盐酸溴己新原料药有关物质的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种盐酸溴己新原料药有关物质的高效液相色谱检测方法。

背景技术

盐酸溴己新(Bromhexine)，适用于慢性支气管炎及其他呼吸道疾病如哮喘、支气管扩张，矽肺等有粘痰而不易咳出的患者，脓性痰患者需加用抗生素控制感染；同时也广泛用于术后肺部并发症的预防治疗，术前呼吸道的廓清；早产儿、新生儿及婴儿呼吸窘迫综合症(IRDS)的治疗。

在盐酸溴己新原料药制备过程中，存在多种杂质，包括工艺杂质、降解杂质等，均需要进行严格控制，因此需要对盐酸溴己新原料药的有关物质进行检测。目前，除了《中国药典》中记载的盐酸溴己新有关物质相关检测方法外，为了更快速、更准确地检测盐酸溴己新原料药有关物质，现有技术中提出了很多新的检测方法。

例如专利CN107703230A中一种盐酸溴己新有关物质的高效液相色谱检测法，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以pH为5～5.5的缓冲盐溶液为流动相A，甲醇为流动相B，色谱柱柱温为30-35℃，进行梯度洗脱。该检测方法实现了盐酸溴己新有关物质A-Q的全部分离，且分离度良好，均实现基线分离；从而实现同时测定盐酸溴己新及其15个有关物质的含量。但是其没有涉及对盐酸溴己新有关物质中各杂质含量进行具体的限定，容易影响盐酸溴己新的质量，增加副作用的危险。

专利CN113533578A中公开了一种盐酸溴己新片中有关物质的质量控制方法，采用高效液相色谱法进行，其中所述液相色谱测定条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为磷酸盐缓冲液，pH值为2.8-3.6，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱进行检测。该方法适合于盐酸溴己新中有关物质的定性和定量检测。但是其检测的杂质种类较少，不适用与更多杂质的检测。

因此，开发一种快速、简单且准确检测盐酸溴己新原料药更多有关物质的方法，对盐酸溴己新原料药的质量控制具有非常重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种盐酸溴己新原料药有关物质的高效液相色谱检测方法，能有效检测盐酸溴己新原料药中有关物质的含量，方法简便快捷、专属性强、灵敏度高、分离度好、检测杂质种类多，提高了药品安全性。

本发明所述的盐酸溴己新原料药有关物质的高效液相色谱检测方法，采用高效液相色谱法，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，检测波长210-250nm，柱温38-42℃，以磷酸盐缓冲溶液-流动相B体系为流动相A，以水-甲醇-乙腈体系为流动相B，梯度洗脱。

优选的，梯度洗脱条件为：

第一梯度洗脱时间0min，流动相A占比95±5％，流动相B占比5±5％；

第二梯度洗脱时间30±3min，流动相A占比5±5％，流动相B占比95±5％；

第三梯度洗脱时间60±3min，流动相A占比5±5％，流动相B占比95±5％；

第四梯度洗脱时间65±3min，流动相A占比95±5％，流动相B占比5±5％；

第五梯度洗脱时间75±3min，流动相A占比95±5％，流动相B占比5±5％。

优选的，流动相B中水、甲醇、乙腈的体积比为5:20:75。在该配比下，有关物质的分离度更优。

优选的，流动相A中磷酸盐缓冲溶液、流动相B的体积比为62:38；磷酸盐缓冲溶液为采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.8-7.2的浓度为1g/L的磷酸二氢钾溶液。

在酸性条件下，盐酸溴己新出峰靠前，但峰形变差，与相关杂质分不开。本发明采用0.5mol/L氢氧化钠溶液将流动相A调节至近中性，在中性条件下，各杂质色谱峰峰形得到改善，且满足基线分离。

优选的，高效液相采用PDA或紫外检测器。

优选的，流动相流速为0.8-1.2ml/min。

优选的，进样量为5-20μl。

在一种最优选方案中，色谱条件如下：

色谱柱：Xtimate C18，规格4.6mm×250mm，5μm，填料十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：40℃；

检测波长：245nm；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

流动相：流动相B为体积比5:20:75的水-甲醇-乙腈体系，流动相A为体积比为62:38的磷酸盐缓冲溶液-流动相B体系，其中磷酸盐缓冲溶液为采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.8-7.2的浓度为1g/L的磷酸二氢钾溶液；梯度洗脱；

梯度洗脱条件：

第一梯度洗脱时间0min，流动相A占比100％，流动相B占比0％；

第二梯度洗脱时间30min，流动相A占比0％，流动相B占比100％；

第三梯度洗脱时间60min，流动相A占比0％，流动相B占比100％；

第四梯度洗脱时间65min，流动相A占比100％，流动相B占比0％；

第五梯度洗脱时间75min，流动相A占比100％，流动相B占比0％。

优选的，所述检测方法包括如下步骤：

1)对照品溶液制备：

取盐酸溴己新对照品，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml含2.5μg的溶液，作为对照品溶液；

2)供试品溶液制备：

取盐酸溴己新供试品，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1ml含2.5mg的溶液，作为供试品溶液；

3)系统适用性溶液制备：

分别取盐酸溴己新对照品、杂质A、C、F、G、N、Q、S对照品，精密称定，加甲醇溶解，再加溶剂稀释制成每1ml中含盐酸溴己新2.5mg、杂质A、C、N、Q、S各5μg、杂质F和G各2.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；

4)检测：

分别精密量取所述溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，并分离盐酸溴己新及其有关物质(杂质A、C、F、G、N、Q、S)；

供试品溶液色谱图中，确定所得供试品溶液中如有与有关物质保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，杂质A、杂质C、杂质F和G、杂质N、杂质Q、杂质S，分别按校正后的峰面积计算，即分别乘以校正因子0.64、1.00、1.00、0.72、1.16、1.56，杂质A、杂质C、杂质N、杂质Q、杂质S均不得过0.1％，杂质F和G不得过0.1％；其他单个杂质不得过0.10％；杂质总量不得过0.2％。

优选的，在上述方法中，配制溶液时所用溶剂为体积比为20:80的磷酸盐缓冲溶液-流动相B体系，其中磷酸盐缓冲溶液为采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.8-7.2的浓度为1g/L的磷酸二氢钾溶液。

各杂质具体如下：

杂质A为2-氨基-3,5-二溴苯甲醇，结构式：

杂质C为2-[(N-甲基-N-环己基氨基)甲基]苯胺，结构式：

杂质F为N-甲基-N-环己基-2-氨基-3-氯-5-溴苯甲胺，结构式：

杂质G为N-甲基-N-环己基-2-氨基-5-氯-3-溴苯甲胺，结构式：

杂质N为2,4-二溴-6-(乙氧基甲基)苯胺，结构式：

杂质Q为N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺氧化物，结构式：

杂质S为6,8-二溴-3-环己基-3,4-二氢-2(1H)-喹唑啉酮，结构式：

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过大量实验后优选出最佳的分析条件和供试品溶液的配制方法，经多次实验验证表明，本发明提供的盐酸溴己新原料药有关物质高效液相色谱测定方法灵敏度高、分离度好、专属性强，可以准确的定性、定量检测盐酸溴己新原料药中的多种杂质，从而客观、准确、全面的评价盐酸溴己新原料药的质量，对产品质量的控制具有重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明空白溶剂的高效液相色谱图；

图2为本发明专属性混合溶液的高效液相色谱图；

图3为本发明对照品溶液的高效液相色谱图；

图4为本发明供试品溶液的高效液相色谱图；

图5为对比例1专属性混合溶液的高效液相色谱图；

图6为对比例2专属性混合溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作出进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变，均应属于本发明的保护范围内。

实施例中所使用的原料，如无特别说明，均为市售常规原料；实施例中所使用的工艺方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

在以下实施例中，高效液相色谱条件如下：

检测器：紫外检测器；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Xtimate C

检测波长：245nm；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

流动相：流动相B为体积比5:20:75的水-甲醇-乙腈体系，流动相A为体积比为62:38的磷酸盐缓冲溶液-流动相B体系，其中磷酸盐缓冲溶液为采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0±0.2的浓度为1g/L的磷酸二氢钾溶液；梯度洗脱；

梯度洗脱条件：

第一梯度洗脱时间0min，流动相A占比100％，流动相B占比0％；

第二梯度洗脱时间30min，流动相A占比0％，流动相B占比100％；

第三梯度洗脱时间60min，流动相A占比0％，流动相B占比100％；

第四梯度洗脱时间65min，流动相A占比100％，流动相B占比0％；

第五梯度洗脱时间75min，流动相A占比100％，流动相B占比0％。

溶剂：体积比为20:80的磷酸盐缓冲溶液-流动相B体系，其中磷酸盐缓冲溶液为采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.8-7.2的浓度为1g/L的磷酸二氢钾溶液。

实施例1

专属性：

各杂质储备溶液：分别取杂质A、杂质C、杂质F、杂质G、杂质N、杂质Q、杂质S各10mg，置不同20ml量瓶中，分别用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

混合溶液：精密称取盐酸溴己新50mg，置20ml量瓶中，分别加入杂质A、C、Q、N、S杂质储备溶液0.2ml、杂质F和杂质G储备液各0.1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取空白溶剂和专属性混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，结果见表1。图谱见图1、图2。

表1专属性试验结果(混合溶液)

结论：空白溶剂不干扰有关物质检测，各峰之间的分离度均大于1.2，分离效果良好。

实施例2

强制降解试验：

对照品溶液(含量)：精密称取盐酸溴己新对照品25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液(杂质)：精密量取上述对照品溶液(含量)5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

未降解供试品溶液制备：精密称取供试品125mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

酸降解供试品溶液制备：精密称取供试品125mg，置50ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液5ml，室温放置24小时，再加入1mol/L氢氧化钠溶液5ml中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

碱降解供试品溶液制备：精密称取供试品125mg，置50ml量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温放置24小时，再加入1mol/L盐酸溶液5ml中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

氧化降解供试品溶液制备：精密称取供试品125mg，置50ml量瓶中，加3％过氧化氢溶液5ml，室温放置1.5小时，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

高温降解供试品溶液制备：取供试品适量，置60℃烘箱中，放置30天，取出，放冷至室温，精密称取125mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

高湿降解供试品溶液制备：取供试品适量，在相对湿度92.5％的条件下，放置30天，取出，精密称取125mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

光照降解供试品溶液制备：取供试品适量，置光照条件(4500lx±500lx)下，放置30天，取出，精密称取125mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

酸、碱降解空白溶液：取1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液各5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为酸、碱降解空白溶液；

氧化降解空白溶液：取3％过氧化氢溶液5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为氧化降解空白溶液。

精密量取上述各溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，按外标法计算各杂质含量，结果见表2。未降解供试品溶液见图4。

表2强制降解试验结果

结论：溶剂及各空白溶液对样品测定无干扰，各降解条件下，主峰纯度相似度均大于纯度阈值，主峰与相邻峰的分离度均大于1.5，说明该方法专属性强。

实施例3

系统精密度：

对照品溶液：精密称取盐酸溴己新对照品25mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

精密量取对照品溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，计算对照品溶液连续进样6次，各峰的峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。图谱见图3。

表3系统精密度试验结果

结论：对照品溶液连续进样6次，溴己新峰面积的RSD小于10.0％，保留时间的RSD均小于1.0％，说明系统精密度良好。

实施例4

检测限/定量限：

以溶剂为空白，调整仪器灵敏度，连续进样3次，记录在被测物出峰时间范围内仪器的噪声水平，计算平均噪声。

检测限：准确配制被测物对照品溶液，逐步稀释至一定浓度并进样，连续测定3次。计算其峰高与噪声的比值(信噪比)，其信噪比(S/N)在3以上的样品浓度即为检测限浓度，其相对于理论样品浓度的比值为检测限。

定量限：准确配制被测物对照品溶液，逐步稀释至一定浓度并进样，连续测定6次。计算其峰高与噪声的比值(信噪比)，其信噪比(S/N)在10以上的样品浓度即为定量限浓度，其相对于理论样品浓度的比值为定量限。

定量限溶液：分别精密量取“专属性”项下杂质储备液各1ml，“系统精密度”项下的盐酸溴己新对照品储备液2ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液；

检测限溶液：精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。

精密量取溶剂按上述色谱条件连续进样3次、检测限溶液连续进样3次和定量限溶液连续进样6次，记录色谱图，计算信噪比，结果见表4、表5、表6。

表4基线噪声测定结果

表5定量限测定结果

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表6检测限测定结果

结论：该方法下，盐酸溴己新及各杂质的灵敏度均符合要求。

对比例1

本对比例的高效液相色谱条件与实施例不同之处仅在于，流动相A和溶剂中磷酸盐缓冲溶液未采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至近中性，流动相A为酸性(pH为2.5)。

其专属性混合溶液的高效液相色谱图如图5所示，从图中可以看出，溴己新出峰靠前，峰形变差，与杂质分离度差。

对比例2

本对比例的高效液相色谱条件与实施例不同之处仅在于，流动相A采用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0±0.2的浓度为1g/L的磷酸二氢钾溶液，流动相B采用乙腈。

其专属性混合溶液的高效液相色谱图如图6所示，从图中可以看出，杂质A与杂质Q分离度为1.183，杂质D/M/H出2个相连的峰，分离度差。