鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒，属于鸭病学领域。

背景技术

鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)是2019年在我国南方地区发现一种鸭新型腺病毒病。对该病毒基因组进行分析发现，其主要基因编码蛋白均和鸭群中前期发现的鸭1型腺病毒、鸭2型腺病毒和鸭3型腺病毒相关基因的核苷酸和氨基酸同源性均低于80％。遗传进化分析表明，DAdV-4属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，但处于一个独立的遗传进化分支，将其命名为鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中也证实存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染(命名为DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)，测定的DBP基因和鸭4型腺病毒参考株GD-2019株(GenBank登录号MN733730)核苷酸同源性为100％。

目前，在对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如PCR方法和实时荧光定量PCR方法(real time PCR)。实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参(或外参)对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecular Beacon)。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测DAdV-4的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是为了填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测DAdV-4的方法相关研究报道空白，提供一种DAdV-4实时荧光定量PCR检测引物和探针及其应用。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测33.52个拷贝/μL，可用于对临床样本中DAdV-4的分子流行病学调查，为明确DAdV-4的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述引物序列如下：

DAdV-4-T-F：5’-GACGAGGACGATGAAGAAGAAG-3’，

DAdV-4-T-R：5’-GCTGAGCTCCGTAAACGATAG-3’；

所述探针序列DAdV-4-T-P为：5’-AGGTTTCCGTGCCGGGTAAGAAG-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

一种鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物和探针。

所述引物和探针用于鸭4型腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法为：

(1)标准品的构建

根据DAdV-4(DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)基因组特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：D-4-F0：5′-TACATCTACAGCGAAGAGGA-3′和D-4-R0：5′-CGAGGCTTAATCACCATTTCTGT-3′，用于扩增约590bp的基因片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取DAdV-4-FJ001株核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix(+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上/下游引物(D-4-F0和D-4-R0，浓度为10μM)各1μL、提取的核酸模板DNA 1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃50s，54℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用扩增时的引物(D-4-F0和D-4-R0)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-DAdV-4)，其(质粒T-DAdV-4)核苷酸同源性和DAdV-4-FJ001株相关基因序列的核苷酸同源性为100％。

利用微量核酸测定仪测定阳性标准品(T-DAdV-4)的浓度，计算其拷贝数为3.352×10

(2)实时荧光定量PCR反应条件：

以阳性标准品(T-DAdV-4)为模板，筛选不同退火温度(54～64℃)、引物(DAdV-4-T-F、DAdV-4-T-R)浓度(2.5～20μmol/L)和探针(DAdV-4-T-P)浓度(1.25～10μmol/L)下进行实时荧光定量PCR反应，应用矩阵法进行条件优化，筛选出最优条件[循环数阈值(cyclethreshold，Ct值)较小且荧光值△Rn较大时]。

结果判定，观察FAM信号有关阳性荧光信号扩增，有阳性荧光信号即可判定待检样品为DAdV-4感染阳性。

建立的DAdV-4实时荧光定量PCR检测方法优化出的最佳反应体系20μL为：PremixEx Taq

优化出的最佳反应条件为：95℃预变性40s；95℃5s，60℃25s，40个循环。用优化后的反应条件，以3.352×10

以各标准品中质粒含量(C)的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(Ct值)为纵坐标，获得DAdV-4实时荧光定量PCR标准曲线(图2)，所获得标准曲线斜率为-3.525，Y轴截距为36.40，相关系数为1.00，扩增效率为0.92，符合实验预期。

用优化后的反应条件，以3.352×10

本发明采用DAdV-4实时荧光定量PCR检测的引物和探针进行DAdV-4检测，具有以下优点和效果：

1.检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需90min，且一次可以同时进行96个样品检测。

2.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中DAdV-4的Ct值，直接对其感染DAdV-4进行准确定量。

3.灵敏度高：最低可检测33.52个拷贝/μL。

4.特异性强：对鸭群中的常见传染病(如FAdV-4、DAdV-1、DAdV-2、DAdV-3、H9-AIV、DuCV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3)均无反应信号，仅对DAdV-4检测出现荧光信号。

5.重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行DAdV-4检测的组内变异系数为0.65-1.27％，组间变异系数0.78-2.24％，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

附图说明

图1实时荧光定量检测DADV-4的PCR方法的扩增曲线。其中1：3.352×10

图2实时荧光定量检测DADV-4的PCR方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测DADV-4的PCR方法的敏感性检测结果图。其中，1：3.352×10

图4实时荧光定量检测DADV-4的PCR方法的特异性检测结果图。其中1：DAdV-4；Controls：试验对照(如FAdV-4、DAdV-1、DAdV-2、DAdV-3、H9-AIV、DuCV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3)，由于均无荧光信号，肉眼无法区分。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原试验用病原禽4型腺病毒(FAdV-4)、鸭腺病毒1型(DAdV-1)、鸭腺病毒3型(DAdV-3)、鸭腺病毒4型(DAdV-4)、鸭源H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭细小病毒(MDPV)、鸭1型和3型肝炎病毒(DHAV-1、DHAV-3)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

鸭腺病毒2型(DAdV-2)DBP基因在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、引物和探针的设计

本研究经过分析比对，选取不同宿主源腺病毒科成员基因序列特征并明确其差异，针对鸭腺病毒4型(DAdV-4)基因特征来设计引物和探针。

DAdV-4-T-F：5’-GACGAGGACGATGAAGAAGAAG-3’，

DAdV-4-T-R：5’-GCTGAGCTCCGTAAACGATAG-3’；

所述探针序列DAdV-4-T-P为：5’-AGGTTTCCGTGCCGGGTAAGAAG-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

将引物和探针序列进行Blast分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)，均符合试验预期。

3、标准品的构建

根据DAdV-4(DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)基因组特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：D-4-F0：5′-TACATCTACAGCGAAGAGGA-3′和D-4-R0：5′-CGAGGCTTAATCACCATTTCTGT-3′，用于扩增约590bp的基因片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取DAdV-4-FJ001株核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix(+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上/下游引物(D-4-F0和D-4-R0)各1μL、提取的核酸模板DNA 1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃50s，54℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用扩增时的引物(D-4-F0和D-4-R0)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-DAdV-4)，其(质粒T-DAdV-4)核苷酸同源性和取DAdV-4-FJ001株相关基因序列的核苷酸同源性为100％。

利用微量核酸测定仪测定阳性标准品(T-DAdV-4)的浓度，计算其拷贝数为3.352×10

4、实时荧光定量PCR反应条件

以阳性标准品(T-DAdV-4)为模板，筛选不同退火温度(54～64℃)、引物(DAdV-4-T-F、DAdV-4-T-R)浓度(2.5～20μmol/L)和探针(DAdV-4-T-P)浓度(1.25～10μmol/L)下进行实时荧光定量PCR反应，应用矩阵法进行条件优化，筛选出最优条件[循环数阈值(cyclethreshold，Ct值)较小且荧光值△Rn较大时]。

结果判定，观察FAM信号有关阳性荧光信号扩增，有阳性荧光信号即可判定待检样品为DAdV-4感染阳性。

建立的DAdV-4实时荧光定量PCR检测方法优化出的最佳反应体系20μL为：PremixEx Taq

优化出的最佳反应条件为：95℃预变性40s；95℃5s，60℃25s，40个循环。用优化后的反应条件，以3.352×10

以各标准品中质粒含量(C)的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(Ct值)为纵坐标，获得DAdV-4实时荧光定量PCR标准曲线(图2)，所获得标准曲线斜率为-3.525，Y轴截距为36.40，相关系数为1.00，扩增效率为0.92，符合实验预期。

5、敏感性检测

用优化后的反应条件，以3.352×10

6、特异性检测

对鸭群中的常见传染病(如FAdV-4、DAdV-1、DAdV-2、DAdV-3、H9-AIV、DuCV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3)均无反应信号，仅对DAdV-4检测出现荧光信号(图4)。

7、重复性试验

建立的实时荧光定量PCR检测方法进行DAdV-4检测的组内变异系数为0.65-1.27％，组间变异系数0.78-2.24％，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR方法的变异系数测定

8、临床应用

对119份临床送检鸭源病料进行DAdV-4感染的实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应核酸DNA，按照建立实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，见有5份样品阳性扩增信号，表明5份检测样品中存在DAdV-4感染(浓度分别为5.905×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gacgaggacg atgaagaaga ag 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gctgagctcc gtaaacgata g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aggtttccgt gccgggtaag aag 23