一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

NK细胞是以CD3-CD56+为标志的大颗粒淋巴细胞。作为免疫系统的重要组成部分，NK细胞在对抗病原体感染和肿瘤免疫监视中担任着哨兵和前线防御者的角色。与T、B细胞不同，NK细胞不表达基因重排的抗原特异性受体，而是依赖一系列种系基因编码的受体。正常组织细胞由于高表达MHCⅠ类分子,可与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族抑制性受体结合，传递抑制信号，从而免受NK细胞攻击；而感染或转化的细胞通常下调表达MHCⅠ类分子，尽管可以因此逃避MHCⅠ限制性T细胞的识别，但可减弱MHCⅠ类分子和NK细胞抑制性受体结合传递的抑制信号，使NK细胞激活并杀伤感染或转化的细胞。由于利用NK细胞在对肿瘤的生物治疗中显示了巨大的应用潜力，人们一直在寻找最优的扩增活化NK细胞的方法。

NK细胞的冷冻保存也是制约NK细胞应用的重要步骤。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，且缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。在不加保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，对细胞造成不可逆的永久损伤，甚至引起细胞死亡。

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃～-80℃，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成，是目前细胞冻存最常用的一种方法。

现有的NK细胞冻存方法，复苏后存在细胞存活率降低、细胞活性低下等问题，NK细胞的临床应用需要能更好维持NK细胞活性的冻存方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种NK细胞冻存液，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。

本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。

优选地，所述人血白蛋白在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6-2％；例如0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述二甲基亚砜在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为5-10％；例如5％、6％、7％、8％、9％、10％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

冻存液中二甲基亚砜含量较低，更适合于NK细胞冻存的临床应用。

优选地，所述右旋糖酐在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6-1.5％；例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述聚乙二醇在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5-6.0mg/mL；例如0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、5.5mg/mL、6mg/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述维生素B12在所述NK细胞冻存液中的浓度为5-50ng/mL；例如5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

在细胞冻存液中加入维生素B12，有助于提高细胞复苏后的存活率和杀伤靶细胞的能力。

当人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠以上述特定的浓度存在于冻存液中并进行配合时，具有更优的提高NK细胞复苏后的增殖和杀伤能力。

优选地，所述的NK细胞冻存液还包括木糖。

木糖的加入能够进一步提高细胞复苏后的增殖和杀伤能力，且木糖和维生素B12在上述效果上具有一定的协同作用。

优选的，所述木糖在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5-3mg/mL。

优选地，所述右旋糖酐选自右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的NK细胞冻存液的制备方法，所述制备方法为：将各制备原料进行物理混合，即得。

第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的NK细胞冻存液在NK细胞冻存中的应用。

优选地，所述应用的具体步骤包括：将NK细胞与第一方面所述的NK细胞冻存液混合后，降温，冻存。

优选地，所述冻存液中NK细胞的密度为(1×10

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述实施例、对比例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：

人血白蛋白来源于购自Instituto.Grifols公司的商品名为人血清白蛋白的产品；

聚乙二醇来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为聚乙二醇10000的产品；

右旋糖酐20来源于购自甘肃成纪生物药业有限公司的商品名为右旋糖酐20的产品；

右旋糖酐40来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为右旋糖酐40的产品；

右旋糖酐70来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为右旋糖酐70的产品；

维生素B12来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为维生素B12的产品；

DMEM基础培养基来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为DMEM培养基的产品；

胎牛血清来源于购自Gibco公司的商品名为胎牛血清的产品；

NK细胞培养基为购自康宁公司的商品名为KBM581培养基的产品；

Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒为购自APExBIO公司的商品名为CellCounting Kit-8(CCK-8)的产品。

实施例1

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 10ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法：将人血白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐40、聚乙二醇、维生素B12和0.9％氯化钠溶液进行物理混合。

实施例2

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白2％、二甲基亚砜6.5％、右旋糖酐40 1.5％、聚乙二醇5mg/mL、维生素B12 50ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例3

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白0.6％、二甲基亚砜8.8％、右旋糖酐70 0.6％、聚乙二醇1mg/mL、维生素B12 30ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例4

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1.5％、二甲基亚砜7％、右旋糖酐20 1.5％、聚乙二醇3mg/mL、维生素B12 40ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例5

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1.5％、二甲基亚砜7.5％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇4mg/mL、维生素B12 20ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例6

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 10ng/mL、木糖2mg/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例7

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 2ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例8

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1.3％、二甲基亚砜8.5％、右旋糖酐40 0.2％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 10ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

实施例9

本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇0.1mg/mL、维生素B12 10ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。

制备方法参照实施例1。

对比例1

本对比例提供一种NK细胞冻存液，其与实施例6的区别仅在于，将10ng/mL维生素B12替换为10ng/mL木糖，其他成分和含量保持不变。

制备方法参照实施例1。

对比例2

本对比例提供一种NK细胞冻存液，其与实施例1的区别仅在于，不含维生素B12，其他成分和含量保持不变。

制备方法参照实施例1。

对比例3

本对比例提供一种NK细胞冻存液，其以体积分数计包括以下成分：DMEM基础培养基70％、胎牛血清20％、二甲基亚砜10％。

其制备方法为：将二甲基亚砜、胎牛血清和DMEM基础培养基进行物理混合。

测试例1

检验不同细胞冻存液对NK细胞存活率的影响

NK细胞的扩增：采取志愿者的外周血，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，将5×10

NK细胞的冻存：使用NK细胞冻存液重悬NK细胞，使NK细胞的密度为2×10

NK细胞的复苏：从液氮中取出细胞冻存管，37℃水浴中1min后，将NK细胞取出，按1:10的体积比加入0.9％氯化钠注射液，轻轻混合，在1000rpm条件下离心5min，除去上清。用1mL NK细胞培养基重悬NK细胞后，将NK细胞加入预热至37℃的20mL NK细胞培养基中，置于37℃、5％CO

使用实施例1-9、对比例1-3所述的冻存液将NK细胞分别冻存1个月、6个月后，将冻存后的细胞复苏，复苏后的细胞置于37℃、5％CO

表1

由表1数据可知，使用本发明涉及的NK细胞冻存液冻存细胞，提高了细胞的存活率，减少了NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，维生素B12和木糖在提高细胞的存活率上具有协同作用。

测试例2

检验不同细胞冻存液对NK细胞扩增活性的影响

使用实施例1-9，对比例1-3所述的细胞冻存液冻存NK细胞1个月后，进行细胞复苏，冻存和复苏的方式如测试例1所述。复苏后的细胞置于37℃、5％CO

表2

由表2数据可知，使用本发明涉及的NK细胞冻存液冻存细胞，提高了细胞扩增倍数和NK细胞纯度，减少了NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，维生素B12和木糖在上述效果上具有协同作用。

测试例3

检验不同细胞冻存液对NK细胞杀伤活性的影响

使用实施例1-9和对比例1-3所述的细胞冻存液分别冻存NK细胞1个月，然后进行细胞复苏，复苏后的细胞置于37℃、5％CO

表3

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由表3数据可知，使用本发明涉及的NK细胞冻存液冻存细胞，细胞复苏后具有良好的杀伤能力，维生素B12和木糖在提高细胞杀伤能力上具有协同作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明NK细胞冻存液及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。