一种微生物菌V66及其在植物促生、促开花中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微生物菌V66及其在植物促生、促开花中的应用。

背景技术

植物的开花过程是植物生长发育过程中的重要阶段，也是植物繁殖的关键步骤。然而，一些内部和外部因素，如温度、光照、营养等，都会影响植物的开花过程。因此，通过利用微生物技术来促进植物的开花，已经成为一种新兴的植物生长调节技术。微生物菌株可以在植物根系中形成共生关系，为植物提供营养物质和生长调节物质，从而促进植物生长和开花。一些微生物菌株已经被证明可以促进植物的开花和提高产量。此外，与传统化学肥料相比，微生物菌肥具有环保、可持续等优点，因此受到越来越多的关注和研究。

有研究指出，脯氨酸的代谢可能作为一种信号参与植物开花过程的调节，当烟草中的P5CS1(脯氨酸合成的关键酶基因)过表达时，能够促进植株开花；而在反义P5CS1的拟南芥中，花芽发育缓慢；另外，外源脯氨酸处理蛾豆能改变花期、开花时间和花的数量。

然而，当前主要依靠植物自身产生相关的脯氨酸，而植物自产脯氨酸量有限，其不能满足植物生长中的调节作用。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种微生物菌V66，该菌株能够促进植物生长或调节植物的开花周期，能有作为生物菌肥或植物生长调节剂。

为实现上述目的之一，本发明提供以下技术方案：

提供一种微生物菌V66，菌株V66，其分类学名Bacillus safensis，于2023年5月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC 63425，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号；

所述菌株V66属于沙福芽孢杆菌，所述菌株V66具有SEQ ID NO.1所示的16S rRNA序列。

在一些实施方式中，所述菌株V66的菌体形态特性如下：细胞较小，粗短状，表面粗糙，白色不透明，为革兰氏阳性细菌；生长温度范围为20℃～45℃，生长pH值为6.0～10.0。

本发明一种微生物菌V66的有益效果：

本发明的微生物菌V66，其能产生脯氨酸，将菌株V66施加至植物的生长中，菌株V66产生的脯氨酸能有效地促进植物生长或参与植物开花信号的转导，达到促开花的作用，弥补植物自产脯氨酸不足的问题；并且，V66菌是环保、可持续的生物菌剂，克服了施加化肥导致污染环境的问题，其适合于大规模生产应用。

为实现上述目的之二，本发明提供以下技术方案：

提供一种菌种试剂，包括上述的菌株V66。

菌株试剂可以是生物菌肥或植物生长调节剂等，菌株试剂便于便捷使用菌株V66。

还提供上述的微生物菌V66在植物促生中的应用。

菌株V66能产生脯氨酸，其能有效地促进植物生长。

在一些实施方式中，所述植物为水稻或花生。

在一些实施方式中，将所述菌株V66添加至培养物的溶液中，随后将水稻的种子或花生的种子浸泡于含有所述菌株V66培养物的溶液中。

种子浸泡在含有所述菌株V66培养物的溶液中，使得菌株V66培养物的溶液中的脯氨酸能有效地促进种子发芽生长。

在一些实施方式中，将所述菌株V66添加至培养物的溶液中，随后将含有所述菌株V66培养物的溶液喷洒于水稻的种子或花生的种子的表面。

所述菌株V66培养物的溶液喷洒在水稻的种子或花生的种子的表面，使得菌株V66培养物的溶液中的脯氨酸能有效地促进种子发芽生长。

在一些实施方式中，将所述菌株V66稀释为菌液，将所述菌液施加至水稻苗或花生苗中。

菌株V66培养物的溶液中的脯氨酸能有效地促进幼苗生长。

还提供上述的微生物菌V66在植物促开花中的应用。

由于脯氨酸还有作为信号参与调节植物开花过程的作用，因此，菌株V66在植物促开花中的应用。

在一些实施方式中，所述植物为花生。

附图说明

图1为菌株V66于LB固体培养基上培养24小时后菌落形态。

图2为菌株V66对水稻促生的效果图。

图3为菌株V66对花生促生及开花的效果图。

图4为菌株V66代谢组学测定得到的MetaCyc功能通路丰度图。

图5为菌株V66测定产生生长素的效果图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然附图中显示了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“该”旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

应当理解，尽管在本发明可能采用术语“第一”、“第二”、“第三”等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

实施例1

本实施例公开了菌株的筛选

1、菌株分离、纯化、保存

从土壤样品中分离纯化得到菌株V66，分类学名Bacillus safensis，具体分离纯化步骤如下：

其中分离所用培养基为：

LB培养基(1.0L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L；

上述培养基固体加琼脂粉20.0g，121℃高压灭菌30min。培养条件为：温度37℃，时间24～48h。

其中分离操作步骤：

(1)取样：选择适当的取样位置和深度，使用干净的工具(取土器)采集土壤样品。

(2)稀释：将采集的土壤样品进行稀释，以降低土壤中微生物的数量和提高分离单个微生物的可能性。取10g土壤样品放入研钵中，加入90ml无菌水，用研磨棒充分研磨(研钵和研磨棒提前灭菌准备好)，使土壤样品充分粉碎混匀，提高微生物在研磨液中的均匀度。吸取1mL上述研磨液于9mL无菌水中充分混匀后，做浓度梯度稀释，分别取200μL浓度为10

(3)培养：挑取单菌用平板划线法在固体LB培养基上纯化，反复传代培养，直至菌落具有相同的颜色、形状、大小、质地和透明度，得到的菌株V66具有如下菌体形态特性：细胞较小，圆形或椭圆形，表面粗糙，白色不透明，为革兰氏阳性细菌；生长温度范围为20～45℃，生长pH值为6.0～10.0。

(4)保存：通过简单染色(石碳酸复红染色)和显微镜镜检(油镜)，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。将纯化后的菌株用接种环挑取适量保存于保存液(20％的甘油)中，放至-20℃和-80℃冰箱保存备用，最终得到菌株V66。

(5)鉴定：对菌株进行形态鉴定，通过提取DNA，扩增16S rRNA基因，并用琼脂糖凝胶检测，将PCR扩增产物交由广州天一辉远技术有限公司直接进行测序，获得SEQ ID NO.1所示的菌株的16S rRNA序列。将16S rRNA序列输入GenBank进行Blast比对，初步确定本发明的菌株V66在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的菌株V66，与Bacillussafensis模式菌株沙福芽孢杆菌相似性为99.93％。因此将本发明的菌株V66应归属于沙福芽孢杆菌。其中，16S rDNA基因序列SEQ ID NO.1的测定结果如下：

TGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCAAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAG。

实施例2

菌株V66对水稻促生效果及花生的促花开花

培养菌株V66：从冷冻保存的V66菌株保存液中，取出一小部分，接种到LB固体培养基中活化V66菌株，直到菌株处于生长活跃阶段，将V66菌株接种于LB液体培养液中，制备V66菌株OD

准备水稻、花生种子：分别选择相同品种、相同大小、相同生长状态的水稻、花生种子，用纯净水清洗，并在室温下干燥。用75％的乙醇对水稻、花生的种子表面消毒2min，再用无菌水清洗5～6次，每次2min，消除种子表面微生物在后续播种以及生长过程中对植株造成的影响及误差。最后用无菌水于30℃浸泡子36h来打破休眠，促进种子萌发。

处理种子：将水稻、花生种子分成两组。一组种子作为对照组，另一组种子进行处理。对于处理组，可以将种子浸泡在含有V66菌株培养物的溶液中，也可以在种子表面喷洒V66菌株培养物的液体。对照组则浸泡或喷洒相同量的无菌水。

播种：在适宜的生长条件下，将处理组和对照组的水稻、花生种子分别播种灭菌后的干燥土壤加到盆栽中，保证每盆土壤重量一致。在28℃培养30天，期间依据土壤情况施加相同量的无菌水，每隔3天(种植后的第4、8、12天)实验组对应施加20mL的稀释二十倍的V66菌液，对照组对应施加同质量的无菌水和稀释后LB。

观察和记录：在播种30天后，观察水稻的生长情况。以确定V66菌株是否对水稻有促生作用。在播种30天后，观察花生的生长情况，以确定V66菌株是否对花生有促生、促开花作用。

注意事项：在实验过程中，应控制相关的变量温度、光照、水分等；可以重复实验以获得更加可靠的结果，其中，得到表1和表2的结果。

表1菌株V66盆栽试验对水稻促生测定效果

，

表2菌株V66盆栽试验对花生促生及开花测定效果

由表1可见，菌株V66处理水稻种子和幼苗的V66实验组与无菌液处理水稻种子和幼苗的CK空白组相比，水稻的根长、株高、地上鲜重和茎周长均有了显著的改善，由此可见菌株V66对水稻有较好的促长作用。此外，由图2可见，V66实验组的水稻苗生长情况明显优于CK空白组的水稻苗生长情况。

由表1可见，菌株V66处理花生种子和幼苗的V66实验组与无菌液处理花生种子和幼苗的CK空白组相比，花生的根长、株高、地上鲜重、茎周长和开花朵数均有了显著的改善，由此可见菌株V66对花生有较好的促长作用并且对花生也有较好的促开花作用。由图3可见，V66实验组的花生苗生长情况优于CK空白组的花生苗生长情况。

本申请尽管仅以水稻、花生作为示例说明V66对植物的促生长作用，但不限于菌株V66仅对水稻和花生有促生作用；本申请尽管仅以花生开花作为示例说明V66有促开花的作用，但不限于菌株V66仅对花生有促生作用。

实施例3

菌株V66的脯氨酸表达量及产生长素的定性测定

将实施例1得到的菌株V66进行代谢组学测定，得到图4所示的MetaCyc功能通路丰度图。图4示出V66菌株MetaCyc功能通路注释及富集分析，右侧为MetaCyc一级功能通路，从上至下为生物合成、降解利用同化、解毒、前驱体甲苯和能量的产生、聚糖通路、大分子修饰和代谢簇。左侧为MetaCyc二级通路，生物合成相关二级功能通路丰富度最高，氨基酸生物合成，碳水化合物合成，细胞结构生物合成，辅因子、假体基团电子载体和维生素生物合成、脂肪酸和脂质生物合成、核苷和裸核苷酸生物合成等。由图4示出V66菌株产生次生代谢产物，促进植物氨基酸合成途径。

并且，表3示出了菌株V66对脯氨酸合成途径上表达量

表3

表3示出V66菌株脯氨酸合成途径上表达约为1.03倍，可见V66能表达一定量的脯氨酸，从而促进花生开花。

将实施例1得到的菌株V66用无菌水将处于生长对数期的菌株制备成OD600＝1的菌悬液，将菌悬液接种至King液体培养液中，放到摇床上，温度和转速参数设置为30℃、130rpm，培养2d。

King培养基(1.0L)：Peptone 20.0g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5g、色氨酸0.1g、丙三醇15.0mL，pH 7.2。

接下来，吸取培养好的菌液50μL至陶瓷比色板中，滴加50μL比色液。对照组为50μL的比色液中加50μL空白King液体培养基。在室温和黑暗状态下放置30min，观察比色板中各个菌株溶液的颜色变化。如果颜色变成粉红色，则为阳性反应，表明菌株产生IAA。由图5示出，比色板中左边液体为对照组，右边液体为V66组，可知菌株V66具有产生生长素，促进植物生长的能力。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本申请的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的径长并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

在本申请的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本申请保护范围的限制。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。