一种高效检测白酒中13种挥发性酚类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种检测白酒中挥发性酚类化合物的方法，特别涉及一种高效检测白酒中13种挥发性酚类化合物的方法。

背景技术

酚类化合物作为白酒中一类重要的微量成分，对白酒的香气、口感和稳定性均起到重要作用。挥发性酚类化合物在饮料酒中含量很少，但呈香作用很大，研究表明：2-甲氧基苯酚(又称愈创木酚)具有水果香、焦酱香；2-甲氧基-4-乙基苯酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚带有香瓜香、甜香；2-甲氧基-4-甲基苯酚具有烟熏风味和酱油味；4-甲基苯酚具有窖泥气味。有报道认为：4-乙基苯酚和2-甲氧基-4-乙基苯酚在酒中的总质量浓度小于400μg/L时，它们为酒贡献了辛香、烟气和革香韵的风味，当其总质量浓度大于620μg/L时，会使酒体产生腥异味，掩盖酒体的香味。

早在1978年，国内采用化学衍生法结合GC-FID/GC-MS对白酒中挥发性酚元化合物进行的分析研究中，前处理需要衍生化，步骤繁琐，并且其中2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲氧基-4-乙基苯酚的加标回收率较差，只有40％左右。

《食品与发酵工业》(2010，36(10)：138-143)中应用浸入固相微萃取(DI-SPME)与气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析白酒中游离酚类化合物，该方法回收率为85％～115％。采用DI-SPME的前处理时，对操作要求较高，萃取头耗材费用较贵，且方法精密度有所欠缺，而且该方法只分析了7种挥发性酚类化合物。

《食品科学》(2012，33(24)：239-243)中，利用酚类物质的荧光特性和手性拆分剂β-环糊精拆分重叠峰，采用传统的液液萃取结合高效液相色谱荧光检测器(HPLC-FLD)对白酒中的酚类物质进行了提取、浓缩、测定，方法得到较好的回收率，但所需样品量和有机试剂的使用量都较大，且萃取过程耗时耗力；我课题小组在以(HPLC-FLD)为检测手段的基础上，利用分散液液微萃取(DLLME)方法对酒样中的10种酚类物质进行吸附提取(一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，201210018934.9)，方法方便、快捷，但由于离心沉淀后的有机相含量较少，仅为微升级，取出有机相的过程对操作者的手法要求较高，且该法检测重现性有所欠缺。由于HPLC-FLD的灵敏度和抗干扰能力有限，在针对样品中含量较低的挥发性酚时，测定值可能会有一定的误差。

2016年安徽省地方标准DB34/T 2744-2016《基酒中挥发性酚类化合物的测定气相色谱-质谱联用法》测定了基酒中12种挥发性酚类化合物，该标准前处理方法是顶空固相微萃取，该前处理方法重现性参数性能有所欠缺，且萃取头耗材费用较贵，推广普及应用会受到局限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种方便、快速、准确、分辨率高的高效检测白酒中13种挥发性酚类化合物的方法。

本发明的技术方案，一种高效检测白酒中13种挥发性酚类化合物的方法，包括如下步骤：

S1、取白酒样品8.0g(精确到0.01g)于50mL离心管中加入内标液100μL，震荡使内标液和酒样充分溶解得酒样溶解液；

S2、以冰醋酸调节酒样溶解液的pH值为3；

S3、在酒样溶解液中加入10mL二氯甲烷萃取剂，并加入2gNaCl，以涡旋振荡器9000r/min涡旋振荡15min，再以离心机8000r/min离心3min，分层后移取下层有机相于另一离心管中，再加10mL二氯甲烷重复提取一次；

S4、取步骤S3中全部二氯甲烷萃取剂，以无水硫酸钠进行干燥后收集滤液于试管中，再使用2mL二氯甲烷清洗针管，并收集清洗液与滤液于试管中；

S5、将步骤S4中收集的清洗液与滤液在低温下氮吹至0.5mL左右，冷却后使用二氯甲烷定容至1.0mL，过0.22μm滤膜后以气相色谱质谱仪进行检测；

气相色谱质谱仪的仪器条件为：

色谱柱：CP-Wax 57CB Acidic毛细管柱50m×0.25mm，0.2μm；

升温程序：初始温度80℃保持2min，以6℃/min升温至190℃，保持2min，再以6℃/min升温至210℃，保持8min；

载气He，流速1.2mL/min；进样口温度230℃；进样量1.0μL，不分流；传输线温度230℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；选择离子扫描模式(SIM)，内标法定量。

S6、使用内标法定量计算GC-MS检测中的13种挥发性酚类物质的浓度，再换算成酒样中13种酚的浓度。

在一些实施方式中，所述13种挥发性酚类物质为：2,6-二叔丁基苯酚、2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲基苯酚、苯酚、2-甲氧基-4-乙基苯酚、4-甲基苯酚、3-甲基苯酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和4-乙烯基苯酚。

在一些实施方式中，所述步骤S4中无水硫酸钠进行干燥的操作步骤为：

S4-1、在尾部开放的10mL针管中加入约2cm厚的无水硫酸钠；

S4-2、将经步骤S3得到的全部二氯甲烷萃取剂，从针管的尾部加入针管后流经无水硫酸钠后从针管的针尖部流出得到，再使用2mL二氯甲烷清洗针管得到清洗液，并收集滤液与清洗液于试管中。

在一些实施方式中，所述步骤S5的氮吹温度为35℃。

在一些实施方式中，所述内标液为2，6-二甲基苯酚甲醇溶液，所述2，6-二甲基苯酚的浓度为1.0μg/mL。

本发明的有益效果是：本发明采用改进的液液萃取法来提取白酒中13种挥发性酚类物质，称取酒样8.0g(精确到0.01g)置于50mL离心管中，加内标，调pH值，加入10mL有机溶剂，加NaCl，9000r/min涡旋振荡萃取15min，8000r/min离心分层后取有机相，重复提取一次，合并有机相。与传统的利用分液漏斗液液萃取相比，该萃取法所需样品量少、有机试剂用量少，回收率稳定，操作方便快捷，检测成本低，适合大批量样品的日常检测工作。对比不同的有机试剂对挥发性酚类物质的萃取效率，选取合适的萃取试剂。通过调整白酒的pH值来减少其他物质的干扰，从而提高挥发性酚类物质萃取效率。较低的氮吹浓缩温度有利于酚类物质的保留，可以使检测结果更为精确。本发明的方法所检测的各成分平均回收率为84.1～110.8％，RSD为0.9～3.8％。方法检出限为0.29～39.47ng/mL，定量限为0.96～131.58ng/mL。该方法具有快速、准确、分辨率高的特点，适合白酒中挥发性酚类化合物的分析检测。通过定性定量分析，考察了13种酚类物质在主要品牌的酱香型白酒中的含量，为开展酱香型白酒特征风味成分的研究提供基础数据，找到酱香型白酒中挥发性酚类化合物的共性及特征，对酱香型白酒风味控制具有重大意义。

附图说明

图1为标准品的选择扫描TIC色谱图；

图2为萃取剂的萃取效果比较结果图；

图3为pH值萃取效果比较结果图；

图4为氮吹温度选择结果比较图；

图5为1号酒样品的选择扫描TIC图。

具体实施方式

实施例1

一种高效检测白酒中13种挥发性酚类化合物的方法，包括如下步骤：

S1、取白酒样品8.0g(精确到0.01g)于50mL离心管中加入内标液100μL，震荡使内标液和酒样充分溶解得酒样溶解液；

内标液为2,6-二甲基苯酚甲醇溶液，2,6-二甲基苯酚的浓度为1.0μg/mL。

S2、以冰醋酸调节酒样溶解液的pH值为3；

S3、在调节pH值后的酒样溶解液中加入10mL二氯甲烷萃取剂，并加入2gNaCl，以涡旋振荡器9000r/min涡旋振荡15min，再以离心机8000r/min离心3min，分层后移取下层有机相于另一离心管中，再加10mL二氯甲烷重复提取一次，合并有机相；本发明的液液萃取方式是将酒样装于离心管中，加入有机试剂后涡旋震荡萃取，不同于传统的分液漏斗式萃取。

S4、取经步骤S3得到的全部二氯甲烷萃取剂，以无水硫酸钠进行干燥后收集滤液于试管中，再使用2mL二氯甲烷清洗针管，并收集清洗液与滤液于试管中；

无水硫酸钠进行干燥的操作步骤为：

S4-1、在尾部开放的10mL针管中加入约2cm厚的无水硫酸钠；

S4-2、将经步骤S3得到的全部二氯甲烷萃取剂，从针管的尾部加入针管后流经无水硫酸钠后从针管的针尖部流出得到，再使用2mL二氯甲烷清洗针管得到清洗液，并收集滤液与清洗液于试管中。

S5、将步骤S4中收集的清洗液与滤液在35℃下氮吹至0.5mL左右，冷却后使用二氯甲烷定容至1.0mL，过0.22μm滤膜后以气相色谱质谱仪进行检测；

气相色谱质谱仪的仪器条件为：

色谱柱：CP-Wax 57 CB Acidic毛细管柱50m×0.25mm，0.2μm；

升温程序：初始温度80℃保持2min，以6℃/min升温至190℃，保持2min，再以6℃/min升温至210℃，保持8min；

载气He，流速1.2mL/min；进样口温度230℃；进样量1.0μL，不分流；传输线温度230℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；选择离子扫描模式(SIM),内标法定量。

S6、使用内标法定量计算GC-MS检测中的13种挥发性酚类物质的浓度，再换算成酒样中13种酚的浓度。所述13种挥发性酚类物质为：2,6-二叔丁基苯酚、2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲基苯酚、苯酚、2-甲氧基-4-乙基苯酚、4-甲基苯酚、3-甲基苯酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和4-乙烯基苯酚。

标准溶液配制

13种酚类标准储备液：分别准确称取2,6-二叔丁基苯酚，2-甲氧基苯酚，2-甲氧基-4-甲基苯酚，2-甲基苯酚，苯酚，2-甲氧基-4-乙基苯酚，4-甲基苯酚，3-甲基苯酚，2-甲氧基-4-丙基苯酚，4-乙基苯酚，3-乙基苯酚，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚各0.1g(精确到0.1mg)，用甲醇稀释定容至10.0mL，配制储备液的浓度为10mg/mL，存放在0℃左右冰箱中，有效期6个月。

内标溶液：准确称取2,6-二甲基苯酚0.1g(精确到0.1mg)，用甲醇稀释定容至10.0mL，配制成浓度为10mg/mL的储备液，存放在0℃左右冰箱中，有效期6个月。

将上述13种标准储备用二氯甲烷配成混合系列标准溶液。其中由于4-乙烯基苯酚在质谱上的响应较低，其质量浓度分别为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL，其它12种挥发性酚类物质质量浓度分别为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL，该混合标准工作溶液中内标2,6-二甲基苯酚的浓度为0.1μg/mL。混合标准工作溶液现用现配。

质谱定性定量分析：

将质量浓度为5.0μg/mL的14种酚类混合标准溶液在S5所述的色谱条件下进行35～300质量数范围SCAN扫描，利用NIST20标准库检索，确定每个酚类物质的保留时间和特征离子碎片，选择丰度相对较高、质荷比较大离子作为质谱条件中选择扫描离子，在选择扫描离子中再选取丰度较大且干扰小的碎片离子作为定量离子。扫描离子及定量离子见表1，SIM扫描的TIC图见图1。

表1 14种挥发性酚类保留时间、选择性扫描离子及定量离子

在与标准溶液检测的相同的色谱、质谱条件下，同一批次白酒样品检测过程中，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品相一致，在扣除背景后的样品质谱图中，目标化合物所选择的碎片离子均出现，且目标化合物的定性离子与定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的标准溶液相比，偏差在国家标准允许的偏差范围内，则可定性判断样品中存在这种酚类物质。采用峰面积质量浓度标准曲线法定量分析。

方法的线性范围：

采用上述方法对标准溶液进行检测，以化合物峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，计算得到各酚类物质的回归曲线方程和相关系数R

表2线性方程、检出限及定量限

提取方式比较：

如果利用传统的分液漏斗式液液萃取方法对白酒中的酚类物质进行提取和浓缩，可以得到较好的回收率，但所需样品量和有机试剂的使用量都较大，且萃取过程耗时耗力；还可以利用分散液液微萃取(DLLME)方法对酒样中的酚类物质进行吸附提取，方法方便、快捷，但由于离心沉淀后的有机相含量较少，仅为微升级，取出有机相的过程对操作者的手法要求较高，且该法检测重现性有所欠缺。采用固相萃取法提取净化白酒中酚类物质，一般商品化的固相萃取柱价格昂贵，这无疑增加了日常检测的成本。而采用直接进样方式测定白酒中酚类物质，不适用于含量较低的酚类物质的检测。

因此，本发明采用改进的液液萃取法来提取白酒中挥发性酚类物质，称取酒样8.0g(精确到0.01g)置于50mL离心管中，加内标，调pH，加入10mL有机溶剂，加NaCl，9000r/min涡旋振荡萃取15min，离心分层后取有机相，重复提取一次，合并有机相。与传统的分液漏斗式液液萃取相比，该萃取法所需样品量少、有机试剂用量少，操作方便快捷，检测成本低，适合大批量样品的日常检测工作。

萃取试剂选择：

根据待测组分在萃取溶剂与样品中的分配系数不同，本实验研究对象为挥发性酚类化合物，分子结构中都是苯环上直接连有羟基(Ar-OH)，酚类化合物具有极性和亲脂性。并且由于检测的酚类化合物种类较多，需要选择能够兼容各个酚类化合物的的萃取效果好的萃取剂。本实验考察了乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚与甲苯等试剂的萃取效果。固定前处理过程：在相同酒样样品中加入萃取剂10mL/次×2次，涡旋振荡15min，弃去水相，保留萃取剂有机相，浓缩后GC-MS检测，记录各个酚类物质峰面积总和与酚类物质检测种类数，考察各个萃取剂的萃取效果。萃取剂的萃取效果比较见图2。实验结果表明采用氯仿、二氯甲烷作为萃取溶剂时，检测到的各种酚类化合物峰面积总和与酚类物质检测种类数最佳。氯仿和二氯甲烷的萃取效果相当，但是由于氯仿属于易制毒试剂，对环境不友好，所以使用二氯甲烷作为萃取剂。

pH调节：

由于酚类物质的结构中包含酚羟基，具有弱酸性。根据相似相溶原理，酸性条件下更有利于目标物的提取。本实验通过调整白酒的pH值来减少其他物质的干扰，从而提高挥发性酚类物质萃取效率。因此采用纯度≥99.5％的冰醋酸对酒样进行pH值调节，比较了pH为3和pH为5时对酒样的萃取效果。pH值萃取效果比较结果见图3，结果表明当pH为3时，挥发性酚类的萃取效果更好，所以本实验选择pH为3的条件下进行萃取实验。

氮吹温度的优化：

由于酚类物质易挥发，对环境温度较为敏感，在氮吹过程温度设置太低会导致浓缩时间过长，而氮吹过程温度太高会使酚类物质挥发，导致实验回收率过低。本实验研究了氮吹不同温度下的萃取效果，分别比较了30℃，35℃，40℃，45℃条件下氮吹能够检测到的酚类化合物种类数及峰面积总和，氮吹温度选择结果比较见图4。结果显示，较低的氮吹浓缩温度有利于酚类物质的保留，随着温度的升高，酚类物质种类及峰面积总和呈下降趋势。当温度为30℃和35℃时，能够检测到的酚类化合物种类相同，酚类物质的峰面积总和也相近，基于节省分析时间的目的，选择氮吹温度为35℃。

方法精密度及回收率：

利用无水乙醇和超纯水配制成不含挥发性酚类物质，酒精度为53度的白酒模拟酒样，称取8.0(精确到0.01g)的模拟酒样，分别添加三个浓度水平的挥发性酚类物质混合标样，其中4-乙烯基苯酚添加浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、2.5μg/mL，其它12种挥发性酚类物质的添加浓度分别为0.05μg/mL，0.1μg/mL，0.5μg/mL。按照S1-S5对样品进行前处理，GC-MS检测。每个浓度水平重复6次。考察方法回收率和相对标准偏差(RSD，n＝6)结果见表3。目标化合物平均回收率在84.1％～110.8％之间，RSD为0.9％～3.8％。

表3回收率和精密度实验(n＝6)

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实施例2

取10种不同生产厂家的酱香型白酒进行检测，具体检测结果见表4，1号酒样品的选择扫描的TIC图见图5。

表4 10种酱香型白酒挥发性酚的检测结果

注：单位为μg/kg；“/”表示未检出。

本发明通过定性定量分析，考察了13种酚类物质在主要品牌的酱香型白酒中的含量，为开展酱香型白酒特征风味成分的研究提供基础数据，找到酱香型白酒中挥发性酚类化合物的共性及特征，对酱香型白酒风味控制具有重大意义。本文建立了一种液液萃取结合气相色谱质谱法同时测定白酒中13种挥发性酚的方法，优化了挥发性酚类保留时间、选择性扫描离子及定量离子、酒样pH、氮吹温度，确定提取方式为液液萃取，萃取剂为二氯甲烷。在上述优化后的条件下进行实验时，具有良好的线性，相关系数R

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。