一种用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法、合成方法、探针池及其应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法、合成方法、探针池及其应用。

背景技术

一直以来，古生物及疾病样品存在着内源DNA含量低和易污染及样品难获取等问题，这些因素制约了相关研究领域工作的开展。针对疾病相关的病原微生物，首先困扰的问题是样品中病原微生物DNA含量低。随医疗条件和环境的改善，很多传染性疾病已非广泛存在，如麻风、结核、或一些其他烈性疾病。其样本保存条件受年代和环境因素等影响，导致病原体微生物DNA在保存过程中降解或本身含量较低。其次，样品来源少，一般样品来自医院早期保存、博物馆样品、考古样品等，但样品总量偏少。在古生物和动物保护研究领域，一些稀有动物或已灭绝动物的保护工作开展受阻，已灭绝的博物馆标本动物样品，存在保存状态差、易降解；而来源于考古发掘获得的动物样品同样存在相关问题，因此DNA含量低且容易为外源DNA所污染。即使通过高通量测序技术，测序数据仍然很难达到分析需要的覆盖度和深度。所获得的DNA片段信息多是复杂的环境微生物DNA或者其他类型的外源DNA，这极大程度的影响到高通量测序的质量和成本。此时捕获技术的应运而出，有效提高了针对目标区域的测序质量。目标区域特定片段捕获技术的发展在此期间起到至关重要的作用，而成就这一技术的关键步骤既是捕获探针的获取。

获取目标区域捕获探针，以往是依赖于基因芯片直接合成，而这种方式，成本高、片段长度受限、极少接受个性化定制，不利于目前研究需要。而古遗传学研究领域具有样品多样化的特点，且随着前沿科学问题的不断推进对个性化定制的需求越来越大。显然目前的探针产生方式，不适用于古遗传学领域。

围绕古DNA开展的古遗传学研究受限于化石难于获得、内源DNA含量低、片段短且分布不均的问题，一直亟待有效的解决方案。针对古生物(尤其古人类自身线粒体DNA、核DNA、和相关的疾病、伴生动物等)的目标区域捕获探针的设计和合成生产，成为解决这一系列问题的途径。

因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法、合成方法、探针池及其应用，以解决或改善现有技术中的捕获探针对于DNA含量低和/或易降解样本的富集效果差的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法，包括下述步骤：(1)根据分割长度，以覆瓦形式设计覆盖样本靶基因整个目标区域的多个核酸片段；(2)分别在多个所述核酸片段的两端加入接头，即可设计得到用于捕获样本目标DNA的探针池。

优选地，所述覆瓦形式为2-3bp的覆瓦形式。

优选地，所述分割长度为52bp。

优选地，步骤(2)中，所述核酸片段5′端的接头为5′-ACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′，所述核酸片段3′端的接头为5′-CACTGCGGCTCCTCATCCACG-3′；所述探针池中，每个探针的长度为94mer。

本发明还提供了一种用于捕获样本目标DNA的探针池的合成方法，其采用下述技术方案：一种用于捕获样本目标DNA的探针池的合成方法，包括下述步骤：A.合成如上所述的设计方法设计得到的探针池，所述探针池中，每个探针合成的规模大于0.2fmol；B.对步骤A合成得到的探针池中的探针进行扩增。

优选地，步骤B包括：B1.对所述探针池中的探针进行第一轮扩增；B2.纯化第一轮扩增的产物；B3.对经步骤B纯化得到的产物进行第二轮扩增；B4.纯化第二轮扩增的产物；B5.按照步骤B1进行捕获前探针的扩增；B6.以5’端加生物素修饰的APL5引物，扩增得到单链或双链探针；步骤B1中，所述第一轮扩增的引物为APL5：5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′和APL6-adj：5′-ACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′；所述第一轮扩增的循环数为9个循环；步骤B3中，所述第二轮扩增的引物为：APL5：5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′和APL4-adj：5′-GGATTCTAATACGACTCACTATAGACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′；所述第二轮扩增的循环数为8个循环；步骤B2中，纯化得到的第一轮扩增产物中，经扩增得到双链探针长度为94bp，浓度大于10ng/μL；步骤B4中，纯化得到的第二轮扩增产物中，经扩增得到双链探针的长度为118bp，浓度为69-97ng/μL；步骤B5中，捕获前的探针扩增至浓度950-1050ng/μL。

优选地，步骤B1之前，还包括采用水或TE缓冲液将所述探针池中的探针稀释至6000copies/探针的步骤；步骤B1具体为：100μL反应体系中，Herculase II Fusion DNApolymerase 1μL，1×Herculase II reaction buffer 60μL，250μM each dNTP，400nM引物APL5和APL6-adj，去核酸酶水补足100μL；反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，9个循环后，72℃延伸5min；步骤B2具体为：PCR产物用MinElute PCRPurification Kit进行纯化，由20μL TEbuffer定容；取步骤B1的产物各1μL PCR产物进行qPCR和浓度及质量检测，1μL产物采用1∶50比例TE buffer稀释，1μL用做qPCR模板，采用两步扩增法，25μL反应体系，其中12.5μL Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 2X，noROXbuffer，200nM引物APL5和APL6-adj；反应条件：95℃预变性15min，95℃变性15s，60℃退火20s，45个循环；取1μL产物检测片段长度是否为94bp、产物浓度是否合格。

优选地，步骤B3具体为：5μL经步骤B2纯化所得的纯化产物用于第二轮扩增，100μL反应体系中，Herculase II Fusion DNA polymerase 1μL，1×Herculase II reactionbuffer 60μL，250μM each dNTP，400nM引物APL5和APL4-adj，去核酸酶水补足100μL；反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环后，72℃延伸5min；

步骤B4具体为：第二轮扩增产物用MinElute PCR Purification Kit进行纯化，由20μL TEbuffer定容；分别取1μL第二轮扩增产物进行qPCR和浓度及质量检测，1μL产物采用1∶50比例TEbuffer稀释，1μL用做qPCR模板；采用两步扩增法，25μL反应体系，其中12.5μLMaxima SYBR Green qPCR Master Mix 2X，no ROXbuffer，200nM引物APL5和APL4-adj；反应条件：95℃预变性15min，95℃变性15s，60℃退火20s，45个循环；1μL产物由生物分析仪检测片段长度是否为118bp和产物浓度是否合格；取产物1μL经核酸检测仪检测探针浓度，浓度范围需满足在69～97ng/μL；步骤B4的纯化产物既可用于后续DNA探针生成，亦可用于RNA探针生成。

本发明还提出了一种探针池，其采用下述技术方案：一种探针池，，所述探针池采用如上所述的方法合成得到。

本发明还提出了一种探针池的应用，其采用下述技术方案：如上所述的探针池在古DNA富集、司法鉴定、医学检验和动物保护中的应用。

有益效果：

本发明的用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法选择了覆瓦式(Tiling)设计方式，探针长度和探针设计排布的策略对捕获效率有很大的影响，覆瓦式的探针设计比相邻式或间隔式的探针排布富集效率更高。其次，在探针设计的过程中，片段化的序列(与样本目标DNA模板互补的核酸序列)两端同期加入接头(adapters)，后续探针合成的过程中可以连同接头一并打印，既可简化后续合成(无需再通过接头连接实验实现接头的连接)，又可有效避免因需连接接头而产生的副产物。

本发明的用于捕获样本目标DNA的探针池的合成方法可通过多轮扩增，保证产物浓度需求，降低探针成本。且还可根据PCR产物需求，可选择性扩增为单链或双链探针。

本发明的用于捕获样本目标DNA的探针池对于古代样品、博物馆样品和现代病理样本的DNA均具有较好的富集效果。

本发明的用于捕获样本目标DNA的探针池可用于古DNA富集(高度降解样本)，有望可拓展至司法鉴定(如毛发、牙齿、指纹、血液、体液等可能包含DNA的残留物)、医学检验(如特殊保存方式的降解病理样本)和动物保护(如野生动物样本中的毛发、粪便残留物和一些博物馆保存样品等)中的应用。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明针对目前古生物及疾病等高度降解样品中存在着的内源DNA含量低和易污染及样品难获取等问题，提供一种用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法，本发明实施例中，该用于捕获样本目标DNA的探针的设计方法包括下述步骤：(1)根据分割长度，以覆瓦形式设计覆盖样本靶基因整个目标区域的多个核酸片段；(2)分别在多个所述核酸片段的两端加入接头，即可设计得到用于捕获样本目标DNA的探针池。

在探针设计过程中，片段化的序列(上述步骤(1)得到的核酸片段)两端同期加入接头(adapters)，之后再合成添加接头后得到的多个探针，既可简化后续合成(省略了后续的接头连接实验)，又可有效避免因需要进行接头连接实验而产生的副产物(在连接接头的实验中，可能会发生接头丢失或接头自连等情况)。本发明采用覆瓦式(Tiling)设计覆盖靶基因整个目标区域基因组序列的探针，相较于相邻式或间隔式的探针排布，富集效率更高。

本发明优选实施例中，覆瓦形式为2-3bp的覆瓦形式。覆瓦长度主要和探针最后覆盖参考序列的深度(Depth)有关，本发明选用2-3bp的覆瓦形式，能达到20x以上的深度，捕获效率会相对于低深度(1-3x)更好。

本发明优选实施例中，分割长度为52bp。探针长度和探针设计排布的策略对捕获效率有很大的影响。该分割长度是考虑到古DNA片段较短(平均长度为50-60bp)，选择了52bp的分割长度(捕获区域长度)，在保证探针的复杂度和特异性的同时，也尽可能降低形成二级结构影响捕获的可能性。

本发明优选实施例中，步骤(2)中，核酸片段5′端的接头为：5′-ACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′，核酸片段3′端的接头为5′-CACTGCGGCTCCTCATCCACG-3′；探针池中，每个探针的长度为94mer。

本发明还提出了一种用于捕获样本目标DNA的探针池的合成方法，本发明实施例的用于捕获样本目标DNA的探针池的合成方法，包括下述步骤：A.合成如上所述的设计方法设计得到的探针池，该探针池中，每个探针合成的规模大于0.2fmol；B.对步骤A合成得到的探针池中的探针进行扩增。

具体地，步骤A可通过将设计得到的核酸片段交付商业化公司合成得到。随着技术进步，含有多个核酸片段的探针池形式在保证浓度和质量要求前提下，较之前的合成方式(直接的基因芯片合成方式)可节约更多成本。本次探针的模板(探针的浓度低，便于后续以该低浓度的探针为模板对探针进行扩增)以探针池形式按设计生成，每个Oligo(探针池中的每个探针)的合成规模＞0.2fmol，通过硅基技术合成探针(由商业化公司合成)，平台最长可合成300nt的oligo，利用硅基DNA编辑技术，一次可合成2000条以上，错误率低至1∶2000nt。

本发明优选实施例中，步骤B包括：B1.对所述探针池中的探针进行第一轮扩增；B2.纯化第一轮扩增的产物；B3.对经步骤B纯化得到的产物进行第二轮扩增；B4.纯化第二轮扩增的产物；B5.按照步骤B1进行捕获前探针的扩增；B6.以5’端加生物素修饰的APL5引物，扩增得到单链或双链探针。

本发明优选实施例中，步骤B1中，所述第一轮扩增的引物为APL5：5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′和APL6-adj：5′-ACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′，所述第一轮扩增的循环数为9个循环。

步骤B3中，所述第二轮扩增的引物为：APL5：5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′和APL4-adj：5′-GGATTCTAATACGACTCACTATAGACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′；所述第二轮扩增的循环数为8个循环。

其中，APL4-adj引物序列中含有T7-promoter序列，使得该引物后续可用于合成RNA引物；此外，步骤B4的产物(第2轮扩增并纯化后的产物)既可用于后续DNA探针生成，亦可用于RNA探针生成。再次，区别于以往单一型探针合成模式(通常的探针合成模式仅适用于DNA探针或RNA探针的合成)。多轮扩增保证产物浓度需求，从而降低探针成本。并且PCR产物根据需求，可选择性扩增为单链或双链探针。

本发明优选实施例中，步骤B2中，纯化得到的第一轮扩增产物中，经扩增得到双链探针长度为94bp，浓度大于10ng/μL；步骤B4中，纯化得到的第二轮扩增产物中，经扩增得到双链探针长度为118bp，浓度为69-97ng/μL(例如，69ng/μL、75ng/μL、85ng/μL或97ng/μL)；步骤B5中，捕获前的探针扩增至浓度950-1050ng/μL(例如，950ng/μL、1000ng/μL或1050ng/μL)。

本发明优选实施例中，步骤B1之前，还包括采用水或TE缓冲液将所述探针池中的探针稀释至6000copies/探针的步骤；

本发明优选实施例中，步骤B1具体为：100μL反应体系中，Herculase II FusionDNA polymerase 1μL，1×Herculase II reaction buffer 60μL，250μM each dNTP，400nM引物APL5和APL6-adj，去核酸酶水补足100μL；反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，9个循环后，72℃延伸5min。

本发明优选实施例中，步骤B2具体为：PCR产物用MinElute PCR PurificationKit进行纯化，由20μL TEbuffer定容；取步骤B1的产物各1μL PCR产物进行qPCR和浓度及质量检测，1μL产物采用1∶50比例TE buffer稀释，1μL用做qPCR模板，采用两步扩增法，25μL反应体系，其中12.5μL

本发明优选实施例中，步骤B3具体为：5μL经步骤B2纯化所得的纯化产物用于第二轮扩增，100μL反应体系中，Herculase II Fusion DNA polymerase 1μL，1×Herculase IIreaction buffer 60μL，250μM each dNTP，400nM引物APL5和APL4-adj，去核酸酶水补足100μL；反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环后，72℃延伸5min。

本发明优选实施例中，步骤B4具体为：第二轮扩增产物用MinElute PCRPurification Kit进行纯化，由20μL TEbuffer定容；分别取1μL第二轮扩增产物进行qPCR和浓度及质量检测，1μL产物采用1：50比例TEbuffer稀释，1μL用做qPCR模板；

采用两步扩增法，25μL反应体系，其中12.5μL

本发明还提供了一种探针池，本发明实施例的探针池采用如上所述的用于捕获样本目标DNA的探针池的合成方法合成得到。

本发明还提供了如上所述的探针池的应用：如上所述的探针池在古DNA富集、司法鉴定、医学检验和动物保护中的应用。本发明针对古生物(尤其古人类自身线粒体DNA、核DNA、和相关的疾病、伴生动物等)的目标区域捕获探针的设计和合成生产，成为解决这一系列问题的途径。通过探索性研究，我们发现本发明的特有性和拓展性。首先，本研究的初始目的在于针对古代样品，随着研究的深入，我们拓展研究至现生样品，如一些疾病和近现代博物馆动物样品。均获得了较好的效果。此外，根据已有数据推断，未来我们可以拓展研究至司法领域的样本鉴定方面(如毛发、牙齿、指纹、血液、体液等可能包含DNA的残留物)；医学检验方面，如特殊保存方式的降解病理样本；动物保护方面，如野生动物样本中的毛发、粪便残留物和一些博物馆保存样品等。成为解决上述问题的有效途径。

下面通过具体实施例对本发明的用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法、合成方法、探针池及其应用进行详细说明。

实施例1

1.1探针池设计

以麻风杆菌全基因组(Mycobacterium leprae TN，Genebank no：ASM19585v1)序列为模板，2bp覆瓦形式构建的长度为94bp的探针(单链探针)。

其中，麻风杆菌全基因组共3,268,203bp，共设计得到2,150,994探针，其中：

第1个探针以5’端第1-52bp为模板设计，并在两端加上接头后设计得到；第2个探针以5’端第3-54bp为模板设计，并在两端加上接头后得到；第3个探针以5’端第5-56bp为模板设计，并在两端加上接头后设计得到；以此类推。

各个探针中，与上述设计得到的多个核酸片段的5’端的相连的接头为：5'-ACACGCTGGTGCGATCCCTA-3’；

与上述设计得到的多个核酸片段的3’端的相连的接头为：5'-CACTGCGGCTCCTCATCCACG-3’。

1.2探针池合成：

A.将上述设计得到的多个探针，交付艾吉泰康生物科技(北京)有限公司商业化公司合成得到；以探针池(oligo pool)形式合成。随着技术进步，探针池形式在保证浓度和质量要求前提下，较之前的合成方式可节约更多成本。本次探针的模板以探针池形式按设计生成，每个Oligo的合成规模＞0.2fmol，通过硅基技术合成探针，平台最长可合成300nt的oligo，利用硅基DNA编辑技术，一次可合成2000条以上，错误率低至1∶2000nt。

B.对步骤A合成得到的探针池中的探针进行扩增，包括下述步骤：

先将合成好的探针以水或TE缓冲液稀释至固定浓度(～6,000copies/探针)，之后按照下述步骤进行：

B1.100μL反应体系中，Herculase II Fusion DNA polymerase(安捷伦公司)1μL，1×Herculase II reaction buffer 60μL，250μM each dNTP，400nM引物APL5(5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′)和APL6-adj(5′-ACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′)。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，9个循环后，72℃延伸5min。

B2.PCR产物用MinElute PCR产物纯化试剂盒(凯杰公司，28006)进行纯化，由20μLTE缓冲液(配方)定容。取产物各1μL PCR产物进行qPCR和浓度及质量检测，1μL产物采用1∶50比例TE缓冲液稀释，1μL用做qPCR模板，采用两步扩增法，25μL反应体系，其中12.5μL

B3.5μL纯化产物用于第二轮扩增。100μL反应体系中，Herculase II Fusion DNApolymerase(安捷伦公司，600679)1μL，1×Herculase II reaction buffer 60μL，250μMeach dNTP，400nM引物APL5(5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′)和APL4-adj(5′-GGATTCTAATACGACTCACTATAGACACGCTGGTGCGATCCCTAT-3′)。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环后，72℃延伸5min。

B4.PCR产物用MinElute PCR Purification Kit(凯杰公司，28006)进行纯化，由20μL TE缓冲液(配方)定容。取产物各1μL PCR产物进行qPCR和浓度及质量检测，1μL产物采用1∶50比例TE缓冲液稀释，1μL用做qPCR模板，采用两步扩增法，25μL反应体系，其中12.5μL

B5.捕获前探针的扩增。为进一步提高浓度，保证浓度约为1000ng/μL，片段长度为94bp，以确保探针质量和降低成本。反应体系和条件参考步骤B1。

B6.PCR产物(步骤B5的产物)根据需求，扩增为双链探针。用于捕获实验。具体参照步骤A和B。其中APL5换成相同序列的5’端加biotin修饰的引物。PCR产物采用磁珠纯化方法。

1.3捕获测试

捕获实验，是利用碱基互补配对原理，将设计好的核酸探针与目标区域结合后，对目标区域进行钓取富集的一项技术(参照下述参考文献：Fu Q.，Meyer M.，Gao X.，StenzelU.，Burbano H.A.，Kelso J.，et al.(2013).DNA Analysis of an Early Modern Humanfrom Tianyuan Cave，China.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(6)，2223-2227.DOI：10.1073/pnas.1221359110)

将上述1.2扩增得到的探针池用于古代样本中麻风杆菌DNA的捕获：古代样本中DNA含量低，该实验有效提高文库中内源DNA含量，捕获后的文库可进行下一步测序工作。

测序结果评估(Tllumina Xten测序平台)

对19个古代骨骼样本(无需对样本进行预处理)，每个样品加入500ng单链探针，进行捕获实验并测序。比对捕获前后DNA文库(DNA文库的构建方法参照Meyer et al.，2012Meyer M.，Kircher M.，Gansauge M.-T.，Li H.，Racimo F.，Mallick S.，et al.(2012).A High-Coverage Genome Sequence from an Archaic DenisovanIndividual.Science 338(6104)，222-226.DOI：10.1126/science.1224344)中目标DNA(Mycobacterium leprae TN)含量(比对到目标物种参考序列上的DNA序列比例)如表1。样本经测序得到46,154-20,035,134条序列(平均46,154条)，原始测序数据比对至麻风杆菌基因组(3,268,203bp)。富集前比对后覆盖深度小于0.30×。富集后比对覆盖深度为0.01-5.86×，平均深度为2.09×。捕获前，样本中平均目标DNA比例(目标DNA比例＝比对到参考序列的DNA/总测序数据；平均值是用所有同类样本目标DNA比例计算)为0.03％，捕获后平均目标DNA比例为3.5％，目标DNA比例在捕获后平均提高至92.94倍(富集系数＝捕获后目标DNA比例/捕获前目标DNA比例)。在测试样品中，最低富集系数为8.5，最高为450.9。具体实验结果如下表1所示：

表1古代骨骼样本捕获结果

实施例2

将上述实施例1扩增得到的探针池用于现代病理样本中麻风杆菌DNA的捕获(同实施例1)，捕获方法同实施例1。

测序结果评估：

对37个现代病理样本(无需对样本进行预处理)，每个样品加入500ng单链探针，进行捕获实验并测序。样本经测序得到60,213-52,921,025条序列(平均5,607,389条)，原始测序数据比对至麻风杆菌基因组(3,268,203bp)。富集前比对后覆盖深度小于0.01×。富集后比对覆盖深度为0.01-650.93×，平均深度为32.07×。比对捕获前后DNA文库中目标DNA(Mycobacterium leprae TN)含量如表2所示：

表2现代病理样本捕获结果

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由表2可知：捕获前，样本中平均目标DNA比例为1.69％，捕获后平均目标DNA比例为32.18％，平均富集系数为19.05。在测试样品中，最低富集系数为2.35，最高为8265.62。另有两个样本(现代病理-25和现代病理-36)捕获前未检出目标DNA，捕获后分别检出0.27％和0.39％目标DNA。

实施例3

3.1探针池设计

以博物馆保存的大鲵线粒体基因组(Andriasdavidianus，Genebank no：AJ492192.1)序列为模板，3bp覆瓦形式构建的长度为94bp的探针(单链探针)。

其中，大鲵线粒体基因组共16,503bp，共设计得到5501探针；

第1个探针以5’端第1-52bp为模板设计，并在两端加上接头后设计得到；第2个探针以5’端第4-55bp为模板设计，并在两端加上接头后得到；以此类推。

各个探针中，与上述设计得到的多个核酸片段的5’端的相连的接头为：5’-ACACGCTGGTGCGATCCCTA-3’；

与上述设计得到的多个核酸片段的3’端的相连的接头为：5’-CACTGCGGCTCCTCATCCACG-3’。

3.2探针池合成：具体步骤同实施例1

3.3捕获测试方法同实施例1

3.4测序结果评估：

对20个博物馆样本(无需对样品进行预处理)，每个样品加入500ng双链探针，进行捕获实验并测序。样本经测序得到78,533-504,122条序列(平均229,356条)，原始测序数据比对至大鲵线粒体基因组(16,503bp)，富集前比对后覆盖深度小于0.00012×。富集后比对覆盖深度为8.27-111.32×，平均深度为53.76×。比对捕获前后DNA文库中目标DNA(Andriasdavidianus线粒体DNA)含量如表3所示。

表3博物馆样本捕获结果

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由表3可知：捕获前，样本中平均目标DNA比例为0.03％，捕获后平均目标DNA比例为32.54％，平均富集系数为3565.75。在测试样品中，最低富集系数为94.87，最高为8599.20。

综上所述：本发明的用于捕获样本目标DNA的探针池的设计方法和合成方法，在3类案例中进行了应用与评估，分别是古代骨骼样本中病原菌、博物馆动物线粒体DNA和现代病理样本中的病原菌捕获。三组评估分别包括19例、20例和37例样本。结果表明，所有受测样本的目标DNA比例在捕获后均得到了提升，最高富集系数高达8599.2。在三类样本中，博物馆样本平均富集系数最高，古代骨骼样本其次，病理样本较低(年代信息：古代骨骼样本＞博物馆样本＞病理样本)。

综合以上结果，说明本方法能有效提高各种类型的高度降解样本中的目标DNA含量，且在古代样本、博物馆样本和现代病理样本中均取得了较好的应用效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。