溃疡性结肠炎敏感测试的组合物、设备以及方法

本申请是申请号为201780026191.0、申请日为2017年4月20日、名称为“溃疡性结肠炎敏感测试的组合物、设备以及方法”的专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求享有2016年04月26日提交的序列号为62/327,932的美国临时专利申请的优先权，该临时专利申请在此通过引用全文并入。

技术领域

本发明的领域是用于食物不耐受(food intolerance)的敏感测试(sensitivitytesting)，且尤其当其涉及测试并可能地排除作为用于被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)的患者的诱发食物(trigger food)的所选择的食物项目(fooditem)时。

背景技术

本背景描述包括可以用于理解本发明的信息。本背景描述并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关，或不承认具体或隐含引用的出版物是现有技术。

食物敏感，尤其当其与溃疡性结肠炎(一种炎性肠病)有关时，通常表现为与血液和粘液混合的腹泻且溃疡性结肠炎的深层原因在医学界还未得到充分了解。最典型的是，溃疡性结肠炎通过内镜和放射学检查进行诊断，同时进行血液检查或电解质检查以确定炎症状况。遗憾的是，治疗溃疡性结肠炎通常没那么有效且可能因免疫抑制作用或调节作用而呈现新的困难。排除其他一个或多个食物项目也显示出在至少减少发病率和/或减轻症状的严重度方面是有希望的。然而，就诱发症状的饮食项目而言，溃疡性结肠炎是非常多样的，且还未获知帮助识别具有合理的确定程度的诱发食物项目的标准测试，使这样的患者通常要进行反复试验。

虽然有一些商业化的测试和实验室来帮助识别诱发食物，但是这些实验室的测试结果的质量通常较差，如消费者权益保护组织(如http://www.which.co.uk/news/2008/08/food-allergy-tests-could-risk-your-health-154711/)所报道的。更显著地，与这些测试和实验室相关的问题是高的假阳性率、高的假阴性率、高的患者内变化性以及实验之间的变化性，使得这样的测试几乎是无用的。类似地，另外不确定的且高度变化的测试结果也在其他地方有所报道(Alternative Medicine Review，第9卷，第2期，2004:第198-207页)，且作者推断这可能是因为食物反应和食物敏感经由许多不同的机理发生。例如，并不是所有的溃疡性结肠炎患者显示出对食物A的阳性响应，且并不是所有的溃疡性结肠炎患者显示出对食物B的阴性响应。因而即使溃疡性结肠炎患者显示出对食物A的阳性响应，从患者的食谱中剔除食物A也可能不会减轻患者的溃疡性结肠炎症状。换句话说，还未充分确定目前可用的测试中所采用的食物样品是否基于使对那些食物样品的敏感与溃疡性结肠炎相关的高的可能性被合适地选择。

本文中的所有出版物通过引用被并入到以下程度：好像每一个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地表示为通过引用被并入。如果并入的参考文献中的术语的定义或应用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，那么以本文提供的该术语的定义适用为准，而参考文献中的该术语的定义并不适用。

因而，即使本领域已知用于食物敏感的各种测试，所有或几乎所有这些测试存在一种或多种不足。因此，仍存在对用于食物敏感测试的改进的组合物、设备以及方法的需求，尤其是用于确认且可能地排除被确认罹患或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的诱发食物。

发明内容

本文描述的主题提供了用于测试被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的系统和方法。本公开内容的一个方面是一种用于测试被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的试剂盒(test kit)。该试剂盒包括耦合到可单独寻址的各固相载体(solid carrier)的多个不同的食物制备物。多个不同的食物制备物具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.07，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.10。在一些实施方式中，平均判别p值由包括比较被诊断为罹患溃疡性结肠炎或疑似罹患溃疡性结肠炎的第一患者测试群组的测定值与未被诊断为罹患溃疡性结肠炎的或不是疑似罹患溃疡性结肠炎的第二患者测试群组的测定值的过程确定。

本文描述的实施方式的另一个方面包括一种用于测试被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的方法。该方法包括使食物制备物与被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的体液接触的步骤。体液与性别确认相关联。在某些实施方式中，接触步骤在允许来自体液的IgG结合到食物制备物的至少一种组分的条件下进行。该方法继续步骤：测量结合到食物制备物的至少一种组分的IgG以获得信号，且随后比较信号与使用性别确认得到的食物制备物的性别分层的参考值以获得结果。接着，该方法还包括利用该结果更新或生成报告的步骤。

本文描述的实施方式的另一个方面包括一种生成被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的测试的方法。该方法包括获得多个不同的食物制备物的测试结果的步骤。测试结果基于被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的体液和未被诊断为或不是疑似罹患溃疡性结肠炎的对照组的体液。该方法还包括针对每一个不同的食物制备物，根据性别对测试结果分层的步骤。随后，该方法继续以下步骤：针对每一个不同的食物制备物，将用于男性患者和女性患者的不同的分界值(cutoff value)分配给预定的百分位数排名。

本文描述的实施方式的其它方面包括耦合到可单独寻址的各固相载体的多个不同的食物制备物在诊断溃疡性结肠炎中的用途。多个不同的食物制备物基于它们的由原始p值确定的平均判别p值≤0.07，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.10来选择。

本文描述的实施方式的各种目的、特征、方面和优点将从以下对优选实施方式以及附图的详细描述中变得更加明显，在附图中，相同的附图标记表示相同的部件。

附图说明

表1显示了食物项目的列表，食物制备物可以由这些食物项目制备。

表2显示了根据双尾FDR多重校正的p值排名的食物的统计数据。

表3显示了根据食物和性别的ELISA得分的统计数据。

表4显示了用于预定的百分位数排名的食物的分界值。

图1A图示了用青豆测试的男性溃疡性结肠炎患者和对照的ELISA信号得分。

图1B图示了用青豆测试的超过第90百分位数和第95百分位数的男性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图1C图示了用青豆测试的女性的信号分布以及由女性对照群体确定的第95百分位数分界。

图1D图示了用青豆测试的超过第90百分位数和第95百分位数的女性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图2A图示了用哈密瓜测试的男性溃疡性结肠炎患者和对照的ELISA信号得分。

图2B图示了用哈密瓜测试的超过第90百分位数和第95百分位数的男性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图2C图示了用哈密瓜测试的女性的信号分布以及由女性对照群体确定的第95百分位数分界。

图2D图示了用哈密瓜测试的超过第90百分位数和第95百分位数的女性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图3A图示了用黑白斑豆测试的男性溃疡性结肠炎患者和对照的ELISA信号得分。

图3B图示了用黑白斑豆测试的超过第90百分位数和第95百分位数的男性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图3C图示了用黑白斑豆测试的女性的信号分布以及由女性对照群体确定的第95百分位数分界。

图3D图示了用黑白斑豆测试的超过第90百分位数和第95百分位数的女性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图4A图示了用黄瓜测试的男性溃疡性结肠炎患者和对照的ELISA信号得分。

图4B图示了用黄瓜测试的超过第90百分位数和第95百分位数的男性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图4C图示了用黄瓜测试的女性的信号分布以及由女性对照群体确定的第95百分位数分界。

图4D图示了用黄瓜测试的超过第90百分位数和第95百分位数的女性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。

图5A图示了溃疡性结肠炎受治疗者的根据第90百分位数被确认为诱发食物的食物的数量的分布

图5B图示了溃疡性结肠炎受治疗者的根据第95百分位数被确认为诱发食物的食物的数量的分布。

表5A显示了基于第90百分位数具有阳性结果数量的溃疡性结肠炎患者和对照的原始数据。

表5B显示了基于第95百分位数具有阳性结果数量的溃疡性结肠炎患者和对照的原始数据。

表6A显示出汇总了表5A所示的溃疡性结肠炎患者群体的原始数据的统计数据。

表6B显示出汇总了表5B所示的溃疡性结肠炎患者群体的原始数据的统计数据。

表7A显示出汇总了表5A所示的对照群体的原始数据的统计数据。

表7B显示出汇总了表5B所示的对照群体的原始数据的统计数据。

表8A显示出汇总了表5A所示的溃疡性结肠炎患者群体的原始数据经过对数变换所变换的统计数据。

表8B显示出汇总了表5B所示的溃疡性结肠炎患者群体的原始数据经过对数变换所变换的统计数据。

表9A显示出汇总了表5A所示的对照群体的原始数据经过对数变换所变换的统计数据。

表9B显示出汇总了表5B所示的对照群体的原始数据经过对数变换所变换的统计数据。

表10A显示出比较了基于第90百分位数的溃疡性结肠炎样本与非溃疡性结肠炎样本之间的阳性食物的几何平均数的独立T检验的统计数据。

表10B显示出比较了基于第95百分位数的溃疡性结肠炎样本与非溃疡性结肠炎样本之间的阳性食物的几何平均数的独立T检验的统计数据。

表11A显示出比较了基于第90百分位数的溃疡性结肠炎样本与非溃疡性结肠炎样本之间的阳性食物的几何平均数的Mann-Whitney检验的统计数据。

表11B显示出比较了基于第95百分位数的溃疡性结肠炎样本与非溃疡性结肠炎样本之间的阳性食物的几何平均数的Mann-Whitney检验的统计数据。

图6A图示了表5A所示数据的箱形图和须形图。

图6B图示了表5A所示数据的缺口箱形(notched box)图和须形图。

图6C图示了表5B所示数据的箱形图和须形图。

图6D图示了表5B所示数据的缺口箱形图和须形图。

表12A显示了表5A-11A中所示的数据的受试者工作特征(ROC)曲线分析的统计数据。

表12B显示了表5B-11B中所示的数据的受试者工作特征(ROC)曲线分析的统计数据。

图7A图示了对应于表12A中所示的统计数据的ROC曲线。

图7B图示了对应于表12B中所示的统计数据的ROC曲线。

表13A显示出从基于第90百分位数的阳性食物的数量预测女性患者中的溃疡性结肠炎状态的性能指标的统计数据。

表13B显示出从基于第90百分位数的阳性食物的数量预测男性患者中的溃疡性结肠炎状态的性能指标的统计数据。

表14A显示出从基于第95百分位数的阳性食物的数量预测女性患者中的溃疡性结肠炎状态的性能指标的统计数据。

表14B显示出从基于第95百分位数的阳性食物的数量预测男性患者中的溃疡性结肠炎状态的性能指标的统计数据。

具体实施方式

发明人已经发现食物测试中采用的用于确认被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的诱发食物的食物制备物并不一定是同样好的预测性和/或与溃疡性结肠炎/溃疡性结肠炎症状相关联。的确，多种实验已经揭示出在非常广泛的食物项目中，某些食物项目是高度预测性的/与溃疡性结肠炎高度相关联，而另一些食物项目与溃疡性结肠炎的统计学关联并不显著。

甚至更意想不到的是，发明人发现除了食物项目的高度变化外，测试中对于响应的性别差异性在测定食物项目与溃疡性结肠炎的关联性方面也发挥着重要作用。因此，基于发明人的发现和另外的设想，现在提供了在选择因溃疡性结肠炎症候和症状的减轻而能够被排除的食物项目方面具有明显更高的预测能力的试剂盒和方法。

以下讨论提供了多个示例性实施方式。尽管每个实施方式都表示某些要素的单一组合，但本文描述的概念被认为包括所公开要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方式包括要素A、B和C，并且第二实施方式包括要素B和D，则即使未明确地公开，本文描述的实施方式也被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合。

在一些实施方式中，用于描述并要求保护本发明的某些实施方式的表达量或范围的数字被理解为在某些情形中由术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，书面描述和所附权利要求中描述的数值参数是近似值，可以根据特定实施方式寻求获得的期望性质变化。在一些实施方式中，数值参数应该根据所报告的有效数字的位数且通过应用常规的舍入技术来解释。尽管这样，描述本发明的某些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，而具体实施例中描述的数值被尽可行地精确报告。本发明的一些实施方式中提出的数值可以包含从它们各自的测试测量中存在的必然由标准偏差产生的某些误差。除非上下文做出相反表示，本文描述的所有范围应该被解释为包括它们的端点且开放式范围应该被解释为仅包括商业上可实施的值。类似地，所有列出的值应该被认为包括中间值，除非上下文做出相反表示。

如在本文的说明书和贯穿下面的权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的含义包括复数指代。此外，如本文的说明书中所使用的那样，除非上下文另有明确规定，否则“在…内(in)”的含义包括“在…内(in)”和“在…上(on)”。

本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序被执行，除非本文另外表示或另外与上下文明显矛盾的。关于本文中某些实施方式提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对所要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言不应被解释为表示对本发明的实践必不可少的、任何非要求保护的要素。

本文公开的本发明的可选要素或实施方式的分组不应被解释为限制性的。每个组成员可以单独地或与组中的其他成员或本文中找到的其它要素的任何组合被引用和要求保护。出于简洁和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可被包括在组中或从组中删除。当发生任何此类包括或删除时，本说明书被视为包括经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组合的书面描述。

在一个方面，发明人因此设想了适用于测试被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的试剂盒或测试板(test panel)。最优选地，这样的试剂盒或板将包括多个不同的食物制备物(如，未经处理的或经过处理的提取物，优选地具有任选的共溶剂的含水提取物，其可以被或可以不被过滤等)，这些食物制备物被耦合至可单独寻址的各固相载体(如，呈阵列或微孔板的形式)，其中不同的食物制备物具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.07，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.10。

在一些实施方式中，用于描述并要求保护本发明的某些实施方式的表达成分的量、性质诸如浓度、反应条件等的数字被理解为在某些情形中由术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，书面描述和所附权利要求中描述的数值参数是近似值，可以根据特定实施方式寻求获得的期望性质变化。在一些实施方式中，数值参数应该根据所报告的有效数字的位数且通过应用常规的舍入技术来解释。尽管这样，描述本发明的某些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，而具体实施例中描述的数值被尽可行地精确报告。本发明的一些实施方式中提出的数值可能包含源于它们各自的测试测量中存在的必然由标准偏差产生的某些误差。此外，除非上下文做出相反表示，本文描述的所有范围应该被解释为包括它们的端点且开放式范围应该被解释为仅包括商业上可实施的值。类似地，所有列出的值应该被认为包括中间值，除非上下文做出相反表示。

虽然并不限制到本发明的主题，但是食物制备物将通常由通常已知或疑似为诱发溃疡性结肠炎的症候或症状的食物得到。特别合适的食物制备物可以通过下面概括的实验过程来确认。因而，应理解，食物项目不需要被限制到本文描述的项目，而是所有项目可以被设想，且它们可以通过本文提供的方法被确认。因此，示例性的食物制备物包括由表2中的食物1-58制备的至少两个、至少四个、至少八个或至少十二个食物制备物。仍另外特别设想的食物项目和食物添加剂列在表1中，食物制备物可以由这些食物项目和食物添加剂制备。

使用来自被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的体液和来自健康的对照组个体(即未被诊断为或不是疑似罹患溃疡性结肠炎的那些人)的体液，可以确认许多额外的食物项目。优选地，这样确认的食物项目具有高的判别能力，且因此具有≤0.15，更优选≤0.10，且最优选≤0.05的由原始p值确定的p值，和/或具有≤0.10，更优选≤0.08，且最优选≤0.07的由错误发现率(FDR)多重校正的p值确定的p值。

在某些实施方式中，这样确认的食物项目将具有高的判别能力且因此具有由原始p值确定的p值≤0.15，或≤0.10，或甚至≤0.05，和/或由错误发现率(FDR)多重校正的p值确定的p值≤0.10，或≤0.08，或甚至≤0.07。

因此，如果板具有多个食物制备物，设想多个不同的食物制备物具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.05，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.08，或甚至更优选地，具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.025，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.07。在另外优选的方面，应理解，FDR多重校正的p值可以根据年龄或性别中的至少一个来校正，且最优选地，根据年龄和性别两者来校正。另一方面，如果试剂盒或板被分层以与单个性别一起使用，还设想在试剂盒或板中，当针对单个性别被校正时，多个不同的食物制备物中的至少50％(且更通常70％或全部)具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.07，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.10。此外，应理解，其他分层(如饮食偏好、种族、居住地、遗传倾向性或家族史等)也被设想，且本领域技术人员(PHOSITA)将被易于了解合适的分层选择。

本文中对值的范围的叙述仅仅意在作为落在该范围内的每个单独值的简略说法。除非本文另有说明，否则每个单独的值并入本说明书中，如同它在本文中单独描述一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾。关于本文中某些实施方式提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对另外要求保护的发明的范围构成限制。说明书中的任何语言不应被解释为表示对本发明的实践必不可少的、任何非要求保护的要素。

当然，应注意，特定格式的试剂盒或板可以显著变化且设想的格式包括微孔板、浸量尺、膜结合阵列等。因此，耦合食物制备物的固相载体可以包括多孔板的孔、珠粒(如颜色编码的或磁性的)、吸附膜(如硝化纤维素或微孔/纳米孔聚合物膜等)或电传感器(如印刷的铜传感器或微芯片)。

因此，发明人还设想一种测试被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的方法。更通常地，这样的方法将包括使食物制备物与被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的体液(如全血、血浆、血清、唾液或粪便悬液)接触的步骤，且其中体液与性别确认相关联。如前所述，接触步骤可以在允许来自体液的IgG(或IgE或IgA或IgM)结合到食物制备物的至少一种组分的条件下进行，且结合到食物制备物的组分的IgG随后被量化/测量以获得信号。在一些实施方式中，该信号随后与使用性别确认得到的食物制备物的性别分层的参考值(如至少第90百分位数的值)比较以获得结果，该结果随后用于更新或生成报告(如书面医疗报告、从医生到患者的口头结果报告、基于结果的来自医师的书面或口头指令)。

在某些实施方式中，这样的方法将不会被限制到单个食物制备物，而是将采用多个不同的食物制备物。如前所述，合适的食物制备物可以使用下面描述的各种方法被确认；然而，尤其优选的食物制备物包括表2中的食物1-58和/或表1中的项目。正如上面还注意到的，通常优选地，至少一些或所有的不同的食物制备物具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.07(或≤0.05，或≤0.025)，和/或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.10(或≤0.08，或≤0.07)。

在某些实施方式中，虽然食物制备物由作为未经处理的提取物，或粗过滤的提取物的单个食物项目来制备，但是设想食物制备物可以由多个食物项目的混合物(如包括柠檬、柑橘和葡萄柚的柑橘属的混合物，包括面包酵母和啤酒酵母的酵母的混合物，包括糙米和白米的稻米的混合物，包括蜂蜜、麦芽和蔗糖的糖的混合物来制备)。在一些实施方式中，还设想食物制备物可以由纯化的食物抗原或重组体食物抗原来制备。

正如通常优选地，食物制备物被固定到固体表面上(通常以可寻址的方式)，设想测量结合到食物制备物的组分的IgG或其他类型的抗体的步骤经由ELISA测试来进行。示例性的固体表面包括但不限于多孔板中的孔，使得每一个食物制备物可以与单独的微孔隔离。在某些实施方式中，食物制备物将被耦合至或固定至固体表面上。在其他实施方式中，食物制备物将被耦合至允许在溶液中结合至人免疫球蛋白(如IgG等)的分子标签。

从不同的角度看，发明人还设想一种生成用于被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物不耐受的测试的方法。由于该测试被应用于已经被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者，因而作者并不设想该方法具有诊断目的。相反，该方法用于确认已经被确诊的或疑似的溃疡性结肠炎患者中的诱发食物项目。这样的测试通常将包括获得多个不同的食物制备物的一个或多个测试结果(如ELISA)，其中测试结果基于被诊断为罹患溃疡性结肠炎或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的体液(如血液、唾液、粪便悬液)和未被诊断为罹患溃疡性结肠炎的或不是疑似罹患溃疡性结肠炎的对照组的体液。最优选地，针对每一个不同的食物制备物，测试结果被根据性别分层，针对每一个不同的食物制备物，用于男性患者和女性患者的不同的分界值(如用于男性患者和女性患者的分界值具有至少10％(绝对值)的差)被分配给预定的百分位数排名(如第90百分位数或第95百分位数等)。

正如前面注意到的且虽然并不限制到本发明的主题，设想不同的食物制备物包括选自由表2中的食物1-58和/或表1中的项目组成的组的食物项目制备的至少两个(或六个、或十个、或十五个)食物制备物。另一方面，如果新的食物项目被测试，则应理解，不同的食物制备物包括由不是由表2中的食物1-58的食物项目制备的食物制备物。不考虑食物项目的具体选择，然而，通常优选地，不同的食物制备物将具有由原始p值确定的平均判别p值≤0.07(或≤0.05，或≤0.025)，或由FDR多重校正的p值确定的平均判别p值≤0.10(或≤0.08，或≤0.07)。示例性的方面和方案以及考虑被提供给在下面的实验描述中。

因而，应理解，通过具有本文描述的高置信度检验系统，可以显著降低假阳性率和假阴性率，且尤其是如果检验系统和方法是针对性别差异被性别分层的或校正的，如下显示。因此，这样的优势还未被认识到且期望本文提供的系统和方法将会显著增强用于被诊断为或疑似罹患溃疡性结肠炎的患者的食物敏感测试的预测能力。

实验

用于产生食物制备物的一般方案

对于一些食物提取物，发明人期望由产生食物提取物的特定过程制备的食物提取物比市售的食物提取物在检测溃疡性结肠炎患者的升高的IgG反应性方面提供了更优异的结果。例如，对于谷物和坚果，产生食物提取物的三步过程是优选的。第一步是脱脂步骤。在此步骤中，通过使谷物和坚果的粉末与非极性溶剂接触并收集残余物来提取谷物和坚果中的脂质。然后，通过使脱脂的谷物或坚果粉末与升高的pH接触以获得混合物并从该混合物除去固体以获得液体提取物来提取该粉末。一旦产生液体提取物，则添加水性制剂来稳定该液体提取物。在优选的实施方式中，水性制剂包括糖醇、金属螯合剂、蛋白酶抑制剂、矿物盐以及20-50mM的4-9pH缓冲的缓冲液组分。此制剂允许-70℃下长期存储和多次冻融而不会损失活性。

对于另一个实施例，对于肉类和鱼，产生食物提取物的两步过程是优选的。第一步是提取步骤。在此步骤中，通过在高冲击压力处理器中，在水性缓冲制剂中乳化生的、未蒸煮的肉类或鱼来产生源自生的未蒸煮的肉类或鱼的提取物。接着，除去固体材料以获得液体提取物。一旦产生液体提取物，则添加水性制剂来稳定该液体提取物。在优选的实施方式中，水性制剂包括糖醇、金属螯合剂、蛋白酶抑制剂、矿物盐以及20-50mM的4-9pH缓冲的缓冲液组分。此制剂允许-70℃下长期存储和多次冻融而不会损失活性。

对于另外的实施例，对于水果和蔬菜，产生食物提取物的两步过程是优选的。第一步是提取步骤。在此步骤中，使用提取器(如原汁榨汁机等)以粉碎食物和提取汁液来产生源自水果或蔬菜的液体提取物。接着，除去固体材料以获得液体提取物。一旦产生液体提取物，则添加水性制剂来稳定该液体提取物。在优选的实施方式中，水性制剂包括糖醇、金属螯合剂、蛋白酶抑制剂、矿物盐以及20-50mM的4-9pH缓冲的缓冲液组分。此制剂允许-70℃下长期存储和多次冻融而不会损失活性。

ELISA板的封闭

ELISA制备和样本测试

确定按照区分溃疡性结肠炎与对照受治疗者的ELISA信号的能力的顺序排名的食

由于最终选择的用于食物不耐受小组的食物将不会对特定的性别是特异性的，因而需要性别-中立的食物列表。由于所观察的样本将至少开始是性别失衡的(如，对照：40％的女性，溃疡性结肠炎：55％的女性)，因而通过使用双样本t检验来对针对性别的信号得分建模型并存储残余物供进一步的分析来消除完全因性别引起的ELISA信号幅度的差。对于那些受测试的食物中的每一种，采用具有相对高数目重抽样(如＞1,000、更优选＞10,000、甚至更优选＞50,000)的双样本t检验的排列检验(permutation test)来比较溃疡性结肠炎与对照之间的残余信号得分。萨特思韦特(Satterthwaite)近似被用于分母自由度以解释方差齐性的缺乏，且双尾排列的(2-tailed permuted)p值将代表每一种食物的原始p值。比较中的错误发现率(FDR)由任何可接受的统计程序(如Benjamini-Hochberg、族系错误率(FWER)、每次比较错误率(PCER)等)来校正。

根据食物的双尾FDR多重校正的p值来对食物排名。具有等于或小于期望的FDR阈值的校正p值的食物被认为在溃疡性结肠炎中比在对照受治疗者中具有明显更高的信号得分，且因此被认为是包括在食物不耐受小组中的候选者。表2提供了代表统计程序的结果的典型结果。此处，食物的排名是根据经FDR校正的双尾排列T检验的p值。

基于早期的实验(数据未显示在本文中；参见US 62/327932)，发明人设想甚至对于受测试的同一个食物制备物，至少好几种食物项目的ELISA得分显著变化，且示例性的原始数据提供在表3中。因此，正如将容易理解的，如果同样的分界值被应用于男性数据和女性数据的原始数据，则没有根据性别分层的数据将丧失重要的解释能力。为了克服此缺陷，发明人因此设想按照下面的描述根据性别来对数据分层。

每一种食物的分界点(cutpoint)选择的统计方法：可以通过使对照受治疗者中的信号得分的分布汇总来确定何种ELISA信号得分将构成“阳性”响应。对于每一种食物，具有所观察的得分大于或等于对照受治疗者分布的选定分位数的溃疡性结肠炎受治疗者将被认为是“阳性的”。为了减少任一个受治疗者对分界点确定的影响，每一种食物-特异性的和性别-特异性的数据集将被自助(bootstrap)重抽样1000次。在每一次自助重复中(bootstrap replicate)，将确定对照信号得分的第90百分位数和第95百分位数。自助样本中的每一位溃疡性结肠炎受治疗者将与第90百分位数和第95百分位数比较以确定他/她是否具有“阳性”响应。每一种食物和性别的最终的基于第90百分位数和第95百分位数的分界点将被计算为整个1000份样本中的平均第90百分位数和第95百分位数。通过池化(pooling)整个食物的数据来计算每一位溃疡性结肠炎受治疗者被认为对食物是“阳性的”食物的数量。采用这样的方法，发明人现在将能够确认预定的百分位数排名的分界值，该值在大多数情形中是显著不同的，正如可以从表4看到的。

图1A-1D显示了相对于青豆的、血液中的IgG响应的性别差异的典型示例，其中图1A显示了男性的信号分布以及由男性对照群体确定的第95百分位数分界。图1B显示了超过第90百分位数和第95百分位数的男性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布，而图1C显示了女性的信号分布以及由女性对照群体确定的第95百分位数分界。图1D显示了超过第90百分位数和第95百分位数的女性溃疡性结肠炎受治疗者的百分数分布。以同样的方式，图2A-2D示例性地描绘了对哈密瓜的不同响应，图3A-3D示例性地描绘了对黑白斑豆的不同响应以及图4A-4D示例性地描绘了对黄瓜的不同响应。图5A-5B显示了溃疡性结肠炎受治疗者的根据在第90百分位数(5A)和第95百分位数(5B)下被确认为诱发食物的食物数量的分布。发明人设想不考虑特定的食物项目，男性和女性响应是显著不同的。

应注意，本领域未提供与溃疡性结肠炎有关的被性别分层的任何可预测的食物组。因而，发现对性别显示出不同响应的食物项目是出人意料的结果，就之前可获得的所有技术而言，这不能够被明显预料到。换句话说，基于性别分层选择食物项目提供了出人意料的技术效果，使得作为男性或女性溃疡性结肠炎患者的诱发食物的特定食物项目的统计学显著性得以显著改进。

IgG响应数据的归一化

在其他实施例中，患者的食物特异性IgG结果(如对虾特异性的IgG和对猪肉特异性的IgG等)中的一个或多个可以被归一化为患者的食物特异性IgG结果的全局均值。患者的食物特异性IgG的全局均值可以通过患者的食物特异性IgG的总量来测量。在此情形中，患者对虾的特异性IgG可以被归一化为患者的总食物特异性IgG(如对虾、猪肉、珍宝蟹、鸡肉、豌豆等的IgG水平的平均值)的平均值。然而，还设想患者的食物特异性IgG的全局均值可以通过患者的对特定种类的食物的IgG水平经由多次测试来测量。如果之前已经针对患者测试了5次对虾的敏感且测试了7次对猪肉的敏感，那么患者的对虾或对猪肉的新的IgG值被归一化为对虾的5次测试结果的平均值或对猪肉的7次测试结果的平均值。患者的对虾特异性的IgG的归一化值可以是6.0且患者的对猪肉特异性的IgG的归一化值可以是1.0。在此情形中，患者此时对虾的敏感是对虾的平均敏感的6倍，但具有基本上类似的对猪肉的敏感。然后，患者对虾和猪肉的敏感可以基于这样的比较被指数化。

确定溃疡性结肠炎患者的具有构成溃疡性结肠炎基础的食物敏感的子集的方法

表5A和表5B提供了示例性的原始数据。正如应该被容易理解的，数据表示了基于第90百分位数值(表5A)或基于第95百分位数值(表5B)的58份样本食物中的阳性结果的数量。根据ICD-10编码，第1列是溃疡性结肠炎(n＝103)；第二列是非溃疡性结肠炎(n＝163)。计算了溃疡性结肠炎患者和非溃疡性结肠炎患者的平均数和中值数。从表5A和5B显示的原始数据看，计算了溃疡性结肠炎患者和非溃疡性结肠炎患者的阳性食物的数量的平均值和标准偏差。另外，计算了溃疡性结肠炎患者和非溃疡性结肠炎患者的具有零阳性食物的患者的数量和百分数。基于第90百分位数值(表5A)的溃疡性结肠炎群体中具有零阳性食物的患者的数量和百分数不到非溃疡性结肠炎群体中具有零阳性食物的患者的百分数的六分之一(分别为3％对比19％)，且基于第95百分位数值(表5B)的溃疡性结肠炎群体中的此百分数也不到非溃疡性结肠炎群体的一半(分别为12％对比31％)。因而，可以容易理解，对零阳性食物敏感的溃疡性结肠炎患者不可能具有反映他们的溃疡性结肠炎症候和症状的食物敏感性。

表6A和表7A显示出汇总了表5A所示的两类患者群体的原始数据的示例性的统计数据。统计数据包括正态性(normality)、算术平均值、中值、百分位数以及代表溃疡性结肠炎群体和非溃疡性结肠炎群体中的阳性食物的数量的平均值和中值的95％置信区间(CI)。表6B和表7B显示出汇总了表5B所示的两类患者群体的原始数据的示例性的统计数据。统计数据包括正态性、算术平均值、中值、百分位数以及代表溃疡性结肠炎群体和非溃疡性结肠炎群体中的阳性食物的数量的平均值和中值的95％置信区间(CI)

表8A和表9A显示出汇总了表5A所示的两类患者群体的原始数据的另一个示例性统计数据。在表8A和9A中，原始数据通过对数变换进行变换以改善数据解释。表8B和表9B显示出汇总了表5B所示的两类患者群体的原始数据的另一个示例性统计数据。在表8B和9B中，原始数据通过对数变换进行变换以改善数据解释。

表10A和表11A显示了独立的T检验(表10A，经过对数变换的数据)和Mann-Whitney检验(表11A)的示例性统计数据以比较溃疡性结肠炎样本与非溃疡性结肠炎样本之间的阳性食物的几何平均数。表10A和表11A中显示的数据表明溃疡性结肠炎群体与非溃疡性结肠炎群体之间的食物的阳性数量的几何平均值的显著统计学差异。在两种统计检验中，显示了关于58份食物样本的阳性响应的数量在溃疡性结肠炎群体中比在非溃疡性结肠炎群体中明显更高且平均判别p值≤0.0001。这些统计数据还图示为图6A中的箱形图和须形图，和图6B中的缺口箱形图和须形图。

表10B和表11B显示了独立的T检验(表10A，经过对数变换的数据)和Mann-Whitney检验(表11B)的示例性统计数据以比较溃疡性结肠炎样本与非溃疡性结肠炎样本之间的阳性食物的几何平均数。表10B和表11B中显示的数据表明溃疡性结肠炎群体与非溃疡性结肠炎群体之间的食物的阳性数量的几何平均值的显著统计学差异。在两种统计检验中，显示了关于58份食物样本的阳性响应的数量在溃疡性结肠炎群体中比在非溃疡性结肠炎群体中明显更高且平均判别p值≤0.0001。这些统计数据还图示为图6C中的箱形图和须形图，和图6D中的缺口箱形图和须形图。

表12A显示了表5A-11A所显示的数据的受试者工作特征(ROC)曲线分析的示例性统计数据以确定表5中采用的测试在区分溃疡性结肠炎受治疗者与非溃疡性结肠炎受治疗者方面的诊断能力。当采用超过5种阳性食物的分界标准时，测试得到66％敏感度和68％特异度的数据，且具有0.720的曲线下面积(AUROC)。ROC的p值在<0.0001的p值时是显著的。图7A图示了对应于表12A所示的统计数据的ROC曲线。由于溃疡性结肠炎群体与非溃疡性结肠炎群体之间的统计学差异是显著的，当测试结果被以5个阳性数量分界时，患者测试阳性的食物的数量可以被用作对初步临床诊断溃疡性结肠炎的证实，和对食物敏感是否可以反映患者的溃疡性结肠炎的症候和症状的证实。因此，上述测试可以被用作另一种“划入(rulein)”测试以添加到目前可用的诊断溃疡性结肠炎的临床标准中。

如基于第90百分位数数据的表5A-12A和图7A所示，无论是比较数据的几何平均值还是中值，溃疡性结肠炎对比非溃疡性结肠炎受治疗者中看到的阳性食物的数量都是显著不同的。1个人所具有的阳性食物的数量标示受治疗者中溃疡性结肠炎的存在。具有～66％敏感度和～68％特异度，测试具有检测溃疡性结肠炎的区分能力。另外，具有0阳性食物的受治疗者的绝对数和百分比在溃疡性结肠炎受治疗者对比非溃疡性结肠炎受治疗者中也是非常不同的，具有0阳性食物的溃疡性结肠炎受治疗者的百分比(3％)远低于具有0阳性食物的非溃疡性结肠炎受治疗者的百分比(19％)。此数据表明溃疡性结肠炎患者的子集可能因其他非饮食的因素而罹患溃疡性结肠炎，且可能没有获益于饮食限制。

表12B显示了表5B-11B所显示的数据的受试者工作特征(ROC)曲线分析的示例性统计数据以确定表5中采用的测试在区分溃疡性结肠炎受治疗者与非溃疡性结肠炎受治疗者方面的诊断能力。当采用超过3种阳性食物的分界标准时，测试得到60.2％敏感度和75.5％特异度的数据，且具有0.719的曲线下面积(AUROC)。ROC的p值在<0.0001的p值时是显著的。图7B图示了对应于表12B所示的统计数据的ROC曲线。由于溃疡性结肠炎群体与非溃疡性结肠炎群体之间的统计学差异是显著的，当测试结果被以大于3个阳性数量分界时，患者测试阳性的食物的数量可以被用作对初步临床诊断溃疡性结肠炎的证实，和对食物敏感是否可以反映患者的溃疡性结肠炎的症候和症状的证实。因此，上述测试可以被用作另一种“划入”测试以添加到目前可用的诊断溃疡性结肠炎的临床标准中。

如基于第95百分位数数据的表5B-12B和图7B所示，无论是比较数据的几何平均值还是中值，溃疡性结肠炎对比非溃疡性结肠炎受治疗者中看到的阳性食物的数量都是显著不同的。1个人所具有的阳性食物的数量标示受治疗者中溃疡性结肠炎的存在。具有～60％敏感度和～76％特异度，测试具有检测溃疡性结肠炎的区分能力。另外，具有0阳性食物的受治疗者的绝对数和百分比在溃疡性结肠炎受治疗者对比非溃疡性结肠炎受治疗者中也是非常不同的，具有0阳性食物的溃疡性结肠炎受治疗者的百分比(～19％)远低于具有0阳性食物的非溃疡性结肠炎受治疗者的百分比(～31％)。此数据表明溃疡性结肠炎患者的子集可能因其他非饮食的因素而具有溃疡性结肠炎，且可能没有获益于饮食限制。

用于确定每人的称为“阳性”食物的数量的分布的方法

一旦所有的食物项目被认为是阳性的或阴性的，则每位受治疗者的116次(58种食物×2个分界点)呼叫(call)的结果被保存在每一个自助重复中。然后，对于每一位受治疗者，58次呼叫被采用作为分界点的第90百分位数来求和以得到“阳性食物(第90)的数量”，且剩余58次呼叫被采用第95百分位数来求和以得到“阳性食物(第95)的数量”。接着，在每一个重复中，汇总整个受治疗者的“阳性食物(第90)的数量”和“阳性食物(第95)的数量”以得到如下所述的每个重复的描述性统计量：1)总体平均值等于平均值的平均值；2)总体标准偏差等于标准偏差的平均值；3)总体中值等于中值的平均值；4)总体最小值等于最小值的最小值；以及5)总体最大值等于最大值的最大值。在此分析中，当计算频率分布和直方图时，为了避免非整数的“阳性食物的数量”，作者假设相同的原始数据集的1000次重复实际上是添加到原始样本中的具有相同尺度的999个集的新的受治疗者。一旦完成数据的汇总，就采用程序“a_pos_foods.sas、a_pos_foods_by_dx.sas”生成有关两种性别和有关溃疡性结肠炎受治疗者和对照受治疗者两者的“阳性食物(第90)的数量”和“阳性食物(第95)的数量”的频率分布和直方图。

测量诊断性能的方法

为了提高准确度，上述分析通过将分界点从2个增加到高达58个，且重复用于1000个自助重复中的每一个来被重复。于是，1000个自助重复中的性能指标通过采用程序“t_pos_foods_by_dx.sas”计算平均值被汇总。女性和男性的诊断性能的结果显示在表13A和13B(第90百分位数)和表14A和14B(第95百分位数)中。

当然，应理解，可以对食物制备物作出某些变化而不会改变本文提供的本发明的主题。例如，如果食物项目是黄洋葱，则该项目应该被理解为还包括被证明在测试中具有等同活性的其他洋葱种类。的确，发明人注意到，对于每一个所测试的食物制备物，某些其他相关的食物制备物也以相同或等同的方式(数据未显示)被测试。因而，应理解，每一个受测试的且要求保护的食物制备物将存在与具有经验证的测试中的相同或等同反应的的制备物相关联的等同物。

对于本领域技术人员应该明显的是除了已经描述的那些之外，还可以在不脱离本文的发明构思的前提下进行更多的修改。因此，除了所附权利要求的精神外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应以符合上下文的最广泛的方式进行解释。特别地，术语“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应被解释为以非排他性方式指代要素、部件或步骤，指示参考要素、部件或步骤可以与未明确引用的其他要素、部件或步骤存在或使用或组合。如果说明书声明指代选自由A、B、C...和N组成的组中的至少一种，则文本应该被解释为仅需要组中的一个要素，而不是A加N或B加N等。

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表1根据经FDR校正的双尾排列T检验的p值的食物的排名

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表2

根据食物和性别的ELISA得分的基本描述性统计量比较渍疡性结肠炎与对照

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表3

作为候选者的对照受治疗者的ELISA信号得分的上侧分位数用于确定“阳性”或“阴性”的检验分界点使用排列检验的按区分能力的降序排名的前58种食物

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表4

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表5A

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表5B

表6A

表6B

表7A

表7B

表8A

表8B

表9A

表9B

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表10A

表10B

表11A

表11B

表12A

表12B

从阳性食物的数量预测溃疡性结肠炎状态的性能指标使用ELISA信号的第90百分位数以确定阳性

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表13A

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表13B

从阳性食物的数量预测溃疡性结肠炎状态的性能指标使用ELISA信号的第95百分位数以确定阳性

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表14A

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表14B