一种金耳菌株ZJJE004及其工厂化栽培方法

技术领域

本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种金耳菌株ZJJE004及其工厂化栽培方法。

背景技术

金耳（

金耳与毛韧革菌、扁韧革菌等韧革菌有寄生或部分共生关系，从而两个菌在一起组合才能生长出金耳子实体。毛韧革菌（

金耳成熟后子实体为金黄色耳瓣状，其外形酷似大脑，又名脑耳、脑形银耳等。作为一种珍贵的食药用菌，含有大量人体所需的氨基酸、蛋白质和矿质元素，特有的金耳多糖作为目前的研究热点，是金耳的主要活性成分之一，具有降血脂、降血糖、增强免疫力等多种功效。早在《本草纲目》中就已经有记载，金耳具有止咳化痰、生津止渴的功效，可用于治疗痰多、气喘、肺结核、虚痨、咳嗽、盗汗等症状。

但野生金耳产量较少，远远不足以满足市场的需求，因此人工栽培是十分必要的。但由于金耳自身生物学性状的特殊性和菌种制作的独特性导致了金耳菌种的不稳定，人工栽培金耳产量较低，产量也参差不齐。

本发明旨在提供一种金耳新菌株以及其工厂化栽培方法。

发明内容

本发明的第一目的在于提供金耳新菌株ZJJE004，本发明的第二目的是提供一种金耳菌株ZJJE004液体菌种的培养方法，本发明的第三目的是提供金耳菌株ZJJE004的工厂化栽培方法。

本发明的第一目的是这样实现的，金耳菌株（

本发明的第二目的是这样实现的，金耳菌株ZJJE004液体菌种的培养方法，按照以下步骤实现：

1）按照配方（麦粉4-6g，玉米粉2-4g，蛋白胨2-4g，葡萄糖15-20g，硫酸镁0.5-1g，磷酸氢二钾1-2g，水1L）制备液体培养基，液体培养基在压力0.1～0.2MPa，121℃条件下灭菌20～40min后冷却得到发酵液；

2）将发酵液按1%的比例将毛韧革菌种子液接入，再按1%的比例再次接入金耳菌株ZJJE004种子液，毛韧革菌与金耳的接种比例为1:1；

3）接种完成后摇床或发酵罐培养8-12天即得液体菌种。

本发明的第三目的是这样实现的，一种金耳菌株ZJJE004的工厂化栽培方法，按以下步骤实现：

A、配置栽培种培养基，将含水量调至56-62%，分装栽培袋，在121℃下高压蒸汽灭菌120min，冷却；

B、在栽培袋表面打孔4个，在每个孔内接种5-10ml所述液体菌种，接种完后贴透气膜封口，在17℃-20℃、空气湿度50%-60%条件下，暗培养20-25天；

C、待金耳原基开始长出，撑开透气膜时，将透气膜撕去，空气湿度提高至80%-85%，16-18℃继续培养10-15天；

D、待金耳原基生长至鸡蛋大小时，将湿度提高至90%-95%，16-19℃，光照继续培养7-10天；

E、待金耳长大快开瓣时，湿度提高至95%-100%，继续光照培养5-7天成熟；

F、待金耳金黄色，且开瓣时即成熟可采摘。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供了一株金耳新菌株ZJJE004以及其工厂化栽培技术，本发明采用液体一次接种方法，无需接组织块，大大优化了栽培方法，栽培方法简便，且发菌快，污染少，菌丝壮（图3）；采用液体接种方法，明显缩短金耳栽培周期，45-55天即可采摘；出耳率高，且子实体大小均匀（图5），出菇效果好，第一茬转换率可高于80%，产量高，能实现规模化栽培，具有较高的应用价值，适用于工厂化生产。

2、本发明还提供了金耳新菌株ZJJE004的SSR分子标记，标记组合为1+3/1+3/2/1/1+4/1/1，可用于金耳菌株ZJJE004的快速鉴定，具有节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的特点。

附图说明

图1为本发明金耳菌株ZJJE004的菌落图；

图2为本发明金耳菌株ZJJE004芽孢的显微结构图；

图3为本发明金耳菌株ZJJE004培养6天的液体菌种图；

图4为本发明金耳菌株ZJJE004菌丝萌发图；

图5 本发明实施例6金耳菌株ZJJE004工厂化栽培子实体的出菇情况图；

图6为本发明实施例6得到的金耳子实体图；

图7 为基于SSR分子标记构建的8株金耳菌株遗传距离UPGMA聚类树；

图8为引物JESSR003、JESSR010、JESSR032、JESSR090、JESSR098、JESSR100分别在金耳菌株ZJJE004中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明金耳菌株ZJJE004采集自高黎贡山野生金耳子实体，并于2022年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.40189。

本发明还提供了金耳菌株ZJJE004的液体菌种培养基，该培养基由麦粉4-6g，玉米粉2-4g，蛋白胨2-4g，葡萄糖15-20g，硫酸镁0.5-1g，磷酸氢二钾1-2g，水1L组成。

本发明进一步提供了金耳菌株ZJJE004液体菌种的培养方法，按以下步骤实现：

1）按照所述液体菌种培养基配方制备液体培养基，在压力0.1～0.2MPa，121℃条件下灭菌20～40min后冷却得到发酵液；

2）将发酵液按1%的比例将毛韧革菌菌种接入，再按1%的比例再次接入金耳ZJJE004菌种，毛韧革菌与金耳的接种比例为1:1；

3）接种完成后摇床或发酵罐培养8-12天即得液体菌种。

步骤3中，摇床的振动速度为800-1000r/min，温度为20-23℃。

本发明进一步提供了金耳菌株ZJJE004的栽培种培养基，由木屑65-70份，玉米芯15-18份，麦麸13.9-15.4份，石膏0.5-0.7份，石灰0.5-0.7份，磷酸二氢钾0.1-0.2份组成。

本发明一种金耳菌株ZJJE004的工厂化栽培方法，按以下步骤实现：

A、按照所述栽培种培养基配方配置栽培种培养基，将含水量调至56-62%，分装栽培袋，在121℃下高压蒸汽灭菌120min，冷却；

B、在栽培袋表面打孔4个，在每个孔内接种5-10ml液体菌种，接种完后贴透气膜封口，在17℃-20℃、空气湿度50%-60%条件下，暗培养20-25天；

C、待金耳原基开始长出，撑开透气膜时，将透气膜撕去，空气湿度提高至80%-85%，16-18℃继续培养10-15天；

D、待金耳原基生长至鸡蛋大小时，将湿度提高至90%-95%，16-19℃，光照继续培养7-10天；

E、待金耳长大快开瓣时，湿度提高至95%-100%，继续光照培养5-7天成熟；

F、待金耳金黄色，且开瓣时即成熟可采摘。

所述步骤A中，采用5*15*55香菇菌袋作为栽培袋。

本发明还提供了金耳菌株ZJJE004的分子标记组合，是由7对SSR分子标记组成：JESSR003、JESSR010、JESSR032、JESSR075、JESSR090、JESSR098及JESSR100；

符合SSR等位片段编号组合为1+3/1+3/2/1/1+4/1/1的菌株为金耳菌株ZJJE004。

实施例1 菌株ZJJE004的分类鉴定

1、形态学鉴定

菌落形态：将采集的金耳菌株ZJJE004成熟子实体孢子分离纯化培养得到菌丝，乳白色，菌落类似酵母形态，如图1所示。

菌丝形态：如图2，孢子圆形，内含油滴，且有很多孢子开始萌发生长出菌丝。

子实体形态：如图6所示，成熟后子实体为金黄色耳瓣状，其外形酷似大脑，初生时，体积较小，白色，表面较平滑；渐渐长大至成熟初期，耳基部楔形，上部凹凸不平，扭曲、肥厚，形如脑状或不规则的裂瓣状，内部组织充实。成熟中期至后期，裂瓣有深有浅；中期，部分裂瓣充实，部分组织松软；成熟后表面金黄色，内部肉质，且呈大理石花纹；直径10-20厘米，厚5-11厘米。

2、分子生物学鉴定

用CTAB法分别提取ZJJE004基因组DNA，并以1%的琼脂糖凝胶电泳后经GelRed染色后进行检测；以提取到的总DNA为模板，采用Mix混合试剂（湖南擎科生物技术有限公司），以ITS4（5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’）和ITS5（5’—GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3’）为引物扩增Internal Transcribed Spacer (ITS)序列。PCR扩增体系为(25 μL)：2×Mix 12.5μl， 10 μM引物各0.5 μL，ddH2O 11 μL，DNA模板0.5 μL。反应程序为：95℃预变性5 min，进入35个扩增循环：95℃ 变性 40 sec，50℃退火40 sec，72℃延伸1 min，然后72℃ 延伸10min，4℃保藏；以1%的琼脂糖凝胶电泳后进行检测，送至擎科生物技术完成测序。测序结果经过双向拼接后获得序列（如SEQ No.1所示）。将序列提交GeneBank，应用BLAST（ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行同源性搜索，与数据库中各菌株序列进行相似性分析，与数据库中已有的

所以综合BLAST比对和子实体形态鉴定的结果，可以得出菌株ZJJE004为新的金耳菌株（

实施例3金耳菌株ZJJE004液体菌种制作

金耳菌株ZJJE004液体菌种培养基的制备方法如下：每1L水中加入5g小麦粉，3g玉米粉，3g蛋白胨，20g葡萄糖，1g硫酸镁，2g磷酸氢二钾，使用1L三角瓶分装，制成700ml液体摇瓶，121℃灭菌30分钟后冷却，放置于超菌台开紫外消毒30分钟备用；

将冷却后的液体摇瓶按1%的比例分别将将毛韧革菌菌种及金耳ZJJE004菌种接入摇瓶（毛韧革菌与金耳的接种比例为1:1），均为7ml；

接种完成后在培养温度23℃，摇床速度800r/min的摇床培养7天即得。制得的液体菌种可以很明显的看到菌丝且浓稠度高（图4），气味为清香型。

实施例4金耳菌株ZJJE004液体菌种制作

金耳菌株ZJJE004液体菌种培养基的制备方法如下：每1L水中加入4g小麦粉，2g玉米粉，4g蛋白胨，15g葡萄糖，0.7g硫酸镁，1g磷酸氢二钾，使用1L三角瓶分装，制成700ml液体摇瓶，121℃灭菌30分钟后冷却，放置于超菌台开紫外消毒30分钟备用；

将冷却后的液体摇瓶按1%的比例分别将将毛韧革菌菌种及金耳ZJJE004菌种接入摇瓶（毛韧革菌与金耳的接种比例为1:1），均为7ml；

接种完成后在培养温度20℃，摇床速度1000r/min的摇床培养10天即得。

实施例5金耳菌株ZJJE004液体菌种制作

一种金耳菌株ZJJE004液体菌种培养基的制备方法如下：每1L水中加入6g小麦粉，4g玉米粉，2g蛋白胨，18g葡萄糖，0.5g硫酸镁，1.5g磷酸氢二钾，使用1L三角瓶分装，制成700ml液体摇瓶，121℃灭菌30分钟后冷却，放置于超菌台开紫外消毒30分钟备用；

将冷却后的液体摇瓶按1%的比例分别将将毛韧革菌菌种及金耳ZJJE004菌种的种子液接入摇瓶（毛韧革菌与金耳的接种比例为1:1），均为7ml；

接种完成后在培养温度21℃，摇床速度900r/min的摇床培养9天即得。

实施例6 金耳菌株ZJJE004的工厂化栽培

1）配置栽培料：按木屑70份，玉米芯15份，麦麸13.9份，石膏0.5份，石灰0.5份，磷酸二氢钾0.1份的栽培料配比称取原料，加水拌匀使含水量为60%；

2）采用5*15*55香菇菌袋作为栽培袋；栽培料装袋；

3）灭菌，采用温度121℃高压蒸汽灭菌120min；灭菌完成后取出冷却；

4）将栽培基质降温冷却至25℃左右时进行液体接种，在长袋表面打孔4个，在孔内接种实施例3制作的10ml液体菌种，接种完后贴透气膜封口，在17℃-20℃、空气湿度50%-60%条件下，暗培养22天；

5）出菇管理：待金耳原基开始长出，撑开透气膜时，将透气膜撕去，空气湿度提高至80%-85%，16-18℃继续培养10天；

6）待金耳原基生长至鸡蛋大小时，将湿度提高至90%-95%，16-19℃，光照继续培养10天；

7）待金耳长大快开瓣时，湿度提高至95%-100%，继续光照培养5天成熟；

8）金耳金黄色成熟采摘，经统计，菌株ZJJE004的出耳率为97%第一茬转换率为85%。

实施例7 金耳菌株ZJJE004的工厂化栽培

1）配置栽培料：按木屑80份，玉米芯10份，麦麸14.5份，石膏0.6份，石灰0.4份，磷酸二氢钾0.12份的栽培料配比称取原料，加水拌匀使含水量为65%；

其他步骤与实施例6相同。

经统计，菌株ZJJE004的出耳率分别为97.5%，一茬生物学效率为90%。

实施例8 采用SSR分子标记鉴别菌株ZJJE004

S1、将待测8个金耳菌株ZJJE001、ZJJE002、ZJJE003、J-2、J-5、J-6、J-7和菌株ZJJE004分别转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养15d后收集菌丝；

S2、提取所述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和质量；

S3、采用表1所示7对SSR分子标记对步骤2提取的DNA进行SSR标记的PCR扩增；

S4、将S3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析SSR引物扩增出的等位片段的数量及分子量大小，获得不同SSR等位片段的编号组合，符合SSR等位片段编号组合为1+3/1+3/2/1/1+4/1/1的菌株即为金耳菌株ZJJE004（图8）。

表1 SSR标记引物信息

S5、聚类分析

基于7对SSR扩增出的多态性片段对8个金耳菌株进行遗传多样性分析，基于Nei的遗传距离，构建了8个金耳菌株的UPGMA聚类树（图7）。从图8可知，本发明提供的7对引物将金耳ZJJE003与ZJJE002聚为一个类群，其他的J-2、J-5、J-6、J-7菌株聚为一个类群，菌株ZJJE001为单独的一枝并完全与其他菌株区分开。说明菌株ZJJE004不同于其余7个菌株，具有特异性。由此可见，本发明提供的7对SSR引物组合可以将菌株ZJJE004与其他7种不同金耳菌株区分开来。