一种海水罗塞略莫拉氏菌、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种海水罗塞略莫拉氏菌、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着水产养殖模式的变化，在高密度集约化养殖过程中，养殖周期的缩短和色源的减少使得人工养殖的水产动物缺乏健康的色泽，导致了其商业价值大打折扣。因此，如何改善水产养殖动物的体色受到国内外水产研究工作者的关注。

在水产动物的生长过程中，自身不能进行色素合成，需要通过食物摄取类胡萝卜素，进而通过色素沉淀和转化合成自身所需的色素种类，水产动物的不同体色主要是由不同的类胡萝卜素和类胡萝卜素蛋白复合物产生的。因此，类胡萝卜素是水产动物体色的主要来源。在现代化集约养殖条件下，水产动物摄食富含类胡萝卜素天然饵料的机会越来越少，而配合饲料中本身类胡萝卜素含量较低，在饲料中添加含有类胡萝卜素的增色剂是水产养殖中最为普遍的人工增色方法。

目前，作为水产养殖饲料添加的增色剂主要分为两大类：人工提取色素和天然原料。人工提取色素主要是指从动植物加工废弃物、藻类(雨生红球藻)及微生物(海洋红酵母)等生物材料中提取的类胡萝卜素等色素。虽然人工提取色素比天然原料更直接的形成增色效果，但在鱼体沉淀的效果要比天然原料低，且类胡萝卜素是一种不太稳定的营养元素，容易氧化，导致人工提取的类胡萝卜素储存条件比较苛刻。因此，水产动物摄入含有类胡萝卜素的天然原料更为方便。

富含类胡萝卜素的天然增色剂原料主要是植物和微生物，由于植物生长周期较长使植物源天然增色剂在大规模应用中受限。与植物源增色剂相比，微生物源增色剂易于大规模快速培养，且一些具有合成类胡萝卜素能力的微生物亦可提高水产动物的健康水平，可同时作为增色剂和益生菌使用。因此，采用益生菌作为水产养殖动物的天然增色剂有望成为未来的主要发展方向之一，具有更广阔的应用前景。

基于以上研究，发明人认为目前本领域的技术人员需解决的技术问题为：如何找到一种具备合成类胡萝卜素能力的益生菌，此益生菌可直接作为复合菌剂的主要活性成分，提高水产动物色素水平，改善养殖动物体色，且可促进水产动物的生长，提高其免疫水平。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种海水罗塞略莫拉氏菌、菌剂及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明提供了以下技术方案：

一株海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)，被命名为BAXE-2203；其筛选自山东省滨州市无棣县高盐养虾池塘，于2023年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27508。

一种复合菌剂，主要成分包括上述所述的海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203。

优选的，复合菌剂中海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203浓度为1～9×10

优选的，复合菌剂还包括胶红酵母(Rhodotorula mucilaginsoa)RMXS-1805和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601。

优选的，复合菌剂是由海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203、胶红酵母RMXS-1805和枯草芽孢杆菌BSXE-1601以6～8:1～2:1～2的细菌数量比例混合成发酵菌剂发酵而成。

所述的胶红酵母RMXS-1805和枯草芽孢杆菌BSXE-1601为我实验室筛选出的菌株，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，胶红酵母RMXS-1805保藏号为CGMCC No.25049，保藏时间为2022年06月10日，枯草芽孢杆菌BSXE-1601保藏号为CGMCC No.15949，保藏时间为2018年06月19日。

上述两种菌株均可促进水产养殖动物的生长，提高水产养殖动物的存活率和免疫水平，其中，胶红酵母RMXS-1805可产生虾青素，并且添加到饲料中可提高水产动物的虾青素水平；枯草芽孢杆菌BSXE-1601抑菌谱广，可抑制养殖环境中致病弧菌生长；两种菌株配合海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203使用效果明显优于单菌株，三种菌株间具有协同作用。

一种如上述所述的复合菌剂在水产动物养殖中的应用。

优选的，所述复合菌剂的添加量为饲料重量的0.1％-0.5％。

优选的，所述复合菌剂用于提高养殖动物的虾青素水平，改善养殖动物体色。

优选的，所述复合菌剂用于促进养殖动物的生长。

优选的，所述复合菌剂用于提高养殖动物的免疫水平。

一种如上述所述的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和枯草芽孢杆菌BSXE-1601菌液制备

分别取海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和枯草芽孢杆菌BSXE-1601菌种于2216E固体平板上进行划线，并分别置于30℃和28℃条件下，活化24h，然后挑取单菌落分别接种到2216E液体培养基中进行摇瓶培养，于30℃、160～180r/min培养24h得到种子液；将种子液按体积比为2％的接种量分别接种到装有液体发酵培养基A的发酵罐中进行扩大培养，于28～30℃,搅拌速度160～180r/min，通气量为2～4V/V.min，培养36～48h，得到海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和枯草芽孢杆菌BSXE-1601的菌液。此时，海水罗塞略莫拉氏菌和枯草芽孢杆菌BSXE-1601浓度分别高于1.0×10

所述液体发酵培养基A的配方如下：蛋白胨10～15g，玉米浆10～20g，葡萄糖10～15g，KH

所述2216E液体培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，陈海水1000mL，将pH调至7.5～8.0，于121℃,101KPa灭菌30min后使用。

所述2216E固体培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，陈海水1000mL，pH为7.6，将配制好的培养基121℃,101KPa灭菌30min后使用。

(2)胶红酵母RMXS-1805菌液制备

取胶红酵母RMXS-1805菌种通过平板划线接种到YPD固体培养基上，26℃培养24h，挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，26℃,200r/min条件下培养48h得到种子液；将种子液按体积比为2％的接种量接种到装有液体发酵培养基B的发酵罐中进行扩大培养，于26～28℃,搅拌速度180～200r/min，通气量为4V/V.min，培养36～48h，得到胶红酵母RMXS-1805菌液。此时，胶红酵母RMXS-1805浓度高于1.0×10

所述液体发酵培养基B配方如下：葡萄糖30～40g，玉米粉30～40g，牛肉膏2～5g，NH

所述YPD液体培养基的配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5，121℃,101KPa灭菌30min后使用。

所述YPD固体培养基的配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂20g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5，121℃,101KPa灭菌30min后使用。

(3)复合菌剂的制备

首先，将麦麸，玉米粉，花生粕、蛋白胨和酵母粉粉碎，按照重量份数称取各组分制备固体发酵培养基：麦麸40～50份，玉米粉10～15份，花生粕10～20份，蛋白胨5～10份，酵母粉1～5份，混合均匀后加水混匀，保持固体发酵培养基的含水量55％～60％。使用前在121℃条件下高压灭菌20min。

将得到的3种菌的菌液按照海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203：胶红酵母RMXS-1805：枯草芽孢杆菌BSXE-1601＝6～8:1～2:1～2细菌数量比例混合制成混合菌液，采用加压法(按照体积比为10％的接种量)将混合菌液喷入固体培养基上，边喷洒边混匀，于30～35℃,发酵培养48～72h，培养结束后，使用烘干机烘干，烘干温度为50～55℃。烘干后，采用网目0.9mm的锤片式粉碎机进行粉碎，然后再用双螺旋混合机混合均匀，即得复合菌制剂。

本发明实施例提供的一种海水罗塞略莫拉氏菌、菌剂及其制备方法和应用，具有以下有益效果：

1本发明从高盐海水养虾池塘中成功分离出一株海水罗塞略莫拉氏菌；

2.该复合菌剂可作为生物增色剂添加到水产养殖动物的饲料中，可显著提高养殖动物的虾青素水平，改善养殖动物体色；

3.该复合菌剂还可以促进养殖动物的生长，提高其免疫水平。

附图说明

图1为本发明分离出的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203；

图2为海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203的系统发育树分析；

图3为海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203在不同温度下的生长情况；

图4为海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203在不同pH下的生长情况；

图5为海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203在不同转速下的生长情况；

图6为投喂不同浓度的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203对凡纳滨对虾酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性的影响；

图7为投喂不同浓度的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203对凡纳滨对虾Rho和Ran mRNA表达量的影响；

图8为投喂不同浓度的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203对凡纳滨对虾虾青素含量的影响；

图9为不同比例的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginsoa)RMXS-1805和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSX E-1601发酵而成的复合菌剂对凡纳滨对虾虾青素含量的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下，所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一、本发明的设计原理

通过研究发现，海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)具有产生类胡萝卜素的能力，其能够从海水、底泥以及水产动物的胃肠道中分离，这类从水产动物的肠道和生活环境分离的菌株可以很好的定殖在宿主体内，产生的类胡萝卜素可以被宿主吸收转化为自身色素。此外，海水罗塞略莫拉氏菌还可以在宿主体内分泌胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶来合成维生素、视黄醇和脂肪酸等生长因子；

因此，将海水罗塞略莫拉氏菌作为生物增色剂添加到水产养殖动物的饲料中，能显著提高水产养殖动物的虾青素水平，改善养殖动物体色。同时，能够提高养殖动物的存活率和免疫水平，促进养殖动物的生长。

二、下面结合附图1-9，以及具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1：菌株的分离和筛选

在山东省滨州市无棣县高盐养虾池塘采集底泥样品，取10g样品放入90mL无菌海水中，摇床充分振荡混匀，静置后取上清液10mL，65℃加热20min得到热稳定孢子；取1mL水浴后的上清液接种至含有100mL富集培养基中，于30℃,160r/min连续振荡一周，得到初始富集菌液，根据1:10的接种比例，将初始富集菌液接种至100mL富集培养基继续培养一周，如此反复驯化培养6个周期；取100μL最后一次富集菌液，梯度稀释后涂布于分离平板培养基上，30℃恒温培养2～3天，挑取橙色菌落进行平板划线纯化，筛选出海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203，如图1所示。

实施例2：菌株的鉴定

16S rDNA基因鉴定：提取海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203的DNA，采用PCR方法扩增16S rDNA，扩增引物为SEQ ID.NO.1与SEQ ID.NO.2所示，扩增体系及程序见附表1。PCR扩增产物进行DNA测序，其基因序列如SEQ ID.NO.3所示。

附表1 PCR扩增体系和程序

将获得的序列与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对分析，选取亲缘关系相近的菌种，构建系统发育树，最终确定该菌株为海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomoreaaquimaris)，如图2所示。

实施例3：菌株的生理生化特性测定

菌株的形态学观察和生理生化特性检测参考常见细菌系统鉴定手册。该菌株的理化性质参数见附表2。菌株革兰氏染色阳性，芽孢染色阳性，淀粉水解酶阳性，接触酶阳性，V-P试验阳性，溶血试验显示菌落周围无溶血现象。

附表2海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203的理化指标

实施例4：海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203生长条件优化

1.取100μL海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203菌悬液接种于2216E液体培养基，分别置于26℃、28℃、30℃、32℃和34℃条件下培养48h测定其生物量，如图3所示。

2.取100μL海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203菌悬液分别接种于pH值为6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的2216E培养基中，置于30℃条件下培养48h测定其生物量，如图4所示。

3.取100μL海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203菌悬液，接种于2216E培养基中，在转速为70r/min、100r/min、130r/min、160r/min和190r/min的条件下培养48h，分别测定其生物量，如图5所示。

结果表明：海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203在30℃,pH8.0，转速160r/min条件下生长最佳。

实施例5：海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203菌体类胡萝卜素含量测定

将纯化后的海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203培养至对数期，离心收集菌体细胞。在冷冻干燥机中处理2天，研磨成均匀粉末，制成干菌体细胞，利用丙酮法提取色素，紫外分光光度计在475nm处测定吸光值OD

类胡萝卜素含量(μg/g)＝OD

OD

D：样品测定时稀释倍数

V：提取所用的丙酮溶液的总体积

W：菌体干重(g)

0.16：类胡萝卜素的摩尔消光系数

结果显示，海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203干菌体细胞类胡萝卜素含量可达214.27μg/g。

实施例6：投喂海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203对凡纳滨对虾的生长、免疫、虾青素水平和体色的影响

试验地点选在中国海洋大学水产养殖基地，设置6个处理组(5个试验组和1个对照组)，试验组为投喂添加1×10

测定对虾的免疫酶活性，以南京建成生物工程研究所生产的相关试剂盒进行具体测定。使用TRIzol试剂从凡纳滨对虾组织中提取总RNA。设计Rho和Ran基因的特异性引物，如附表4所示。荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR。反应体系和程序见附表3。β-actin作为内参基因，使用2-

附表3实时荧光定量PCR反应体系和程序

附表4 Rho和Ran mRNA荧光定量PCR的引物序列

与对照组相比，所有试验组的对虾存活率和饲料效率均显著提高。其中，BB、BC和RM处理组的凡纳滨对虾的末体重及特定生长率显著高于对照组。如附表5所示，饲料中添加适宜浓度的海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和胶红酵母RMXS-1805对凡纳滨对虾的生长具有明显的促进效果。

附表5投喂不同浓度的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203对凡纳滨对虾生长的影响

如附图6所示，BA、BB和BC组酚氧化酶活性显著高于对照组；除BD组外，其他各处理组超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组。

如附图7所示，所有处理组的Rho mRNA表达量均显著高于对照组，其中BB组最高。从Ran mRNA表达量可以看出，BB和RM处理组显著高于对照组，其他处理组与对照组相比无显著差异。

结果表明，饲料中添加适宜浓度的海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203对凡纳滨对虾的免疫酶活性和免疫基因表达具有促进作用，可提高对虾的免疫水平。

附表6投喂不同浓度的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203对凡纳滨对虾体色值的影响

如附图8所示，饲料中单独添加适宜浓度的海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和胶红酵母RMXS-1805均可提高对虾的虾青素水平。

如附表6所示，海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和胶红酵母RMXS-1805的添加提高了凡纳滨对虾的体色值，两株菌均可改善凡纳滨对虾体色。

实施例7：发酵菌剂比例优化

将海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203、胶红酵母RMXS-1805和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601，按照3×10

结果表明，海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203、胶红酵母RMXS-1805和枯草芽孢杆菌BSXE-1601不同比例的发酵菌剂制成的复合菌剂均可促进对虾的生长，提高凡纳滨对虾的存活率、特定生长率和饲料效率。其中，发酵菌剂比例为7:2:1时对凡纳滨对虾的促生长效果最佳。

附表7不同比例的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginsoa)RMXS-1805和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RMXS-1805发酵而成的复合菌剂对凡纳滨对虾的生长的影响

附表8不同比例的海水罗塞略莫拉氏菌(Rossellomorea aquimaris)BAXE-2203、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginsoa)RMXS-1805和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RMXS-1805发酵而成的复合菌剂对凡纳滨对虾体色值的影响

如附图9和附表8所示，不同比例的发酵菌剂制成的复合菌剂均可提高凡纳滨对虾的虾青素含量和体色值，且三株菌的混合对凡纳滨对虾虾青素水平的提高和体色的改善效果增强，具有协同作用。

实施例8：复合菌剂的制备方法

本实施例的复合菌剂的制备方法如下步骤：

(1)海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和枯草芽孢杆菌BSXE-1601菌液制备

分别取海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和枯草芽孢杆菌BSXE-1601菌种于2216E固体平板上进行划线，并分别置于30℃和28℃条件下，活化24h，然后挑取单菌落分别接种到2216E液体培养基中进行摇瓶培养，于30℃、160～180r/min培养24h得到种子液；将种子液按体积比为2％的接种量分别接种到装有液体发酵培养基A的发酵罐中进行扩大培养，于28～30℃,搅拌速度160～180r/min，通气量为2～4V/V.min，培养36～48h，得到海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203和枯草芽孢杆菌BSXE-1601的菌液。此时，海水罗塞略莫拉氏菌和枯草芽孢杆菌BSXE-1601浓度均高于1.0×10

所述液体发酵培养基A的配方如下：蛋白胨10～15g，玉米浆10～20g，葡萄糖10～15g，KH

所述2216E液体培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，陈海水1000mL，将pH调至7.5～8.0，于121℃,101KPa灭菌30min后使用。

所述2216E固体培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，陈海水1000mL，pH为7.6，将配制好的培养基121℃,101KPa灭菌30min后使用。

(2)胶红酵母RMXS-1805菌液制备

取胶红酵母RMXS-1805菌种通过平板划线接种到YPD固体培养基上，26℃培养24h，挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，26℃,200r/min条件下培养48h得到种子液；将种子液按体积比为2％的接种量接种到装有液体发酵培养基B的发酵罐中进行扩大培养，于26～28℃,搅拌速度180～200r/min，通气量为4V/V.min，培养36～48h，得到胶红酵母RMXS-1805菌液。此时，胶红酵母RMXS-1805浓度高于1.0×10

所述液体发酵培养基B配方如下：葡萄糖30～40g，玉米粉30～40g，牛肉膏2～5g，NH

所述YPD液体培养基的配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5，121℃,101KPa灭菌30min后使用。

所述YPD固体培养基的配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂20g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5，121℃,101KPa灭菌30min后使用。

(3)复合菌剂的制备

首先，将麦麸，玉米粉，花生粕、蛋白胨和酵母粉粉碎，按照重量份数称取各组分制备固体发酵培养基：麦麸40～50份，玉米粉10～15份，花生粕10～20份，蛋白胨5～10份，酵母粉1～5份，混合均匀后加水混匀，保持固体发酵培养基的含水量55％～60％。使用前在121℃条件下高压灭菌20min。

将得到的3种菌的菌液按照海水罗塞略莫拉氏菌BAXE-2203：胶红酵母RMXS-1805：枯草芽孢杆菌BSXE-1601＝6～8:1～2:1～2细菌数量比例混合制成混合菌液，采用加压法(按照体积比为10％的接种量)将混合菌液喷入固体培养基上，边喷洒边混匀，于30～35℃,发酵培养48～72h，培养结束后，使用烘干机烘干，烘干温度为50～55℃。烘干后，采用网目0.9mm的锤片式粉碎机进行粉碎，然后再用双螺旋混合机混合均匀，即得复合菌制剂。

实施例9：复合菌剂在凡纳滨对虾养殖中的应用

试验设置试验组和对照组，试验组按照饲料重量0.1％，0.3％和0.5％将实施例8得到的复合菌剂添加到基础饲料中投喂对虾，对照组投喂基础饲料，养殖周期为42天，养殖期间养殖条件均保持一致。养殖结束后，计算对虾的特定生长率、存活率和饲料效率，测定对虾免疫水平，测定虾壳的虾青素含量。取对虾煮熟后利用色差仪测定体色值。

试验结果

附表9添加不同剂量的复合菌剂对凡纳滨对虾生长性能的影响

如附表9所示，复合菌剂的添加提高了凡纳滨对虾的生长性能，除存活率外，凡纳滨对虾的各项生长指标随着添加剂量的增加而增加。

附表10添加不同剂量的复合菌剂对凡纳滨对虾免疫指标的影响

如附表10所示，复合菌剂的添加提高了凡纳滨对虾的免疫指标，凡纳滨对虾的各项免疫指标随着添加剂量的增加而增加。

附表11添加不同剂量复合菌剂的对凡纳滨对虾虾青素含量和体色值的影响

如附表11所示，复合菌剂的添加使凡纳滨对虾的虾青素含量和体色值均显著升高。

试验结果表明，与对照组相比，复合菌剂添加试验组凡纳滨对虾的虾青素水平和体色值显著提高，同时促进了凡纳滨对虾的生长和免疫，证明复合菌剂作为生物增色剂具有显著效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。