一种氢氧化铝佐剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，特别是涉及一种氢氧化铝佐剂的制备方法及其应用。

背景技术

氢氧化铝佐剂作为使用时间最长的人用佐剂，可以很好的吸附抗原来提高疫苗的免疫原性。铝佐剂历史悠久，在规模化，实用性，安全性方面也得到了很好的验证，如今铝佐剂越来越受到广泛的重视，目前铝佐剂已有的生产工艺有很多种，铝佐剂的性质和适用范围还比较单一，需要开发具有不同理化性质的佐剂以适应各种抗原，提高疫苗的性能。一般认为氢氧化铝佐剂有三种以上结构形态，可为勃姆石、拜铝石、水合氢氧化铝等。在氢氧化铝佐剂的制备过程或后续使用中，氢氧化铝佐剂可向不同的形态转变，并且在所处的环境不同其理化性质极其不稳定，这就使得在配制、处理、灭菌、使用中等过程中无法准确的把控佐剂的质量，缺乏稳定性和可控性。

疫苗使用佐剂的选择中，一款适合的佐剂可在加入量较少的情况下达到最佳的吸附状态，从而加强诱导免疫应答反应，提高免疫原性。影响氢氧化铝佐剂性质的因素有很多，例如，配制过程中因素包括滴加方式、过程pH控制、终点选择等，佐剂后处理的因素包括pH、电导率、电镜结构、粒径等。实际研究发现，在与抗原的混合中，已有的氢氧化铝佐剂存在稳定性差，容易形成胶粒团聚，吸附后沉淀稀疏或易结块，吸附后pH不可控，可能需要二次加酸加碱来调节体系pH，严重的影响了氢氧化铝佐剂的应用。

发明内容

本发明提供一种氢氧化铝佐剂的制备方法，包括下述步骤：

混合反应步骤：将氯化铝溶液和氢氧化钠溶液加入水体系内进行反应，获得氢氧化铝胶体悬液；

制备混合液：将氢氧化铝胶体悬液离心获得沉淀物，将沉淀物加水制备为悬液，加入脲溶液获得混合液。

优选的，所述混合反应步骤包括：第一阶段：调节所述氢氧化钠溶液的加入量至所述水体系达到pH设定值；

第二阶段：然后通过调节所述氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值，同时进行加入所述氯化铝溶液进行反应。

第三阶段:通过调节所述氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值进行陈化。

优选的，所述第一阶段的时间不大于5分钟；

所述pH设定值为5.5-7.0；

所述陈化包括在200rpm转速下，搅拌60min-90min。

优选的，所述混合反应步骤中：

所述水体系的体积与反应消耗的氢氧化钠溶液体积之比为160:6-12；

所述水体系的体积与反应消耗的氯化铝溶液体积之比为160:3-6；

所述混合反应消耗的氢氧化钠和氯化铝的物质的量比为2.8-3.0；

所述混合反应在70℃，搅拌下进行。

优选的，所述混合反应步骤中：

所述氢氧化钠溶液的物质的量浓度为0.25-0.6mol/L，所述氯化铝溶液的物质的量浓度为0.17-0.41mol/L；

所述氢氧化钠溶液通过位于反应罐顶部中心位置的第一喷雾头进行加入，所述氯化铝溶液通过与反应罐顶部中心位置对称设置第二喷雾头、第三喷雾头进行加入。

优选的，所述制备混合液步骤中：将沉淀物加20-60℃的水，制备质量浓度为3-10mg/ml的悬液；

所述脲溶液的质量浓度为0.05％；所述脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/40-1/30。

优选的，所述混合反应步骤之前还包括：

调节反应体系pH步骤：将氯化铝溶液加入所述水体系至pH为5.0.

优选的，所述制备混合液步骤之后还包括：

制备佐剂原液步骤：将混合液灭菌，透析除氨，分装再次灭菌获得氢氧化铝原液。

本申请还提供一种采用上述方法制备的佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明的氢氧化铝佐剂的制备方法及佐剂具有下述优点：

1、本申请中氢氧化钠和氯化铝在水体系下反应，其反应更充分。与传统碱入铝溶液制备工艺相比，可很大程度的避免在碱液滴加至氯化铝溶液后，在局部高浓氢氧根离子环境下，生成非氢氧化铝物质。且随着氢氧化铝浓度升高至一定范围，氢氧根离子的进入极易造成胶体沉聚，使得佐剂产生不可逆的钝化。

2、本申请中在水体系环境下反应更加有利于氢氧化铝聚集形成1-5μm的佐剂粒子，这种粒子保留了拟勃姆石的特性，即比表面积大，吸附力强。佐剂粒子可以在吸附抗原过程中相互作用，将抗原与佐剂紧密的包裹在一起，大大减缓了抗原在机体内释放的速度，达到持续免疫的效果。

3、本申请中高压灭菌时，脲受热水解达到80℃以上时释放出氢氧根离子，并随着温度的升高反应加剧，此时制备的具有拟勃姆石结构的氢氧化铝也随着温度的升高出现脱质子化反应，水解生成的氢氧根离子中和脱下来的质子，并在一定程度下加速脱质子化的进程。与此同时，佐剂中存在的未反应完全的含铝氧化物可以与弱碱发生充分反应。这种均匀的反应促使佐剂形态有序转变，这种有序的转变在一定程度下，生成介于拟勃姆石至勃姆石的晶型结构，这种结构保留了较大的比表面积，又可耐重复高压灭菌，同时保持较为稳定的理化性质。

4、本申请的佐剂耐酸碱调节，与抗原混合后无剧烈反应(如团聚、沉淀、结块等)，可避免吸附制备成原液后二次调节pH对机体免疫应答或致敏性造成影响。已有的氢氧化铝佐剂工艺具有特定pH或粒径，对使用环境要求极高，在使用中环境的变化极易对氢氧化铝佐剂造成不可逆的性质变化。

5、本申请的佐剂具有较大粒径范围，不同的抗原匹配特定粒径范围的佐剂可以产生最佳的效果，本申请制备的不同理化性质的佐剂能为不同抗原提供最佳的适配佐剂。

附图说明

图1采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例1获得悬液(高压前)的粒径。

图2采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例1获得第一份混合液一次高压(灭菌)后的粒径。

图3采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例1获得第一份混合液二次高压(灭菌)后的粒径。

图4采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例1获得第一份混合液三次(多次)高压(灭菌)后的粒径。

图5采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例1获得第二份混合液一次高压(灭菌)后的粒径(pH7.0)。

图6，对实施例1中图1至4中的样品进行pH测试获得pH变化情况。

图7采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例2获得悬液(高压前)的粒径。

图8采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例2获得第一份混合液一次高压(灭菌)后的粒径。

图9采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例2获得第一份混合液二次高压(灭菌)后的粒径。

图10采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例2获得第一份混合液三次(多次)高压(灭菌)后的粒径。

图11采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例2获得第二份混合液一次高压(灭菌)后的粒径(pH6.05)。

图12，对实施例2中图7至10中的样品进行pH测试获得pH变化情况。

图13采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例3获得悬液(高压前)的粒径。

图14采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例3获得第一份混合液一次高压(灭菌)后的粒径。

图15采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例3获得第一份混合液二次高压(灭菌)后的粒径。

图16采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例3获得第一份混合液三次(多次)高压(灭菌)后的粒径。

图17采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例3获得第二份混合液一次高压灭菌后的粒径(pH7.50)。

图18，对实施例3中图13至16中的样品进行pH测试获得pH变化情况。

图19采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例4获得悬液(高压前)的粒径。

图20采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例4获得第一份混合液一次高压(灭菌)后的粒径。

图21采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例4获得第一份混合液二次高压(灭菌)后的粒径。

图22采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例4获得第一份混合液三次(多次)高压(灭菌)后的粒径。

图23采用马尔文Zetasizer Nano粒度仪检测实施例4获得第二份混合液一次高压(灭菌)后的粒径(pH6.44)。

图24，对实施例4中图19至22中的样品进行pH测试获得pH变化情况。

具体实施方式

下面将结合附图及较佳实施例对本发明的技术方案进行详细描述。

实施例1：

1、实验准备步骤：

在反应罐中预置160L的水，在氢氧化钠配制罐里配制0.4mol/L氢氧化钠溶液9L，在氯化铝配制罐里配制0.27mol/L的氯化铝溶液4.5L，氢氧化钠配制罐和氯化铝配制罐均安装0.45μm的滤芯进行过滤，将氢氧化钠溶液通过位于反应罐顶部中心位置的第一喷雾头进行加入，所述氯化铝溶液通过与反应罐顶部中心位置对称设置第二喷雾头、第三喷雾头进行加入；位于第二喷雾头、第三喷雾头距离第一喷雾头2/3半径处。反应罐开启搅拌，搅拌速度为160rpm，打开夹套循环水，升温至70℃并保持。

2、调节反应体系pH步骤：

将氯化铝溶液加入反应罐中，使水体系的pH为5.0，流速为1ml/min。

3、混合反应步骤：

第一阶段：同时加入氢氧化钠溶液和氯化铝溶液，并通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量至水体系达到pH设定值6.5，氢氧化钠溶液流速为35ml/min，氯化铝溶液流速为18ml/min；调节pH至设定值的时间2分钟。

第二阶段：然后通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值，同时加入氯化铝溶液进行反应。

第三阶段:待氯化铝溶液加入完成，通过调节所述氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值进行陈化，即在200rpm转速下，搅拌80min。

至反应完毕后，消耗氢氧化钠溶液3.58mol，消耗氯化铝溶液1.21mol，混合反应消耗的氢氧化钠和氯化铝的物质的量比为3.0。

4、制备混合液：搅拌状态下，降温，出料，离心，离心条件为转速7000rpm，时间为10min，获得沉淀物，用50℃水将其溶解成5mg/ml的悬液。

将悬液分成两份，称重，第一份①：得氢氧化铝质量为3.2Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液80g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/40；第二份②得氢氧化铝质量为3.2Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液105g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/30；

5、制备佐剂原液步骤：将混合液在121℃、灭菌30min，通过透析袋透析除氨，至无残留的离子后，分装再次121℃、灭菌30min获得氢氧化铝原液。

实施例2：

1、实验准备步骤：

在反应罐中预置160L的水，在氢氧化钠配制罐里配制0.25mol/L氢氧化钠溶液6L，在氯化铝配制罐里配制0.17mol/L的氯化铝溶液3L，氢氧化钠配制罐和氯化铝配制罐均安装0.45μm的滤芯进行过滤，将氢氧化钠溶液通过位于反应罐顶部中心位置的第一喷雾头进行加入，所述氯化铝溶液通过与反应罐顶部中心位置对称设置第二喷雾头、第三喷雾头进行加入；位于第二喷雾头、第三喷雾头距离第一喷雾头2/3半径处。反应罐开启搅拌，搅拌速度为150rpm，打开夹套循环水，升温至70℃并保持。

2、调节反应体系pH步骤：

将氯化铝溶液加入反应罐中，使水体系的pH为5.0，流速为1ml/min。

3、混合反应步骤：

第一阶段：同时加入氢氧化钠溶液和氯化铝溶液，并通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量至水体系达到pH设定值5.5，氢氧化钠溶液流速为28ml/min，氯化铝溶液流速为15ml/min；调节pH设定值的时间3分钟。

第二阶段：然后通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值，同时加入氯化铝溶液进行反应。

第三阶段:待氯化铝溶液加入完成，通过调节所述氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值进行陈化，即在200rpm转速下，搅拌60min。

至反应完毕后，消耗氢氧化钠溶液1.48mol，消耗氯化铝溶液0.51mol，混合反应消耗的氢氧化钠和氯化铝的物质的量比为2.9。

4、制备混合液：搅拌状态下，降温，出料，离心，离心条件为转速7000rpm，时间为10min，获得沉淀物，用20℃水将其溶解成3mg/ml的悬液。

将悬液分成两份，称重，第一份①：得氢氧化铝质量为1.5Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液37g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/40；第二份②得氢氧化铝质量为1.5Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液50g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/30；

5、制备佐剂原液步骤：将混合液在121℃、灭菌30min，通过透析袋透析除氨，至无残留的离子后，分装再次121℃、灭菌30min获得氢氧化铝原液。

实施例3：

1、实验准备步骤：

在反应罐中预置160L的水，在氢氧化钠配制罐里配制0.6mol/L氢氧化钠溶液12L，在氯化铝配制罐里配制0.41mol/L的氯化铝溶液6L，氢氧化钠配制罐和氯化铝配制罐均安装0.45μm的滤芯进行过滤，将氢氧化钠溶液通过位于反应罐顶部中心位置的第一喷雾头进行加入，所述氯化铝溶液通过与反应罐顶部中心位置对称设置第二喷雾头、第三喷雾头进行加入；位于第二喷雾头、第三喷雾头距离第一喷雾头2/3半径处。反应罐开启搅拌，搅拌速度为180rpm，打开夹套循环水，升温至70℃并保持。

2、调节反应体系pH步骤：

将氯化铝溶液加入反应罐中，使水体系的pH为5.0，流速为1ml/min。

3、混合反应步骤：

第一阶段：同时加入氢氧化钠溶液和氯化铝溶液，并通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量至水体系达到pH设定值7.0，氢氧化钠溶液流速为45ml/min，氯化铝溶液流速为23ml/min；调节pH设定值的时间2分钟。

第二阶段：然后通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值，同时加入氯化铝溶液进行反应。

第三阶段:待氯化铝溶液加入完成，通过调节所述氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值进行陈化，即在200rpm转速下，搅拌90min。

至反应完毕后，消耗氢氧化钠溶液6.9mol，消耗氯化铝溶液2.46mol，混合反应消耗的氢氧化钠和氯化铝的物质的量比为2.8。

4、制备混合液：搅拌状态下，降温，出料，离心，离心条件为转速7000rpm，时间为10min，获得沉淀物，用60℃水将其溶解成10mg/ml的悬液。

将悬液分成两份，称重，第一份①：得氢氧化铝质量为3.0Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液75g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/40；第二份②得氢氧化铝质量为3.0Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液85g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/35；

5、制备佐剂原液步骤：将混合液在121℃、灭菌30min，通过透析袋透析除氨，至无残留的离子后，分装再次121℃、灭菌30min获得氢氧化铝原液。

实施例4：

1、实验准备步骤：

在反应罐中预置160L的水，在氢氧化钠配制罐里配制0.25mol/L氢氧化钠溶液8L，在氯化铝配制罐里配制0.17mol/L的氯化铝溶液4L，氢氧化钠配制罐和氯化铝配制罐均安装0.45μm的滤芯进行过滤，将氢氧化钠溶液通过位于反应罐顶部中心位置的第一喷雾头进行加入，所述氯化铝溶液通过与反应罐顶部中心位置对称设置第二喷雾头、第三喷雾头进行加入；位于第二喷雾头、第三喷雾头距离第一喷雾头2/3半径处。反应罐开启搅拌，搅拌速度为160rpm，打开夹套循环水，升温至70℃并保持。

2、调节反应体系pH步骤：

将氯化铝溶液加入反应罐中，使水体系的pH为5.0，流速为1ml/min。

3、混合反应步骤：

第一阶段：同时加入氢氧化钠溶液和氯化铝溶液，并通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量至水体系达到pH设定值6.0，氢氧化钠溶液流速为36ml/min，氯化铝溶液流速为18ml/min；调节pH设定值的时间3分钟。

第二阶段：然后通过实时调节氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值，同时加入氯化铝溶液进行反应。

第三阶段:待氯化铝溶液加入完成，通过调节所述氢氧化钠溶液的加入量维持所述pH设定值进行陈化，即在200rpm转速下，搅拌90min。

至反应完毕后，消耗氢氧化钠溶液1.95mol，消耗氯化铝溶液0.68mol，混合反应消耗的氢氧化钠和氯化铝的物质的量比为2.87。

4、制备混合液：搅拌状态下，降温，出料，离心，离心条件为转速7000rpm，时间为10min，获得沉淀物，用50℃水将其溶解成5mg/ml的悬液。

将悬液分成两份，称重，第一份①：得氢氧化铝质量为1.7Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液42g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/40；第二份②得氢氧化铝质量为1.7Kg，加入质量浓度为0.05％的脲溶液56g，其中，脲溶液的添加量为氢氧化铝质量的1/30；

5、制备佐剂原液步骤：将混合液在121℃、灭菌30min，通过透析袋透析除氨，至无残留的离子后，分装再次121℃、灭菌30min获得氢氧化铝原液。

从实施例1-4的第一份样品在不同条件的处理结果，及第二份样品的处理结果可见，即图1-24的结果对比可知：

1)加脲后灭菌没有造成佐剂的聚沉和大颗粒生成，并且能将佐剂的粒径稳定在一定范围，即500nm-5μm。

2)加脲后经历反复多次灭菌，佐剂的结构、pH等理化性质趋于稳定状态。

3)适当增加脲的量，使pH在一定程度上提高，佐剂的粒径没有随着脲分解产物的增加发生不可逆的骤变，没有引起团聚或者晶体性质改变，能够用于不同抗原的制备，也说明在121℃环境下，脲水解的产物可以和氢氧化铝佐剂反应。

综上所述，本申请制备的佐剂悬液可经脲溶液处理进一步稳定其理化性质。在较宽的pH(5.5-7.5)范围，较宽的粒径范围(500nm-5μm)内作为佐剂吸附不同种类的抗原，适应抗原的多样性。

以百日咳效价实验为例，选用本申请实施例1-4制备第一份①样品，和第二份②样品制备佐剂、同时，选取法国InvivoGen品牌铝佐剂(商品化佐剂)、专利授权公告号CN104367998工艺制备的佐剂(专利佐剂)，三个佐剂对同一百日咳类毒素吸附制备成原液后，免疫小鼠，做对比试验。

具体步骤如下：三种佐剂分别对同一百日咳类毒素吸附制备成原液后，免疫3个稀释度的百日咳效力标准品和供试品(8x、40x、200x)，选取体重10-12g的NIH小鼠，雌雄各半，每个稀释度免疫20只，腹腔注射0.5ml。于攻击小鼠免疫后21天，每只小鼠脑腔攻击0.03ml菌液(含菌80000个)。攻击后观察14天，逐日观察动物并记录死亡数，至14天有麻痹，头部肿胀，弓背及明显耸毛的动物也按死亡计算，按质反应平行线法计算供试品效价，每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU。小鼠效价结果见表1。

从表1可见，本专利制备的抗原的效价明显高于另外两个佐剂制备抗原的效价。

表1各佐剂的制备抗原的效价

对表1中制备抗原进行特异性毒性实验，具体步骤如下：依药典要求，做小鼠组胺致敏实验，于免疫注射后4天每只小鼠腹腔注射0.5ml二磷酸组胺(4mg/ml),30分钟后分别测小鼠肛温。若小鼠死亡说明免疫试液毒性较大，此只统计小鼠死亡情况做小鼠组胺致敏毒性的对比。特异性毒性试验结果对比见下表2。

从表2可见，本专利制备的佐剂，其在增强抗原效价的同时也削弱了抗原的毒性，具有与抗原吸附力强，抗原释放缓慢的优点。

表2各佐剂的制备抗原的毒性试验结果

对表1制备的抗原原液根据《欧洲药典》的要求做理化性质检验，结果见表3。

表3对表1制备的抗原原液做理化性质检验结果

从表3可见，本申请制备佐剂其主要理化性质接近于欧洲商品化佐剂。