一种含密码子优化的结核分枝杆菌融合蛋白AH疫苗

技术领域

本发明属于分子生物学领域和疫苗领域，具体地本申请提供了一种密码子优化的结核分枝杆菌融合基因，以及相应融合蛋白、疫苗、在预防结核病中的应用和制备方法。

背景技术

结核病是一种主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，简称M.tb)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，简称M.bovis)引起的慢性传染性疾病，至今仍然威胁全球健康。作为全球十大死因之一，结核病也是单一传染病中的头号杀手。且耐药结核仍然是一项全球公共卫生威胁。因此，迫切需要开发安全有效的结核疫苗来减轻全球结核病负担。由于卡介苗(Bacille Calmette-Guérin，BCG)有较多的局限性，如对成人结核和潜伏性感染结核无效，越来越多的新型结核病疫苗正在不断的研发和临床验证中。据统计，目前已有14种结核候选疫苗正在开展临床试验。这些候选疫苗主要分为减毒活疫苗、灭活苗、蛋白佐剂疫苗和病毒载体疫苗。而由多种结核分枝杆菌优势抗原组成的蛋白佐剂疫苗在新型结核疫苗中占比较大，其优势在于安全性好，生产质量可控，成本较低等。

Ag85A是M.tb感染早期的主要分泌抗原之一，可介导M.tb的黏附和侵袭以及细胞壁的合成，能刺激Th1细胞产生多种细胞因子如TFN-α，IFN-γ等。Ag85A是最早进入临床阶段的新型痘病毒载体疫苗的抗原，但临床试验结果显示保护效果不佳，可能与含单一抗原有关。HspX蛋白又称Acr(Alpha-crystallin，α-晶体蛋白)，HPS16.3，16KDa抗原，是M.tb潜伏感染期的主要抗原之一，是一种有效的分子伴侣，在体外可以保护蛋白质不聚集。可诱导小鼠树突状细胞成熟和产生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ，是一个重要的新型结核疫苗候选抗原。由于仅含蛋白成分的蛋白亚单位疫苗免疫原性较弱从而不能诱导足够的免疫保护，通常需在蛋白亚单位疫苗中添加佐剂以提高其免疫原性。聚肌胞(polyinsinic-polycytidylic acid，poly(I:C)，简称P)是一种人工合成的由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基配对形成的病毒双链RNA类似物，是一种TLR3激动剂和有效的I型干扰素诱导剂，呼吸道黏膜免疫聚肌胞可增强流感疫苗的免疫保护作用。本发明将M.tb感染早期分泌抗原Ag85A和潜伏期分泌抗原HspX进行融合表达，构建多阶段融合蛋白疫苗AH。由于用Ag85A和HspX原始序列构建的重组融合蛋白在大肠杆菌中表达量低，纯化难度大，因此，本发明对融合基因序列进行密码子优化，经密码子优化后的融合蛋白AH表达量高，且经小鼠试验证实AH联合聚肌胞进行鼻内免疫具有较强的免疫原性和抗牛分枝杆菌感染的保护性作用，且能在免疫后的小鼠血清中检测到未经密码子优化的Ag85A或HspX特异性IgG抗体。本发明研究证实了经密码子优化的多阶段抗原融合蛋白疫苗AH可作为一种潜在的新型结核疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的含密码子优化的结核分枝杆菌融合蛋白疫苗，并将其用于预防结核。本发明通过AH联合聚肌胞进行鼻内免疫，然后用牛分枝杆菌感染小鼠建立感染模型证实其免疫原性和保护效力。

一方面，本申请提供了一种密码子优化的结核分枝杆菌融合基因，其特征在于，其包含结核分枝杆菌Ag85A基因和HspX基因。

进一步地，所述融合基因中以柔性Linker(GGGGS)

进一步地，所述融合基因核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

另一方面，本申请提供了上述融合基因所编码的融合蛋白。

另一方面，本申请提供了一种结核分枝杆菌融合蛋白疫苗，其特征在于，其包含上述融合蛋白。

进一步地，所述疫苗还包括佐剂聚肌胞。

另一方面，本申请提供了上述融合基因、融合蛋白或疫苗在制备预防结核病的药物中的应用。

进一步地，上述药物用于增强BCG的免疫效果。

另一方面，本申请提供了制备上述融合蛋白的方法，其特征在于，包括：融合基因构建、转化、表达和纯化步骤。

进一步地，融合基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本申请的AH疫苗可以单独使用，或者与BCG共同或依次使用用于增强BCG的免疫效果。

本申请中的融合基因构建、转化、表达、纯化等步骤分子生物学、蛋白或免疫领域技术人员可以根据本领域常规技术，如萨姆布鲁克，《分子克隆》等工具书所记载来实施，优选地依据实施例中的方案进行。

除上面已经公开的成分外，本申请的疫苗中还可以包含各种本领域已知和在研的佐剂和辅料成分，包括但不限于矿物质类佐剂、油乳类佐剂、微生物类佐剂。

附图说明

图1为AH的诱导表达，纯化和鉴定电泳图；

图2为AH的免疫原性和保护性数据，其中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；

图3为AH促进BCG的免疫原性和保护性，其中*p<0.05；**p<0.01。

具体实施方式

实施例1重组蛋白AH的制备方法

1.1AH的构建和诱导表达

(1)AH融合表达的原始基因序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGCAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGCGCCGTCACGGGTATGTCGCGTCGACTCGTGGTCGGGGCCGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGGGTCTGGTCGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGACCGCGGGGGCATTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGACGGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGCGCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAGCGCCACCCGCGGTCCCTCTTCCCCGAGTTTTCTGAGCTGTTCGCGGCCTTCCCGTCATTCGCCGGACTCCGGCCCACCTTCGACACCCGGTTGATGCGGCTGGAAGACGAGATGAAAGAGGGGCGCTACGAGGTACGCGCGGAGCTTCCCGGGGTCGACCCCGACAAGGACGTCGACATTATGGTCCGCGATGGTCAGCTGACCATCAAGGCCGAGCGCACCGAGCAGAAGGACTTCGACGGTCGCTCGGAATTCGCGTACGGTTCCTTCGTTCGCACGGTGTCGCTGCCGGTAGGTGCTGACGAGGACGACATTAAGGCCACCTACGACAAGGGCATTCTTACTGTGTCGGTGGCGGTTTCGGAAGGGAAGCCAACCGAAAAGCACATTCAGATCCGGTCCACCAACTGA

(2)AH融合表达的经密码子优化的基因序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGCAACTGGTTGATCGCGTTCGCGGCGCCGTTACCGGTATGAGCCGTCGTCTGGTTGTTGGCGCGGTTGGTGCCGCCCTCGTTAGTGGTCTGGTTGGTGCCGTTGGTGGCACCGCGACCGCCGGTGCGTTTAGTCGTCCGGGTCTGCCAGTGGAATATCTGCAAGTTCCGAGCCCAAGTATGGGCCGCGATATCAAGGTGCAGTTTCAGAGCGGTGGTGCGAATAGCCCAGCGCTGTATCTGCTGGATGGTCTGCGCGCCCAAGATGATTTCAGCGGCTGGGATATCAACACCCCGGCGTTTGAATGGTACGACCAGAGCGGTCTGAGCGTGGTTATGCCAGTGGGCGGCCAGAGTAGCTTCTACAGCGATTGGTATCAGCCGGCGTGTGGTAAAGCCGGTTGCCAGACCTATAAGTGGGAGACCTTTCTGACGAGCGAACTGCCGGGCTGGCTGCAAGCCAATCGCCATGTGAAACCAACCGGCAGCGCCGTTGTTGGTCTGAGCATGGCCGCCAGTAGTGCGCTGACGCTGGCCATTTACCACCCGCAGCAGTTCGTGTATGCCGGTGCGATGAGCGGTCTGCTCGATCCGAGCCAAGCCATGGGCCCGACGCTGATTGGTCTGGCGATGGGCGATGCGGGTGGCTACAAAGCGAGCGATATGTGGGGCCCAAAAGAAGATCCAGCGTGGCAGCGCAATGACCCACTGCTGAATGTGGGCAAACTGATCGCGAACAACACCCGCGTGTGGGTGTACTGTGGTAACGGCAAACCAAGCGATCTGGGTGGCAACAATCTGCCAGCGAAATTCCTCGAAGGCTTTGTGCGCACCAGCAACATCAAGTTCCAAGATGCCTACAATGCGGGCGGCGGTCATAACGGCGTGTTCGATTTCCCGGACAGCGGCACGCATAGTTGGGAGTACTGGGGCGCCCAGCTGAATGCCATGAAACCAGATCTGCAACGTGCGCTGGGTGCCACGCCAAATACCGGCCCAGCGCCACAAGGTGCCGGCGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTGGTAGTATGGCCACGACGCTGCCAGTGCAACGCCATCCGCGCAGTCTGTTTCCGGAATTCAGCGAGCTGTTTGCCGCGTTTCCGAGTTTTGCGGGCCTCCGTCCAACGTTCGATACCCGTCTCATGCGTCTGGAAGACGAGATGAAAGAAGGTCGCTACGAGGTTCGCGCGGAACTCCCGGGCGTTGATCCGGACAAGGACGTGGACATCATGGTTCGCGATGGTCAGCTGACGATCAAAGCGGAGCGTACGGAACAGAAGGATTTCGATGGCCGTAGCGAGTTTGCCTACGGCAGCTTTGTTCGTACGGTTAGTCTGCCAGTGGGTGCCGACGAGGACGATATCAAAGCCACCTACGACAAGGGCATTCTGACCGTTAGCGTGGCCGTGAGCGAGGGTAAACCGACGGAGAAGCACATCCAGATCCGTAGCACCAACTAA

(3)AH的构建，诱导表达

在融合基因序列两端加入酶切位点5'(KpnI)和3'(BamH I)，通过双酶切连接到原核表达载体pET-30a(+)，并转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，用含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基培养细菌至对数生长期(OD600

1.2AH的纯化

解冻菌体，用预冷PBS重悬(200毫升菌液沉淀加入20毫升PBS重悬)，在冰浴条件下超声破碎菌体约30min直至涂片染色后镜下观察无明显可见的完整细菌。4℃，11000rpm离心30min，收集沉淀(即包涵体蛋白)，用包涵体洗涤液Ⅰ(20mM Tris，100mM NaCl，10mMEDTA，0.5％Triton X-100，pH 8.4)充分洗涤，再用包涵体洗涤液Ⅱ(20mM Tris，100mMNaCl，2mM尿素，pH 8.4)充分洗涤，将洗涤后的包涵体溶解于变性液(20mM Tris，5mM EDTA，8M尿素)。用含不同浓度尿素(6M，4M，2M，1M，0.5M，0.1M，0M)的包涵体复性液(含20mM Tris，1mM EDTA，100mM NaCl，1mM还原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽，10％甘油，pH为8.4)在4℃透析复性，每个尿素梯度复性4h以上。最后分别在pH 8.4和pH 7.4的PBS中进行透析去盐。向蛋白溶液中加入1％Triton X-114，用移液枪轻轻吹打混匀，冰浴30min，每隔5min混匀一次，37℃水浴10min，直至出现肉眼可见的分层现象，25℃，11000rpm，离心10min，将上清转移至无菌离心管中，如此重复2次，去除大部分内毒素。0.22μm过滤除菌，分装，冻存于-80℃。

实施例2亚单位疫苗AH的免疫效果评价

2.1AH的免疫原性和保护性评价

50只6-8周的雌性C57BL/6小鼠被随机分为5组，每组10只，分正常对照组(Control)，BCG对照组(BCG)、聚肌胞和AH免疫组(AH-P)，聚肌胞佐剂对照组(P)，攻毒模型组(M.bovis)。聚肌胞和AH的鼻内免疫剂量均为20μg/只，一共免疫3次，每次间隔3周。第二次免疫时BCG对照组小鼠皮下免疫BCG(10

2.2AH促进BCG免疫原性和保护性评价

40只6-8周的雌性C57BL/6小鼠被随机分为4组，每组10只，分正常对照组(Control)，BCG对照组(BCG)，BCG+AH-P组，攻毒模型组(M.bovis)。BCG组和BCG+AH-P组小鼠皮下注射BCG(10

实施例3.实验结果

将用重叠PCR构建的AH原始序列连接到表达载体pET-30a(+)，并转化到BL21(DE3)，含原始序列的重组表达菌用IPTG诱导表达，菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后进行考马斯亮蓝染色，结果显示，诱导前与诱导后的菌体蛋白相比，目的蛋白预期大小位置(约54KDa)的蛋白条带无显著差异(图1A)。然而，含密码子优化的AH序列的重组表达菌诱导表达后，在目的蛋白预期大小的位置可见明显条带(图1B),用抗His标签抗体进行Westernblot鉴定，NC膜上出现单一条带，符合预期大小(图1C)。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，结果显示纯化的AH纯度大于90％(图1D)，并用抗His标签抗体进行Western blot鉴定，结果显示NC膜上可见单一条带，符合预期大小(图1E)。将AH与聚肌胞对小鼠进行鼻内免疫，结果显示，与BCG和佐剂对照P组相比，AH-P组脾脏分泌AH特异性IFN-γ水平(图2A)和产生IFN-γ的肺脏CD8

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种含密码子优化的结核分枝杆菌融合蛋白AH疫苗

<130> aaaaaa

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> original sequence

<400> 1

atgcagcttg ttgacagggt tcgtggcgcc gtcacgggta tgtcgcgtcg actcgtggtc 60

ggggccgtcg gcgcggccct agtgtcgggt ctggtcggcg ccgtcggtgg cacggcgacc 120

gcgggggcat tttcccggcc gggcttgccg gtggagtacc tgcaggtgcc gtcgccgtcg 180

atgggccgtg acatcaaggt ccaattccaa agtggtggtg ccaactcgcc cgccctgtac 240

ctgctcgacg gcctgcgcgc gcaggacgac ttcagcggct gggacatcaa caccccggcg 300

ttcgagtggt acgaccagtc gggcctgtcg gtggtcatgc cggtgggtgg ccagtcaagc 360

ttctactccg actggtacca gcccgcctgc ggcaaggccg gttgccagac ttacaagtgg 420

gagaccttcc tgaccagcga gctgccgggg tggctgcagg ccaacaggca cgtcaagccc 480

accggaagcg ccgtcgtcgg tctttcgatg gctgcttctt cggcgctgac gctggcgatc 540

tatcaccccc agcagttcgt ctacgcggga gcgatgtcgg gcctgttgga cccctcccag 600

gcgatgggtc ccaccctgat cggcctggcg atgggtgacg ctggcggcta caaggcctcc 660

gacatgtggg gcccgaagga ggacccggcg tggcagcgca acgacccgct gttgaacgtc 720

gggaagctga tcgccaacaa cacccgcgtc tgggtgtact gcggcaacgg caagccgtcg 780

gatctgggtg gcaacaacct gccggccaag ttcctcgagg gcttcgtgcg gaccagcaac 840

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ctgcaacggg cactgggtgc cacgcccaac accgggcccg cgccccaggg cgccggcggc 1020

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ttcgccggac tccggcccac cttcgacacc cggttgatgc ggctggaaga cgagatgaaa 1200

gaggggcgct acgaggtacg cgcggagctt cccggggtcg accccgacaa ggacgtcgac 1260

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gacggtcgct cggaattcgc gtacggttcc ttcgttcgca cggtgtcgct gccggtaggt 1380

gctgacgagg acgacattaa ggccacctac gacaagggca ttcttactgt gtcggtggcg 1440

gtttcggaag ggaagccaac cgaaaagcac attcagatcc ggtccaccaa ctga 1494

<210> 2

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工(original sequence)

<400> 2

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ggcgcggttg gtgccgccct cgttagtggt ctggttggtg ccgttggtgg caccgcgacc 120

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tttgaatggt acgaccagag cggtctgagc gtggttatgc cagtgggcgg ccagagtagc 360

ttctacagcg attggtatca gccggcgtgt ggtaaagccg gttgccagac ctataagtgg 420

gagacctttc tgacgagcga actgccgggc tggctgcaag ccaatcgcca tgtgaaacca 480

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