一种检测球孢子菌的特异引物对及其检测方法

技术领域

本发明属于微生物菌检测技术领域，具体涉及一种检测球孢子菌的特异引物对及其检测方法。

背景技术

根据卫生部2006版《人间传染的病原微生物名录》显示，球孢子菌属(Coccidioides spp)包括粗球孢子菌(C.immitis)和波萨达斯球孢子菌(C.posadasii)，为生物危害程度3类的高致病性病原真菌，多流行于北美地区。其中C.immitis的分布局限于加利福尼亚州，而C.posadasii则多流行于美国亚利桑那州南部和西部、德克萨斯州、犹他州及墨西哥等地区，分布更为广泛。(参见吴吉芹，朱利平.球孢子菌病的流行病学、临床表现及诊治进展，微生物与感染，2017年2月25日，12(1)：44-49)在临床上，粗球孢子菌(C.immitis)和波萨达斯球孢子菌(C.posadasii)无论是形态特征还是致病性都十分相似，一般不加以细分，引起的感染统称为球孢子菌病。两者均可引起患者严重的呼吸系统感染，而在免疫受损人群中，更容易引发播散性感染，治愈过程复杂且容易导致死亡(参见Saubolle MA et al.Multicenter Clinical Validation of a Cartridge-Based Real-Time PCR System for Detection of Coccidioides spp.in Lower RespiratorySpecimens.J Clin Microbiol 56:e01277)；另外，由于球孢子菌可以长期存在于碱性干旱土壤中，以菌丝相和关节孢子形式寄生于环境中。一旦出现土壤翻动或风沙等因素，即引起大量关节孢子散播，就造成人群吸入式感染。(参见ThomasJ.Sharpton,JasonE.Stajich,Steven D.Rounsley et al,Comparative genomic analyses of the human fungalpathogens Coccidioides and their relatives,Genome Research,2009(19):1722–1731)。综上原因，球孢子菌(Coccidioides spp)已被美国政府列入可作为生物武器的潜在微生物清单(参见Dixon DM.Coccidioides immitis as a select agent ofbioterrorism,J Appl Microbiol,2001,vol.91(pg.602-605)。

国内学者也已对1958-2017年间中国地区的球孢子菌病例报道进行梳理(Guanzhao Liang，Yongnian Shen，Guixia Lv，et al.Coccidioidomycosis:Imported andpossible domestic cases in China:A case report and review,1958-2017.Mycoses.2018；61:506–513.)，通过分析可以发现，随着社会经济的发展和诊断技术的进步，近年来国内输入性球孢子菌病的发生呈上升趋势；其次，超过一半以上球孢子菌病病例未见明显的境外旅居史，侧面反映出球孢子菌已播散定植于我国境内且存在本土感染的可能性。

此前，国内针对该种高致病性病原真菌临床检测方法已有一些较详细的梳理并报道。其中，吴吉芹，朱利平等人列举了实验室诊断的多种方法(“球孢子菌病的流行病学、临床表现及诊治进展”，《微生物与感染》，2017年2月25日，12(1)：44-49)，包括：1)从无菌体液或组织培养得到具有关节孢子菌体；2)病理学检查发现特征性的小球体；3)血清学抗体检测：酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)或免疫扩散试验，用于同时检测抗体IgM和IgG。上述方法的弊端在于：1)培养纯菌有一定的实验室传播风险，且时效性差，耗时约两周(参见G.S.de Hoog,J.Guarro,J.Gené,et al.Atlas of Clinical Fungi[M].4th edition2020)；2)病理诊断更多是依赖检验人员主观判断，并没有数据或实物支撑；3)血清学抗体检测在感染早起有可能假阴性且仅适用于流行地区作为检测手段，非疫区(包括我国)的临床实验室并不适合开展抗体检测。

利用特异性靶基因区域，开展分子特异性检测是微生物检验领域最为精准、便捷的检测手段。而目前国内在针对球孢子菌临床检测方面尚未开展利用分子手段的特异性检测探索。本领域技术人员一直在探寻可以规避传统培养、病理及抗体等检测方法弊端的、可利用分子快速诊断的技术手段，以确保在安全的实验操作活动中，用最短时间给出鉴定结果，为临床第一时间抢救患者、精准治疗提供依据。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测球孢子菌的特异引物对，利用常规PCR技术，精确实现球孢子菌的检测。所设计的引物对亦可优化用于荧光定量PCR，进行实时快速检测。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种检测球孢子菌的特异性引物对，包括如下三组正向引物和反向引物：

(1)第一组

DS268114.1_s5911-F：GCCAACACTGTTAGCGAGTG

DS268114.1_s5911-R：GGACATCGGAGTGTGGATCC；

(2)第二组

DS268113.1_s3787-F：ACTCTGGCGCATATGGTGAC

DS268113.1_s3787-R：GTTCAGCTTGCCTGTTACGC；

(3)第三组

DS268112.1_s6397-F：TTGCCTCAGTGCTATCCTCG

DS268112.1_s6397-R：AGGCAGACCATCATGTTGCA。

上述3组特异性引物对均可实现对球孢子菌的检测。

本发明还提供一种采用上述特异性引物对检测球孢子菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品中真菌的DNA；

(2)采用上述的任意一组特异性引物对，对步骤(1)获得的样品DNA进行PCR扩增；

(3)扩增后对PCR产物进行电泳条带检测分析。

进一步地，上述PCR扩增的反应体系如下：

上述反应体系中涉及的试剂均可从New England Biolabs公司获得。

进一步地，所述PCR扩增程序为：

(a)95℃预变性5min；

(b)(95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸45s)×35循环

(c)72℃总延伸10min。

本发明设计了多组特异性引物对，分别采用各组特异性引物对对待测样品中的DNA进行PCR扩增，以准确鉴定球孢子菌。本发明的检测方法具有检测快速、特异性强、操作便捷、鉴定准确的优点，克服了传统方法的时效性差、实验室传播风险及假阴性的问题。

附图说明

图1为7株不同来源的球孢子菌利用三组特异引物对扩增阳性的电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1筛选球孢子菌特异性靶基因位点，设计扩增引物

1、基因组查找：在GENEBANK网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询分析Coccidioides immitis和Coccidioides posadasii两个物种的所有基因组数据信息，如下：

Coccidioides immitis：基因组登录号：GCA_000149335.2；GCA_000149895.1；GCA_004115165.2；GCA_000149815.1；GCA_000150085.1Coccidioides posadasii：基因组登录号：GCA_000151335.1；GCA_020976795.1；GCA_020976775.1；GCA_000170175.2；GCA_000150055.1；GCA_000150185.1；GCA_000150215.1；GCA_000150555.1；GCA_000150645.1；GCA_000150615.1；GCA_000150585.1；GCA_000150245.1

2、引物设计：

(1)基于下载的基因组查找Coccidioides immitis和Coccidioides posadasii物种内共有的基因组片段；

(2)根据共有序列设计特有序列引物，确保扩增片段150-280bp；

(3)设计引物比对参考基因组，过滤排除：可比对上其他物种基因组引物、含有三个连续的重复单碱基引物、产物含有小写atcg和N的序列的引物以及可自身基因组多位点扩增的引物。

根据上述方法，初步设计获得10对特异引物，详细序列信息见表1：

表1初步设计获得的10对特异引物

实施例2设计引物的PCR阳性扩增验证

1、球孢子菌的总DNA提取：利用实验室已有的7株posadasii球孢子菌，见表2：

表2 7株posadasii球孢子菌来源

提取各株的总DNA，提取方法为：

(1)利用纯培养的菌株取1g菌体于含有研磨珠的研磨管内；

(2)加入600μL裂解液(100mmol/L的Tris-Hcl、100mmol/L的EDTA、400mmol/L的NaCl和2％SDS)，置于美国MP公司的FastPrep-24高效破碎仪上剧烈研磨30s，将混悬液放入65℃水浴加热10min；

(3)加入140μL饱和酚溶液(pH 4.5±0.2)混匀，10000r/min，离心10min；

(4)取上清液加入400μL的异丙醇，10000r/min，离心2min；

(5)弃上清后控干，加入300μL加热至65℃的双蒸水，吹吸混匀，加入150μL 3M醋酸钠溶液、300μL无水乙醇和5μL核糖核酸酶，混匀；

(6)将混悬液转移至收集管内，10000r/min离心1min，弃废液，加入600μL清洗液对收集管内的DNA离心清洗2次，空离心一次；

(7)用5μL预热TE缓冲液滴入收集管，静置后转移至新的1.5mL离心管内，10000r/min离心1min收集DNA溶液。

上述操作过程中涉及的试剂均来源于生工生物工程(上海)股份有限公司。

2、PCR扩增验证：以提取的7株posadasii球孢子菌总DNA作为模板对表1中10对引物对一一开展PCR实验，进行第一轮验证筛查，PCR方法采用High-Fidelity DNAPolymerases，20μL反应体系：

上述反应体系中涉及的试剂均可从New England Biolabs公司获得。反应缓冲液采用

PCR仪：ABI

PCR反应程序：

a.95℃预变性5分钟

b.(95℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸45秒)×35循环

c.72℃总延伸10分钟

经PCR扩增后，对7个待测posadasii球孢子菌总DNA产生300-400bp大小的单一显著条带的引物对有：DS268114.1_s5911-F&R、DS268113.1_s3787-F&R、DS268112.1_s3207-F&R、DS268112.1_s6397-F&R、DS268111.1_s2251-F&R、DS268110.1_s2902-F&R、DS268110.1_s6544-F&R、DS268109.1_s3844-F&R和DS268109.1_s5971-F&R。

这9对引物对可以对球孢子菌属进行特异序列的单一扩增，引物序列信息详见表1。

实施例3从阳性扩增的引物中扩增筛选球孢子菌属特异性引物

为确保引物具备高度属特异性，只适用于球孢子菌属，发明人设计了排除实验用于确认已对球孢子菌产生阳性扩增的引物不可扩增对其他种属的真菌及人源性基因片段产生阳性扩增。实验方法是以其他真菌/人的基因组DNA为模板对上述9对引物对进行PCR验证，排除实验中的阳性扩增引物(对其他真菌/人的基因组DNA产生PCR阳性被认定为产生非特异性扩增)。

1、排除菌种的设计及DNA提取

将球孢子菌亲缘关系临近的种属以及临床易误诊、易混淆为球孢子菌病的相关病原真菌列为排除的真菌菌种，包括：烟曲霉、土曲霉、黄曲霉、皮炎芽生菌、白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、茄病镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、产黄青霉、圆弧青霉、淡紫拟青霉、小孢根霉、金孢霉和枝顶孢霉，一共16种；发明人从本中心即中国医学科学院病原微生物菌(毒)种保藏中心医学分中心保藏菌种中筛选了上述16种28株病原真菌新鲜菌株，提取各自总DNA作为模板，提取方法同实施例2中球孢子菌的总DNA提取方法。

2、PCR扩增验证

利用实施例2中的9对引物对上述28条总DNA模板进行扩增验证。PCR结果阴性认定为具有球孢子菌属特异性，结果阳性认定为产生非特异性扩增。此轮筛选排除实验的PCR方法同实施例2中PCR扩增反应体系和程序。

经验证后，在9对引物对中，排除3对产生非特异性扩增产物的引物对(DS268112.1_s3207-F&R、DS268110.1_s2902-F&R和DS268109.1_s5971-F&R)，最终确定球孢子菌属特异性引物对6对(DS268114.1_s5911-F&R、DS268113.1_s3787-F&R、DS268112.1_s6397-F&R、DS268111.1_s2251-F&R、DS268110.1_s6544-F&R和DS268109.1_s3844-F&R)，引物序列信息详见表1。

3、人基因组阴性扩增验证

考虑到设计的引物最终面向临床检验及鉴定，因此再次将上一步确认的6对球孢子菌属特异性引物进行人基因组阴性扩增验证，以确认筛选引物对人源基因的PCR扩增应为阴性(人源基因来自临床健康人群体检血液)，排除人源基因在临检过程中的干扰。其PCR扩增方法同实施例2中PCR扩增验证反应体系和程序。

经人基因组PCR验证后，6对引物对中排除3组对人源基因扩增阳性的引物对(DS268111.1_s2251-F&R、DS268110.1_s6544-F&R和DS268109.1_s3844-F&R)，最终确认3对可转化为临床应用的球孢子菌属特异性引物对(DS268114.1_s5911-F&R、DS268113.1_s3787-F&R和DS268112.1_s6397-F&R)，引物序列信息详见表1。

实施例4三组引物对DS268114.1_s5911-F&R、DS268113.1_s3787-F&R和DS268112.1_s6397-F&R检测球孢子菌的方法

按照实施例2中PCR扩增反应体系和程序，对表2中1-7号球孢子菌的DNA进行扩增验证。PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳图结果详见图1。

泳道67-73：引物对DS268114.1_s5911-F&R对表2中1-7号posadasii球孢子菌PCR扩增阳性条带，大小在300～400bp；

泳道74-80：引物对DS268113.1_s3787-F&R对表2中1-7号posadasii球孢子菌PCR扩增阳性条带，大小在300～400bp；

泳道81-87：引物对DS268112.1_s6397-F&R对表2中1-7号posadasii球孢子菌PCR扩增阳性条带，大小在300～400bp。

泳道67-73、74-80和81-87显示三对引物对7株不同来源的球孢子菌特异性扩增结果均为阳性，由此可以证明最终设计筛选的引物对(DS268114.1_s5911-F&R、DS268113.1_s3787-F&R和DS268112.1_s6397-F&R)可有效地特异性扩增球孢子菌属真菌。

本发明是国内首次针对高致病性病原真菌球孢子菌开展的分子快速检测的特异性引物筛选探索，可开发作为快速检测试剂盒，用于临床快速区分、诊断球孢子菌病的分子手段，填补国内在球孢子菌病临床分子诊断的空白，同时也为真菌病的疾病预防控制及进出口检疫提供精准快速的监测。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。