一种岩白菜属植物活性成分的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，具体地涉及一种岩白菜属植物活性成分的制备方法及应用。

背景技术

岩七为岩白菜属植物，是一种著名的药用植物，被用于治疗不同的疾病，如糖尿病、腹泻、呕吐、咳嗽、发烧、伤口愈合、肺部疾病和癌症等。其中，3-O-Galloylepicatechin和3-O-galloylcatechin这两种化合物是从岩七甲醇提取物中分离得到的，它们对大鼠肠道α-糖苷酶和猪胰腺α-淀粉酶活性的抑制具有较强的剂量依赖性。岩七的药物作用与其大量的有效成分有关，可采用硅胶凝胶胶LH-20和高效液相色谱法对其有效成分进行分离。然而，其结构的相似性及高极性，使得从岩七的根茎中分离各种组分仍是一个很大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提出设计一种岩白菜属植物活性成分的制备方法，采用高效的一步内循环逆流色谱法制备、分离和纯化岩七中具有相似分配系数的化合物。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种岩白菜属植物活性成分的制备方法，包括：

步骤1、粗提物制备：取岩七根茎，采用甲醇提取，将提取液合并、浓缩，得岩七的甲醇粗提物；

步骤2、双相溶剂体系的选择：取甲醇粗提物样品放入容器中，加入平衡后的双相溶剂，反复震荡，使样品完全分布在两相中，静置分为两层，每相加入甲醇稀释；通过将下相-固定相A

步骤3、溶剂系统和样品溶液制备

HSCCC分离准备：在分液漏斗中加入含TBME-正丁醇-乙腈-水的双相溶剂体系并对其进行剧烈震荡，静置至成两相平衡状态，上下相分别作为固定相和流动相；

样品溶液准备过程：将岩七提取物加入容器中，分别加入TMBE-正丁醇-乙腈-水溶剂体系的上相和下相，使样品完全溶解；作为优选，加入的岩七提取物与容器体积比为1：(10-90)。

步骤4、高速逆流色谱分离

一维分离：采用六通阀，将六通阀一放置在溶剂瓶和泵之间，以方便在内循环和收集之间切换，并将六通阀二连接到六通阀一和检测器之间。本发明只用六通阀一来控制内循环；

内循环分离：关闭六通阀收集模式以进入内循环逆流色谱法CCC分离过程；关闭六通阀一将洗脱液泵回柱，形成循环，在一个周期的第一个峰之后与另一个峰的末端峰重叠，将循环模式转换为正常洗脱法，采用逐次从头到尾的洗脱法避免峰顶重叠，以获得化合物。

进一步的，步骤1中，所述岩七根茎，采用甲醇提取三次，将提取液合并，在减压和45℃条件浓缩，得到岩七的甲醇粗提物。

进一步的，步骤3中，所述TBME-正丁醇-乙腈-水的体积比为(1-5)：(1-5)：(0.5-3)：(2-10)，例如：所述体积比为2：2：1：5或3：1：1：5或1：3：1：5。

进一步的，步骤4中，一维分离：以30mL/min首尾洗脱模式在CCC中泵入上相(固定相)，在25℃条件下将CCC仪器转速调至800转/分钟，以2.0mL/min的速度泵入下相(流动相)直至平衡，从而获得适当的固定相保留值(S

进一步的，所述纯化物包括槲皮素-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、岩白菜素、山奈酚和棕榈酸。

进一步的，样品进样后，通过六通阀一切换至循环模式，当特定目标峰达到分离则切换至正常模式，进行收集，收集完毕后切换至循环模式，进行其他成分内循环分离，重复上述步骤，完成化合物分离；所述化合物山奈酚和棕榈酸在第一次循环中洗脱得到，化合物岩白菜素在第二次循环中洗脱得到，化合物槲皮素-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷在第四次循环中洗脱得到。

进一步的，所述制备方法采用内循环CCC系统，所述内循环CCC系统包括六通阀一、六通阀二、泵、溶剂瓶、进样器、逆流分离柱和检测器；所述六通阀一连接在溶剂瓶和泵之间，以方便在内循环和收集之间切换，所述六通阀二连接在六通阀一和检测器之间；所述泵与进样器连接，进样器与逆流分离柱连接，逆流分离柱与检测器连接，检测器与六通阀二连接，六通阀二与收集圈连接，六通阀一与馏出液管连接；关闭六通阀一将洗脱液泵回柱，形成循环

所述岩白菜属植物活性成分的制备方法所提取的化合物在医药领域中的应用。

本发明的技术效果：

与现有技术相比，本发明建立了一种有效的一步内循环CCC方法，可从巴基斯坦的岩七根茎中分离化合物。采用优化的双相溶剂体系(TBME/正丁醇/乙腈/水(2:2:1:5，v/v)，成功分离了槲皮素-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、岩白菜素、山奈酚和棕榈酸5个化合物。所建立的一步内循环CCC方法适用于有相似K

附图说明

图1为本发明岩七甲醇粗提物中分离化合物的化学结构图；

图2为本发明HSCCC分离模式示意图，其中，图2(A)为正常洗脱模式，图2(B)为内循环模式；

图3为本发明HSCCC内循环模式下化合物分离的色谱图；

图4为本发明岩七甲醇提取物的HPLC图谱。

图中，11、六通阀一；12、六通阀二；13、溶剂瓶；14、泵；15、检测器；16、进样器；17、逆流分离柱；18、馏出液管；19、收集圈。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：

本实施例涉及一种岩白菜属植物活性成分的制备方法，从岩七根茎中提取化合物，其中，本实施例所述岩七产自巴基斯坦。

1.1试剂和材料

分析级甲醇、叔丁基甲基醚(TBME)、正丁醇和乙腈用于提取和HSCCC分离，HPLC级乙腈用于HPLC，采用milli-Q(18MΩ)系统纯水。

1.2设备

使用TBE-300C型HSCCC设备采用三个300毫升多层线圈分离柱和一个20毫升手动样品环进行分离。HSCCC设备配备了一台254nm的8823A-UV监视器、一台TBP-5002恒流量泵、一台3057型便携式记录仪以及一个用于保持恒温(25℃)的低温恒温浴。高效液相色谱设备是沃特斯600系统，包含一个PDA检测器15、一个沃特斯600泵以及一个自动进样器16，对称C18柱(250mm×4.6mm，i.d.5μm，USA)。使用安捷伦1100SL系列MSD Trap进行电喷雾串联质谱分析(ESI/MS)，同时采用了电喷雾离子源MSD捕集器，使用Bruker Avance DRX-400记录核磁共振光谱。所有的化学变化用PPM表示为与内源对照物四甲基硅烷比较的δ值。

1.3所述制备方法包括：

步骤1、粗提物制备：将收集的植物根茎用胶带和蒸馏水冲洗，然后在阴凉处室温干燥；干燥根茎(2.0kg)用90％甲醇提取三次，将提取液合并，在减压和45℃条件浓缩，得到102g岩七的甲醇粗提物；

步骤2、双相溶剂体系的选择：称重后取适量的样品放入10ml离心管中，平衡后的双相溶剂各取1ml放入离心管反复震荡，使样品完全分布在两相中，静置分为两层，每相加入1mL甲醇稀释，用HPLC分析；通过将固定相(下相，A

步骤3、溶剂系统和样品溶液制备

HSCCC分离准备：在分液漏斗中加入含TBME-正丁醇-乙腈-水(2:2:1:5，v/v)的双相溶剂体系并对其进行剧烈震荡，静置15分钟至成两相平衡状态，上下相分别作为固定相和流动相；

样品溶液准备过程：将280mg岩七提取物加入10ml离心管中，分别加入TMBE-正丁醇-乙腈-水(2:2:1:5，v/v)溶剂体系的5ml上相和5ml下相，使样品完全溶解；

步骤4、高速逆流色谱分离

一维分离

采用能够实现内循环的六通阀，将六通阀一11放置在溶剂瓶13和泵14之间，以方便在内循环和收集之间切换，并将六通阀二12(由于不需要在外部柱中在线存储，因此关闭)连接到六通阀一11和检测器15之间(图2A)；泵14与进样器16连接，进样器16与逆流分离柱17连接，逆流分离柱17与检测器15连接，检测器15与六通阀二12连接，六通阀二12与收集圈19连接，六通阀一11与馏出液管18连接。本发明只用六通阀一11来控制内循环。

以30mL/min首尾洗脱模式在CCC中泵入上相(固定相)，在25℃条件下将CCC仪器转速调至800转/分钟，以2.0mL/min的速度泵入下相(流动相)直至平衡，从而获得适当的固定相保留值(S

内循环分离

关闭六通阀收集模式以进入内循环逆流色谱法CCC分离过程。关闭六通阀一11将洗脱液泵回柱，形成循环(如图2B)，在一个周期的第一个峰之后与另一个峰的末端峰重叠，将循环模式转换为正常洗脱法，采用逐次从头到尾的洗脱法避免峰顶重叠，以获得纯化物；

步骤5、HPLC分析及结构鉴定

采用Water 600系统进行色谱分离，在柱温为25℃流速为1.0mL/min的条件下，用由水(A)和乙腈(B)组成的流动相以以下梯度洗脱柱：0-7min，90-70％A；7-12min，70-65％A；12-13min，65-90％A，13-20min，90％A。得到190～400nm处的光谱图，和254nm处的色谱图。

采用Agilent 6520 Q-TOF仪器(Agilent，Santa Clara，CA，USA)进行ESI-MS分析，以CD

1.4结果与讨论

1.4.1双相溶剂体系的选择

使用HSCCC分离时选择合适的双相溶剂体系非常重要，合适的溶剂应具有合适的分配系数和较好的样品溶解度。本实施例考察了几种混合溶剂体系，其中包括乙酸乙酯/正丁醇/水(4:1:5，v/v)，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(0.5:4.5:0.5:4.5，v/v)，氯仿/甲醇/水(5:2:3，v/v)与TBME/正丁醇/乙腈/水(2:2:1:5，v/v)(表1)。如果使用乙酸乙酯/正丁醇/水(4:1:5，v/v)和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(0.5:4.5:0.5:4.5，v/v)，则这些化合物主要分布在上相，K

TBME/正丁醇/乙腈/水溶剂体系用于分离中等至高极性的化合物，在溶剂体系中由于增加乙腈与TBME的比例会导致三相形成，因此电位比受到限制。当使用TBME/正丁醇/乙腈/水(1:3:1:5，v/v)和(2:3:0:5，v/v)溶剂体系时，峰洗脱开始很晚，有的峰没有得到很好的洗脱。使用TBME/正丁醇/乙腈/水(3:1:1:5，v/v)溶剂体系时化合物1和2的K

表1化合物的在逆流色谱溶剂系统中的分配系数

1.4.2化学成分分离

在常规HSCCC中采用TBME/正丁醇/乙腈/水溶剂体系(2:2:1:5，v/v)，样品负载为280mg，化合物3、4和5在第一步分离时可分离，但分离率较差(图3)，本实验将化合物进行循环，得到了较好的分离率。在第一次循环中，化合物4(37mg)和5(43mg)有合适的K

1.4.3内循环逆流色谱程序

色谱分离的基本方程是分离时的分辨率、理论板数和柱长之间的关系。

(R

R表示分辨率，N表示理论总板数，L表示柱长。CCC柱越长表示理论板数越大、拥有较好的分离率。与HPLC相比HSCCC的理论板数较少，因此CCC分离的价值较低，然而通过对经典HSCCC方法中的内循环进行微调，可以提高其价值，这使得在植物化学分离中分离K

内循环CCC模式的一个循环的最后一个峰与第二个循环的第一个峰重叠，化合物在第2次循环开始重叠，纯化合物被洗脱。在第一次循环中连续洗脱两个化合物，在第二次和第三次循环中连续洗脱一个化合物，有助于分离纯化合物。与传统的长时间洗脱工艺相比，循环模式在溶剂用量和时间消耗方面具有优势，它提高了理论板数N、提高了峰值分辨率、设置简单、易于操作。

1.4.4结构鉴定

槲皮素-鼠李糖苷(1)：ESI-MS(正离子模式)m/z 773.0314[M+H]

槲皮素-3-O-鼠李糖苷(2)：ESI-MS(负离子模式)m/z 608.0820[M-H]

岩白菜素(3)：ESI-MS(正离子模式)m/z 773.0314[M+H]

山奈酚(4)：ESI-MS(负离子模式)m/z 285.2310[M-H]

棕榈酸(5)：ESI-MS(正离子模式)m/z 256.4321[M+H]

本发明建立了一种有效的一步内循环CCC方法，可从巴基斯坦的岩七根茎中分离化合物。采用优化的双相溶剂体系(TBME/正丁醇/乙腈/水(2:2:1:5，v/v)，成功分离了槲皮素-鼠李糖苷(1)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(2)、岩白菜素(3)、山奈酚(4)和棕榈酸(5)五个化合物，纯度均>98％(如图1所示)。所建立的一步内循环CCC方法适用于有相似K

上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。