的条带的第一宿主菌单克隆占全部挑取的第一宿主菌单克隆的比例，即为所述初级抗体库中包含驼科动物VHH编码核酸序列的阳性第一宿主菌比例。

在一些特定的实施方案中，其中b)中PCR使用的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

在一些特定的实施方案中，其中H)中的N为大于或等于3的整数。

在一些特定的实施方案中，其中H)中的N等于3，所述N次噬菌体淘筛中使用的所述一定浓度的PPRV-F依次为：1～100μg/mL、0.1～50μg/mL、0.01～50μg/mL。

在一些特定的实施方案中，其中所述第一宿主菌为含有F质粒的大肠杆菌，所述第一表达载体为噬菌粒，并且H)中包含驼科动物VHH编码核酸序列的噬菌体以及具有PPRV-F特异性的噬菌体均为需要与辅助噬菌体共同感染第一宿主菌，才能获得用于下一次噬菌体淘筛的噬菌体。在一些特定的实施方案中，其中所述噬菌粒为M13噬菌粒，所述辅助噬菌体为M13辅助噬菌体。在一些特定的实施方案中，其中所述含有F质粒的大肠杆菌为TG1大肠杆菌。

在一些特定的实施方案中，其中L)中的第二表达载体选自：大肠杆菌原核表达载体、酵母表达载体和杆状病毒表达载体，优选地为大肠杆菌表达载体，且其中所述第二宿主菌选自：大肠杆菌、酵母及昆虫细胞，优选地为大肠杆菌。

纯化方法

本申请还提供了一种纯化前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的方法，包括：

1)将包含有所述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的混合物加入镍柱中，其中所述镍柱的填料类型为Smart-NI；

2)通过约250mM的咪唑溶液洗脱出所述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述填料也可以为其他与Smart-NI具有相同或相似吸附能力及孔径的填料。在一些实施方案中，所述约250mM包含200-300mM的范围，例如210-290mM、220-280mM、230-270mM、240-260mM等。

所述纯化方法可用于前述制备方法的纯化步骤，亦可用于其他任何包含前述PPRV的中和抗体或抗原结合片段的混合物。如实施例所示，通过所述纯化方法可去除绝大部分蛋白杂质，并使经纯化的蛋白达到1:20的中和效价。

此外，本申请还提供了用于测定前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段的抗体中和效价的方法。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

应当理解，以上描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面，优点和修改对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例1：小反刍兽疫病毒F蛋白初级纳米抗体库的制备

1.使用小反刍兽疫病毒F抗原蛋白对羊驼进行免疫

将小反刍兽疫病毒F蛋白(浙江海隆生物科技有限公司，蛋白批号为：G001190816-p122M1)通过背部皮下多点注射的方式对羊驼进行免疫，共免疫4次，免疫间隔为14天，最后一次免疫后第7天采血。具体免疫过程如下表1所示。

表1.免疫计划

2.ELISA检测血清抗体效价

用小反刍兽疫病毒F蛋白200ng/孔进行包被96孔板，4℃放置过夜；第二天用PBST(0.1％)洗板6次，然后用200μL/孔的3％BSA在37℃封闭2h，再用PBST(0.1％)洗板5次；每孔加入由MPBS 2倍梯度稀释的免疫羊驼血清100μL，37℃孵育1h，弃血清。用PBST(0.1％)洗板5次，按100μL/孔加入1:15000稀释的HRP标记的兔抗羊驼IgG抗体,37℃孵育1h；PBST(0.1％)洗板5次。按照100μL/孔加入TMB显色液，避光放置20min，每孔加入50μL浓度为2M的H

3.纳米抗体噬菌体展示库的构建

3.1外周血淋巴细胞分离

将准备好的离心管、生理盐水、PBS、淋巴细胞分离液放入超净工作台，紫外灭菌20-30min；血液样品稀释，收集1中经免疫的羊驼抗凝血与等体积的生理盐水混合，血液稀释过程中应该去除抗凝剂体积，例如：若100mL新鲜抗凝血含有10mL抗凝剂，则应加90mL生理盐水稀释。颠倒混匀淋巴细胞分离液；取6个15mL离心管，各加入4mL淋巴细胞分离液；吸取4mL稀释混合液，将稀释过的抗凝血沿离心管壁缓缓叠加到淋巴细胞分离液上；2000rpm室温离心30min；此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。用吸管收集第二层细胞至另一干净的离心管中；在离心管中至少加入6mLPBS，充分混匀后，1000rpm离心10min，弃上清；再加入6-8mL PBS重悬淋巴细胞，轻轻混匀后，1000rpm离心10min，弃上清；将6管细胞收集在1管内，即为分离的淋巴细胞，按照此方法分离全部血液样品。最终将分离到的淋巴细胞用4mLPBS重悬，移至1.5mL无RNA酶EP管中。

3.2VHH基因的扩增

3.2.1cDNA的制备

将3.1中得到的淋巴细胞进行总RNA提取，反转录制备cDNA。

3.2.2第一轮PCR扩增

然后以cDNA为模板，使用引物VHH1-F和VHH1-R扩增羊驼抗体可变区片段，取适量PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示，其中引物VHH1-F和VHH1-R的序列如下：

引物VHH1-F序列：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’(SEQ ID NO：3)。

引物VHH1-R序列：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO：4)。

3.2.3第二轮PCR扩增

以回收产物作为第二轮PCR反应的模板，用引物VHH2-F和VHH2-R扩增高变区VHH片段，取适量PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示，其中引物VHH2-F和VHH2-R的序列如下：

引物VHH2-F序列：

5’-TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCGCCCAAGTACAACTGGTC-3’(SEQ ID NO：5)。

引物VHH2-R序列：

5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCCCGGGCTGAGGCTTGG-3’(SEQ ID NO：6)。

3.2.4将得到的VHH基因片段连接入第一表达载体，并转化至感受态细胞，构建抗体免疫库；

将VHH目的基因片段与pCANTAB5E噬菌粒载体分别使用Sfi I和Not I限制性内切酶双酶切，经琼脂糖凝胶回收；使用T4 DNA连接酶将纯化的VHH目的基因片段与双酶切处理后的噬菌粒载体pCANTAB 5E连接。将连接产物经电穿孔法转入新制备的E.coli TG1感受态细胞(Amid Biosciences，Catalog#ETG1-201)中，电穿孔仪设置电压为1.8KV，电转化完成后37℃200r/min振荡培养1h，取100μL进行梯度稀释计算电转化效率；剩余菌液涂布氨苄抗性固体平板，30℃过夜培养。

使用LB培养基冲洗平板上固化的菌落并收集到250mL灭菌锥形瓶中，取100μL菌液进行梯度稀释后涂布氨苄抗性平板，过夜培养后计数各稀释度平板上的菌落数，根据菌落数及稀释倍数计算抗体文库的库容；随机挑取50个单菌落分别于5mL LB培养基中过夜培养，以过夜培养的菌液作为模板，使用VHH3-F和VHH3-R引物进行PCR反应，鉴定阳性克隆比例。将阳性克隆菌提取质粒后送第三方测序，鉴定抗体文库基因序列多样性。其中，引物VHH3-F和VHH3-R引物序列如下：

引物VHH3-F序列：CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC(SEQ ID NO：7)。

引物VHH3-R序列：CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC(SEQ ID NO：8)。

结果，将连接产物通过电穿孔转入新鲜制备的E.coli TG1感受态细胞中，电转化后获得转化子数为1.2×10

实施例2：对建立的初级纳米抗体库进行筛选

其步骤如下：

特异性抗体的淘选

(1)将VHH连接产物电转至E.coli TG1后即形成所述初级抗体库(步骤同实施例1)。取初级抗体库一支(1mL)，加入250mL 2×YT-G(2％葡萄糖)培养基中，37℃，250rpm，培养1h；

(2)取培养液，测定细菌浓度，加入100μg/mL Amp和Moi＝20:1的辅助噬菌体M13KO737℃水浴轻摇30min，再37℃摇床培养30min；

(3)4000rpm离心10min，小心弃上清；

(4)用2×体积(500mL)的2×YT-AK培养基悬浮细菌沉淀，37℃，220rpm，培养过夜；

(5)10000rpm离心20min，取上清至另一新管中，准备进行淘筛；

(6)加100mL的PEG(Aladdin，CAS 25322-68-3)/NaCl(上海国药，CAS 7647-14-5)，4℃冰浴，不超过1h；

(7)4℃，8000rpm离心20min，弃上清，控干；

(8)用5mL的2×YT培养基(上海西格生物科技有限公司，XG-S63629)悬浮噬菌体沉淀，再次10000rpm离心15min，取上清备用；按照MPBS:上清＝2:3的比例将MPBS和噬菌体上清混匀，室温下去除细胞碎片干扰，处理20min；

(9)提前一天将免疫管用F蛋白抗原包被(包被量2mL/管)；

(10)包被完毕，用PBS洗管3次，拍干；

(11)用封闭液(2％脱脂乳PBS，MPBS)封闭免疫管，37℃封闭2h；

(12)弃封闭液，用PBS洗管3次，拍干；

(13)向封闭好的免疫管加入(8)中处理过的噬菌体上清混合液，2mL/管，轻摇温育30min，再静置温育1.5h；

(14)弃去免疫管内噬菌体上清，用PBST(0.1％)洗涤5次，再用PBS洗涤3次，拍干；

(15)洗脱：加入宿主菌TG1(OD600＝0.5)，4mL/管，37℃，150rpm振荡培养1h，此时，完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库；

(16)取振荡培养的菌液，用2×YT培养基做倍比梯度稀释，取稀释液100μL涂布SOBAG平板，30℃培养过夜，计算输出淘筛步骤的噬菌体量；

(17)向一级库中，加入终浓度为100μg/mL Amp和2％葡萄糖，同时加入4×10

(18)5000rpm室温离心10min，去上清，用100mL 2×YT-AK轻悬细胞，37℃，220rpm，培养过夜；

(19)从以上第5步骤，进行循环淘筛，开始下一轮淘筛；

(20)最终经4轮淘筛，取获得的菌液做倍比梯度稀释，取稀释液100μL涂布SOBAG平板，30℃培养20-24h。剩余菌液-80℃冻存，标记为四级抗体库。

实施例3Phage-ELISA鉴定抗原阳性重组抗体

1.从四级抗体库中单克隆表达重组抗体

(1)从第4轮稀释后的平板上随机挑选单克隆，于400μL 2×YT-AG培养基中过夜培养；

(2)菌液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆在96孔板上排为一板，此板标记为MasterPlate；

(3)另取新的灭菌EP管，每管加入400μL含有2.5×10

(4)将Master Plate中的细菌培养液每管取40μL至P1 Plate；

(5)将P1 Plate中的EP管置于摇床，37℃，150rpm，振荡培养2h；

(6)4000rpm离心20min，小心去上清；

(7)每个EP管加入400μL 2×YT-AK培养液，37℃，220rpm振荡培养过夜；

(8)7000rpm离心20min，取上清放于4℃备用。本文将所述上清称为重组抗体液。

2.Phage ELISA

(1)包被：按照最佳包被条件，用F蛋白包被ELISA板，设立阳性对照和阴性对照；

(2)洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次；拍干；

(3)封闭：加入2％MPBS至满孔，37℃封闭1.5h；

(4)洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干ELISA板；

(5)加重组抗体液：提前将160μL重组抗体液和40μL MPBS混匀，室温孵育20min，加入封闭好的ELISA板孔内，37℃反应2h；

(6)洗涤：弃液体，先用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干；

(7)加酶标二抗：将HRP标记抗M13单抗用2％MPBS做1:4000稀释，200μL/孔，37℃孵育1h；

(8)洗涤：弃二抗，洗涤同上，拍干；

(9)显色：加入200μL/孔TMB显色液，室温显色45min左右；

(10)终止：用200μL/孔终止液，终止显色，用酶标仪于450nm处读值。

通过间接ELISA方法检测94个单克隆对应的噬菌体上清同F蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了效果最好的20个单克隆抗体，该20个单克隆同F蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱。

(11)将挑选出的与F蛋白有较好反应性的单克隆抗体菌群通过PCR的方法扩增得到噬菌体展示的纳米抗体基因并进行测序，只得到一个小反刍兽疫F蛋白纳米抗体氨基酸序列：SEQ ID NO：1和核苷酸序列：SEQ ID NO：2。

同时利用与已发表纳抗序列比对分析方法(http://www.vbase2.org/vbdnaplot.php)，确认了上述挑选出的抗体的CDR部分，分别为SEQ ID NO：9所示的CDR-H1，SEQ ID NO：10所示的CDR-H2，以及SEQ ID NO：11所示的CDR-H3。

实施例4通过重组构建第二表达载体并鉴定

1.小反刍兽疫F蛋白纳米抗体的表达

(1)将纳米抗体重组载体PPRV-Nb-pCSF转化入BL21(DE3)感受态菌中，制备表达菌，取过夜培养的表达菌，按1:100比例，接种于含50μg/ml Amp的600ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.5-0.8；

(2)在600ml LB培养基中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，160rpm于22℃培养5h；

(3)5000rpm，4℃离心5min，离心去上清收集菌体，-20℃保存；

(4)超声破碎菌体

破碎条件：150W功率，破碎1s，间隔1.5s，共20min，破菌缓冲液：PBS，pH7.4。

使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测试的菌体蛋白表达结果如图4所示。其中，箭头所指位置为含有标签蛋白的目的蛋白(特异性结合PPRV-F的VHH)条带位置。重组表达载体PPRV-Nb-pCSF图谱如图5所示。

2.小反刍兽疫F蛋白纳米抗体纯化

破碎后的菌体12000rpm，离心10min，4℃，收集上清进行镍柱纯化，填料类型为Smart-NI。平衡液：PBS，pH7.4，洗脱液：PBS，250mM imidazole(咪唑)，pH7.4。纯化结果如图6所示。

实施例5小反刍兽疫F蛋白纳米抗体中和抗体效价测定试验

(1)将病毒含量为10

(2)将浓度为2mg/ml的来自实施例4的纳米抗体用不含血清的MEM培养液做2倍系列稀释至1:128；

(3)将上述不同稀释度(1:2～1:128)的纳米抗体加入96孔细胞培养板中，每个稀释度重复4孔，100μl/孔。

(4)将稀释好的PPRV中和抗原液(病毒含量为100TCID

(5)向上述含有中和液的96孔细胞培养板中加入Vero细胞悬液，100μl/孔。置37℃、5％CO

(6)设病毒回归对照组，将(1)中的中和抗原液记为10

(7)同时设正常细胞对照组(200μl不含血清的MEM培养液+100μlVero细胞悬液)、阳性血清对照组(100μl阳性血清+100μl中和抗原+100μl Vero细胞悬液)和纳米抗体毒性对照组(100μl纳米抗体稀释液+100μl不含血清的MEM培养液+100μlVero细胞悬液)，各做4孔重复；

(8)根据CPE情况，用Reed-Muench两氏法计算纳米抗体中和抗体效价结果。中和试验数据统计见表2。

表2：中和试验数据统计

(9)试验成立条件：病毒回归对照组，10

(10)根据表2结果，代入下列公式进行计算：

距离比例＝(高于50％的百分数-50％)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)＝(75-50)/(75-0)＝0.33

lg PD

PD

得出该纳米抗体的中和效价为1:20。

由上述实施例可知，本发明提供了一种小反刍兽疫病毒F蛋白纳米抗体和小反刍兽疫病毒F蛋白纳米抗体的制备、纯化及中和试验方法。通过此方法能够实现高纯度小反刍兽疫病毒F蛋白纳米抗体的工业化生产，为有效防控小反刍兽疫提供新的手段和方法。

最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对上述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

/>

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 一种小反刍兽疫病毒（PPRV）F蛋白纳米抗体和纳米抗体的制备、纯化及中

和试验方法

<130> PE01536

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 1

Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly

1 5 1015

Gly Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Asn

202530

Leu Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Thr Arg Glu Arg

354045

Val Ala Ala Ile Ser Arg Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser

505560

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

65707580

Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

859095

Cys Ala Ala Arg Asp Gly Glu Tyr Ala Val Ser Val Tyr Tyr Glu Tyr

100 105 110

His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys

115 120 125

Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gly

130 135

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 2

gcccaagtac aactggtcga gtctggggga ggattggtgc aaactggggg ctctatgaga 60

ctctcctgtg cagcctctgg aagcaccttc agtaacttag ccatgggctg gttccgccag 120

gctccaggca agactcgcga gcgtgttgca gcgattagtc ggggtggtgg taatacattt 180

tatagagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccaagg acaacgccaa gaacacgctg 240

aatctgcaaa tgaacagttt gaaacctgag gacacggccg tttattactg tgcggcgagg 300

gatggggaat atgccgtatc ggtgtactat gagtatcact actggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct cctcagaacc caagacgccc aagcctcagc 400

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 3

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 4

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 5

tttctattac taggcccagc cggccgccca agtacaactg gtc 43

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgccc cgggctgagg cttgg 35

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 7

ccatgattac gccaagcttt ggagcc 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 8

cgatctaaag ttttgtcgtc tttcc 25

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 9

Ser Gly Ser Thr Phe Ser Asn Leu Ala Met Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 10

Ser Arg Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg

1 5 1015

Phe Thr

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 11

Ala Ala Arg Asp Gly Glu Tyr Ala Val Ser Val Tyr Tyr Glu Tyr His

1 5 1015

Tyr Trp Gly