一种高辨识度的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高辨识度的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法。

背景技术

多抗霉素（Polyoxin）是金色链霉菌的代谢产物，是广谱抗生素类杀菌剂，具较好的内吸传导作用，主要是干扰病菌细胞壁几丁质的生物合成而导致病菌死亡，能够抑制病菌产孢和病斑扩大。多抗霉素共有14种个组分，不同组分的侧重作用对象不同，主要是一类以a、b组份为主，主要用于防治苹果斑点落叶病，轮纹病，梨黑斑病，葡萄灰霉病，草莓、黄瓜、甜瓜的白粉病，霜霉病，人参黑斑病和烟草赤星病等十多种作物病害。另一类以d、e、f组份为主，主要用于水稻纹枯病的防治。多抗霉素是一种高效、低毒、环境友好的安全生物农药，因此被广泛应用于粮食作物、特用作物、水果和蔬菜等重要病害的防治，在农药防治方面占有重要地位。

管碟法是当前测定抗生素生物效价最常用的方法之一。多抗霉素生物效价测定的指示菌主要为烟草赤星病菌、斑点落叶病菌。由于烟草赤星病菌、斑点落叶病菌属于真菌，菌素呈白色，所以形成的抑菌圈边缘界限不够清晰，不易分辨。

PDA培养基（Potato Dextrose Agar (Medium)）是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，是培养霉菌、酵母菌、蘑菇等真菌最常用的培养基之一，也常用来培养各种植物病菌。

多抗霉素生物效价测定用的是PDA培养基，指示菌主要为斑点落叶病菌和烟草赤星病菌，其菌丝的颜色和PDA培养基颜色较为接近，形成的抑菌圈界限不易分辨，不利于抑菌圈的观察和测量，严重影响着效价测定过程中的准确度。因此，寻求一种颜色和指示菌菌丝颜色形成鲜明对比且不影响指示菌生长的培养基是非常有必要的。

发明内容

为解决现有技术测定多抗霉素生物效价时存在的上述问题，本发明提供一种高辨识度的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法，有效解决抑菌圈清晰度不高、边缘模糊的问题。与传统PDA培养基相比，内含有一定浓度的染料日落黄，本发明的培养基颜色较传统PDA培养基深，在不影响指示菌菌落生长的基础上抑菌圈更加清晰，有效提高了生物测定的准确度，降低了抑菌圈测量的难度，同时节省了测量时间。

本发明采用如下技术方案：一种高辨识度的多抗霉素生物效价测定培养基，由上层培养基和下层培养基组成，其中，上层培养基由以下配方组成：上层培养基由以下配方组成：马铃薯15-25%、葡萄糖1.0%~2.0%、琼脂1.8%~2.0%、染料0.20%~0.30%，余量为纯水，pH6.0~6.3；下层培养基由以下配方组成：琼脂1.5%~2.0%，余量为纯水。

在本发明的优选的实施方案中，染料应是水溶性颜料，且不局限于黄色，能与菌丝形成鲜明的颜色差，使得所得抑菌圈已于辨识的颜色的一种或几种；所述的染料优选为染料日落黄。

本发明还保护所述的多抗霉素生物效价测定培养基的制备方法，按比例称取配方中的各个组分，上层培养基pH为6.0~6.3，下层pH自然，再分别分装得到上层培养基和下层培养基，然后通过灭菌得到。

在本发明的优选的实施方案中，所述的染料日落黄在培养基其他成分配置好后，最后加入并混匀，加热灭菌后充分摇匀后备用。

在本发明的优选的实施方案中，所述的染料日落黄占上层培养基的质量比例最佳为0.25%。

在本发明的优选的实施方案中，所述的灭菌为在113℃~123℃下灭菌15min~30min。

在本发明的优选的实施方案中，所述的多抗霉素生物效价测定培养基的制备方法包括以下步骤：

1）上层培养基的制备：将马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加纯水1000mL煮沸20分钟，用八层纱布过滤，补足水分至1000mL，加入10g葡萄糖，搅拌均匀，放置至室温后，调节其pH在6.0~6.3之间，再加入琼脂20g，加热搅拌直至琼脂溶解完全，再加染料日落黄0.20%~0.30%，分装得上层培养基；

2）下层培养基的制备：琼脂粉1.8%~2.0%，余量为纯水，pH自然，得到下层培养基；

3）将分装好的上、下层培养基在113℃~123℃下灭菌15min~30 min。

在本发明的优选的实施方案中，放置室温后，用NaOH或HCl调节其pH为6.0~6.3。

在本发明的优选的实施方案中，所述的灭菌为在115℃下灭菌20 min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1）本发明的培养基通过添加染料获得上下层培养基，再将上下培养基进行灭菌得到。采用本发明的多抗霉素生物效价测定培养基，与原有的PDA 培养基相比，其抑菌圈边缘更为清晰，辨识度高，易于观察与测量，节省抑菌圈测量时间，大大提高了多抗霉素生物效价测定的准确性。其培养基的澄清度更高，操作步骤更为简单，节省时间。

2）本发明通过添加痕量染料，明显增强了抑菌圈的辨识度，在不增加培养基的成本基础上，简化了测量步骤，节省了测量时间。

3）采用本发明的多抗霉素生物效价测定培养基，培养出的斑点落叶病菌菌落质量更好，产生的抑菌圈更为清晰便于观察与测量，缩短了测量时间，提高了多抗霉素生测效价的准确度。

附图说明

下面结合附图做进一步的说明：

图1为本发明中培养了18h的烟草赤星病菌抑菌圈（染料PDA培养基）；

图2为本发明中培养了18h的烟草赤星病菌抑菌圈（纯PDA培养基）；

图3为本发明中培养了18h的烟草赤星病菌抑菌圈（加染料PDA培养基和纯PDA培养基对比）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。

对比例1

原多抗霉素生物效价测定培养基的制备方法：

1）上层培养基的制备：将马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加纯水1000mL煮沸20分钟，用4～6层纱布过滤，补足水分至1000mL，加入10g葡萄糖，搅拌均匀，用NaOH或HCl调节其pH在6.0~6.3之间，再加入琼脂20g，加热搅拌直至琼脂溶解完全，分装得上层培养基，115℃下灭菌30min备用；

2）下层培养基的制备：琼脂1.8%，纯水加热溶解，115℃下灭菌30 min后备用。

实施例1

本实施例公开了多抗霉素生物效价测定培养基制备的一种具体实施方式，包括如下步骤：

1）上层培养基的制备：将马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加纯水1000mL煮沸20分钟，用八层纱布过滤，补足水分至1000mL，加入10g葡萄糖，搅拌均匀，用NaOH或HCl调节其pH在6.0~6.3之间，再加入琼脂20g，加热搅拌直至琼脂溶解完全，再加染料日落黄0.25%，分装得上层培养基；

3）下层培养基的制备：琼脂粉1.8%，余量为纯水，pH自然，得到下层培养基；

4）将分装好的上、下层培养基在113℃~123℃下灭菌15min~30 min。

将对比例1和实施例1得到的培养基进行比较，结果如表1所示：

表1 对比例1和实施例1得到的培养基对比

可见，采用实施例1得到的生物培养基培养出的烟草赤心病菌菌落形态更加稳定良好，抑菌圈边缘更加清晰，易于观察与测量。此外，采用实施例1与对比例1相比较，指示菌烟草赤星病菌生长时限缩短，有效节省时间。

从图1中可以看到，加染料PDA培养基的抑菌圈边缘较为清晰光滑，辨识度高。

从图2中可以看到，纯PDA培养基的抑菌圈模糊，不清晰。

从图3的对比图中可以看到，培养相同时间，加染料PDA培养基的抑菌圈已经生长良好，边缘清晰光滑，适合测量，但纯PDA培养基边缘非常模糊，不清晰，辨识度低。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。