基于二代测序技术的胰腺癌检测panel、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于胰腺癌多基因检测技术领域，涉及基于二代测序技术的胰腺癌检测panel、试剂盒及其应用。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌，其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。

应用基因测序来确定患者的靶向治疗方案在胰腺癌中已越来越普遍，但是现有胰腺癌的测序不是集中在特定的基因，就是全外显子组测序，前者特定的基因数量少，覆盖率低，难以做到大面积兼顾；后者基因数量过多，大部分于胰腺癌治疗没有起到指导作用，且成本相对较高。因此，急需一种既兼顾与胰腺癌治疗相关的基因，又不局限于少数的靶向治疗基因的胰腺癌检测方法。

发明内容

为了可以实现对胰腺癌的精准检测，为诊断提供更有效的信息，本发明挑选TCGA数据库、MSKCC-IMPACT数据库等多平台的基因变异数据，基于二代测序技术，利用生物素探针杂交法富集其中685个基因的重要外显子区域与部分内含子区域，并进行高深度测序，从而发现与胰腺癌有明确临床相关性的基因突变、拷贝数变异等事件，并将该多基因筛选列表做成探针。

第一方面，本发明提供了基于二代测序技术的胰腺癌检测panel，所述检测panel包括用于检测胰腺癌预后相关的突变基因、拷贝数变异的基因及发生重排事件的基因。

在某些实施例中，所述基因突变包括以下基因：ABCB1、ABCC2、ABL1、ABL2、ACVR1、ACVR1B、ACVR2A、ADGRA2、AFF1、AGO2、AHNAK、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、AMER1、ANKRD11、APC、APCDD1、AR、ARAF、ARFRP1、ARHGEF12、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID5B、ARMC5、ARRDC3、ASH1L、ASXL1、ASXL2、ASXL3、ATF1、ATM、ATP1A1、ATP2B3、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXIN2、AXL、B2M、BABAM1、BACH1、BAP1、BARD1、BBC3、BCL10、BCL2、BCL2L1、BCL2L11、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BMS1、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTG2、BTK、C8orf34、CACNA1D、CALR、CARD11、CARM1、CASP7、CASP8、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD22、CD274、CD276、CD40、CD70、CD74、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CDA、CDC42、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CENPA、CHD1、CHD2、CHD4、CHEK1、CHEK2、CHUK、CIC、CLASP2、CNTNAP5、COL1A1、CRBN、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSDE1、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUX1、CXCR4、CYLD、CYP17A1、CYP19A1、CYP2C8、CYP2D6、CYSLTR2、DAXX、DCUN1D1、DDR1、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMC1、DNAJB1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DOT1L、DPYD、DROSHA、DUSP4、DYNC2H1、E2F3、EED、EGFL7、EGFR、EIF1AX、EIF4A2、EIF4E、ELF3、ELK4、ELOC、EME1、EME2、EMSY、EP300、EPAS1、EPCAM、EPHA2、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、EPHB4、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERF、ERG ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZH1、EZH2、EZR、FAM175A、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FAS、FAT1、FAT3、FBXW7、FCGR2B、FGF10、FGF12、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGF7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FOXL2、FOXO1、FOXP1、FRS2、FUBP1、FYN、GABRA6、GALNT12、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GEN1、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPS2、GREM1、GRIN2A、GRM3、GSK3B、GSTM1、GSTP1、GSTT1、H3F3A、H3F3B、H3F3C、HDAC1、HDAC2、HDAC4、HGF、HIST1H1C、HIST1H2BD、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HIST2H3C、HIST2H3D、HIST3H3、HLA-A、HLA-B、HMGB1、HNF1A、HNF1B、HOXB13、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、ICOSLG、ID3、IDH1、IDH2、IFNGR1、IGF1、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL10、IL7R、INHA、INHBA、INPP4A、INPP4B、INPPL1、INSR、IPMK、IRF2、IRF4、IRS1、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KAT6A、KCNJ5、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KEL、KIT、KLF4、KLHL6、KMT2A KMT2B、KMT2C、KMT2D、KNSTRN、KRAS、LATS1、LATS2、LMO1LRP1B、LTK、LYN、LZTR1、MAF、MAFA、MAGI2、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K13、MAP3K14、MAP4K2、MAPK1MAPK3、MAPKAP1、MAPKBP1、MAX、MCAM、MCL1、MDC1、MDM2MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MERTK、MET、MGA、MGMT、MITF、MKNK1、MLH1、MLH3、MLLT1、MPL、MRE11、MSH2、MSH3、MSH4、MSH6、MSI1、MSI2、MST1、MST1R、MTAP、MTHFR、MTOR、MUS81、MUTYH、MYB、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYOD1、NBN、NCOA3、NCOR1、NEB、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NKX2-1、NKX3-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、、OTCH4、NPM1、NQO1、NR3C1、NR4A3、NRAS、NRG1、NSD1、NT5C2、NTHL1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUF2、NUMA1、NUP93、NUTM1、OGG1、P2RY8、PAK1、PAK3、PAK5、PALB2、PARP1、PARP2、PARP3、PARP4、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PDPK1、PGR、PHF2、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3C2G、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIM1、PLCG2、PLK2、PMAIP1、PML、PMS1、PMS2、PNRC1POLD1、POLE、POM121L12、POT1、PPARG、PPM1D、PPP2R1A、PPP2R2A PPP4R2、PPP6C、PRDM1、PRDM14、PREX2、PRKACA、PRKAR1A、PRKCI、PRKD1、PRKDC、PRKN、PRSS8、PRUNE2、PSIP1、PTCH1、PTEN、PTK2、PTP4A1、PTPN11、PTPRD、PTPRO、PTPRS、PTPRT、QKI、RAB35、RAC1、RAC2、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51AP2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RANBP2、RARA、RASA1、RASSF1、RB1、RBBP8、RBM10、RBM6、RECQL、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHOA、RICTOR、RIT1、RNF43、ROBO1ROBO2、ROS1、RPA1、RPL22、RPS6KA4、RPS6KB2、RPTOR、RRAGCRRAS、RRAS2、RRM1、RSPO2、RTEL1、RUNX1、RUNX1T1、RXRA RYBP、SCN7A、SDC4、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEMA3C、SESN1、SESN2、SESN3、SETD2、SF1、SF3A1、SF3B1、SGK1、SH2B3、SH2D1A、SHOC2、SHQ1、SLC34A2、SLCO1B1、SLIT2、SLX1A、SLX4、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCD1、SMO、SMYD3、SNCAIP、SOCS1、SOS1、SOX10、SOX17、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPRED1、SPTA1、SRC、SRSF2、STAG2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STK11、STK19、STK40、SUFU、SUGP2、SUZ12、SYK、TACC3、TAF1、TAP1、TBX3、TCF3、TCF7L2、TEK、TERC、TERT、TET1、TET2、TGFBR1、TGFBR2、TIMP3、TIPARP、TMEM127、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF11、TOP1、TOP2A、TP53、TP53BP1、TP53BP2、TP63、TPMT、TRAF2、TRAF7、TRIM33、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TYMS、TYRO3、U2AF1、U2AF2、UGT1A1、UMPS、UPF1、USP6、USP8、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VHL、VTCN1、WHSC1、WHSC1L1、WISP3、WRN、WT1、WWTR1、XIAP、XPC、XPO1、XRCC1、XRCC2、XRCC3XRCC4、XRCC6、YAP1、YES1、YY1、ZBTB2、ZFHX3、ZNF217、ZNF292、ZNF703、ZNRF3、ZRSR2。

在某些实施例中，所述基因拷贝数变异包括以下基因：CDK4、CDK6、CYP2D6、ERBB2、MDM2、MDM4、MET、MYC。

在某些实施例中，所述发生重排事件的基因为：ALK、BCL2、BCR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CD274、CD74、CD86、EGFR、ERBB4、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、MSH2、MYB、MYC、NOTCH2、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、TMPRSS2。

另一方面，本发明提供了一种基于二代测序的用于检测胰腺癌的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测探针及检测试剂，所述检测探针是针对本发明第一方面所述检测panel的基因突变或拷贝数变异的探针。

在某些实施例中，所述探针为RNA探针。

在某些实施例中，所述基因突变检测包括点突变、缺失、插入、融合等。

另一方面，本发明还提供了所述的检测panel在制备胰腺癌检测装置中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种胰腺癌检测装置，包括：测序模块，用于对待测样本的DNA进行提取，并进行高通量测序，获得测序结果；对比模块，用于对高通量测序的结果进行处理，并将数据与所述的panel进行比对，获得突变信息；分析模块，用于分析获得的突变信息，得出用药方案。、

另一方面，本发明还提供了一种胰腺癌诊断检测方法，包括以下步骤，

步骤S1：获得检测样本DNA(所述样本DNA包括血液样本的DNA组织样本DNA及cfDNA)，提取病人的病灶组织及癌旁或血液组织进行DNA提取，石蜡包埋组织亦可。

步骤S2：样本DNA文库的构建，将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，然后采用KAPA文库构建试剂盒进行文库制备。主要步骤有：DNA打断，末端补平，3’端加“A”，接头连接，纯化，文库扩增，纯化。文库制备完成后将其置于-20℃保存。

步骤S3：构建本发明所述检测panel的检测探针，与DNA文库杂交捕获，并测序；也可直接进行全基因组或者全外显子组测序。

步骤S4：对测序结果进行生物学信息分析，获得样本突变结果。

其中，所述测序结果为fastq文件，使用Broad发布的获取基因突变的算法分析测序结果，得到基因突变的结果并注释。主要步骤有fastq文件的质量控制，基因组联配，体细胞突变(somatic mutation)及胚细胞突变(germline mutation)的分析，进行注释。用到的软件分别有：fastqc和fastx_toolkit用来做质量控制；bwa做联配，gatk及mutect2获得体细胞突变；HaplotypeCaller方法获得胚细胞突变；ANNOVAR做注释。

步骤S5：将样本突变结果与所述检测panel进行比对，得到该样本基因突变结果，结合临床信息得到最终诊断。

本发明相对于现有技术具有的有益效果：

1)本发明的检测panel既兼顾了与胰腺癌治疗相关的基因，又不局限于少数的靶向治疗基因，将与胰腺癌发生发展机制相关的基因也纳入靶向测序的基因列表，实用性也远高于全外显子组测序，无论是对临床用药的指导，还是后续探索胰腺癌的新靶点，都可以提供有用的基因信息。

2)根据本发明提供的基因集制作多基因panel的检测探针，实现精准测序，通过检测本发明所列的基因的异常情况，可以用来作为临床诊断的参考，帮助医生对患者的癌症发展情况有更深层的认识，使病人了解自身基因变异的情况，也有助于治疗方案的设计。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例中DNA样本抽提的质量评估及测序的质量评估结果图。

图2是实施例中血细胞白细胞基因突变的检测结果。

图3是组织多基因突变(somatic mutation)的检测结果。

图4是组织多基因拷贝数变异的检测结果。

图5是组织基因重排检测结果。

图6是基因突变对应用药信息参考图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。

实施例

步骤一、取一位病人的癌组织及血液样本提取DNA，使用试剂盒分别为TIANGENTGuide Cells/Tissue Genomic DNAKit及TIANGEN TGuide Large Volume Blood GenomicDNAKit(1-3ml)。

步骤二、DNA样本文库制备。先使用BioruptorUCD-300非接触式全自动超声波破碎仪对DNA随机打断，ctDNA无需此步。取DNA400ng，nuclease-free water稀释至50μl，转移至0.5mL Eppendorf LoBind Tube管内，充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。放置样品：对称放置离心管(如有单管，用空管加水配平)，将转头拧紧，放置于冰盒上，预冷1～2min。150～200bp超声破碎。重复前一步超声破碎，共9个cycle，约90min结束。然后采用KAPA文库构建试剂盒进行文库制备。

步骤三、RNA探针制备。从公司得到目标基因的oligo pool，用1×TE(PH 8.0)，将oligo pool稀释到1ng/μl。用Herculase II Fusion DNA Polymerase kit扩增oligo序列。再用Ambion SP6 megascriptkit进行RNA转录，探针制备完成。-80℃保存RNA探针，取部分RNA探针文库稀释至100ng/μl。该方法制作的探针可以应用于200-300个样本，极大程度上降低了测序的成本。

步骤四、杂交捕获及送样测序。

1、将95μl Block和总量不少于500ng体积约为5μl的DNA文库混匀后离心，标记为“DNA-block”，置于PCR仪上，盖热盖，95℃5min；65℃hold。

2、配“bait”Mix反应体系于PCR反应管，标记为“bait”，PCR仪温度降至65℃2.5min时，将“bait”管置于PCR仪上孵育，盖上热盖。

表1 PCR反应体系

3、将PCR管“bait”放置入PCR仪2.5min后，从“hyb buffer”中吸取13μl HybBuffer移至“DNA-block”样品中，从“bait”孔中吸取6μl移至DNA-block样品中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，贴膜，盖上PCR仪热盖，65℃孵育过夜24h。然后准备捕获磁珠。按照每个样本需3×165μl的high-stringencybuffer，分装high-stringencybuffer于96孔板，打开干燥仪，调整干燥仪温度为65℃，待干燥仪温度稳定在65℃，置于干燥仪预热。然后进行捕获目标区域DNA文库，完成DNA文库进行富集(Post-PCR反应)。然后进行文库的混合和送样测序。

步骤五、数据分析

用于分析的原始文件为fastq格式数据。用bwa进行联配，HaplotypeCaller方法获得germline mutation；对组织样本的体细胞突变分析，利用MuTect2.然后使用ANNOVAR加注释。

步骤六、得到所有组织样本的注释结果后，整理后如附图所示。

其中，图1为组织样本质量控制，主要包括DNA样本抽提的质量评估及测序的质量评估，是整个实验最基础的部分，数据质量的不合格将会影响后续结果的准确性及可信度。

图2是血细胞白细胞基因突变的检测结果，是患者的DNA样本测序之后经过之前描述的生物信息学分析结果中与本发明所列的基因列表有关的突变的血细胞白细胞(germline mutation)的基因变异的具体情况。

图3是组织多基因突变(somatic mutation)的检测结果，是肿瘤组织的基因变异的具体情况。

图4是组织多基因拷贝数变异的检测结果，获得方法与图二图三一致。

图5是组织基因重排检测结果

图6是基因突变对应用药信息参考，可根据germline mutation及somaticmutation以及重点基因的拷贝数变异，参考对应突变的既往用药信息，方便为患者制定治疗方案。综上，经过本发明的基因检测panel，对样本进行全基因组或全外显子测序，分析后得到所有基因的突变情况，找到本发明所列基因panel中的基因，来结合临床进行下一步分析。根据本发明提供的基因，可以制作多基因panel探针，进行精准测序，得到结果后再结合患者样本的临床等信息，可以为该患者的临床诊断提供有力的参考，也对该患者的癌症发展情况有更深入的了解，方便精准制定治疗方案。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。