一种检测人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平评估母胎免疫耐受的方法

技术领域

本发明具体涉及一种检测人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平评估母胎免疫耐受的方法。

背景技术

正常妊娠期间，母体免疫系统在母胎界面会做出一系列免疫调节机制，从而使母体对半同种移植物的胎儿产生免疫耐受，若是母胎界面免疫调节功能失衡，则会发生自然流产。与同一配偶连续发生2次或2次以上的自然流产者称为复发性流产(RSA)，RSA会严重影响育龄女性的身心健康。近年来，自发流产的发生率在人群中呈现上升趋势。RSA的病因则是多种多样的，包括：生殖道解剖异常、配偶的染色体异常、母体血栓形成障碍、母体免疫功能异常以及各种内分泌紊乱等。然而，仍有40％-50％的RSA患者找不到明显的原因，称为不明原因的复发性流产(URSA)。

HLA-E是非经典的HLA(Human histocompatibility leukocyte antigen)I类分子，在早期胎盘滋养细胞中均有分布。HLA-E可以与母胎界面的NK细胞、T细胞上的NKG2A和NKG2C受体结合，且HLA-E与NKG2A的亲和力是NKG2C的6倍。NKG2A为细胞表面的抑制性受体，能够抑制NK细胞、T细胞对胎儿的攻击，诱导母胎免疫耐受。HLA-E与受体的结合依赖于HLA-E在细胞表面的表达，然而前人的研究显示：HLA-E主要存在于绒毛滋养细胞的胞质中而非细胞膜表面，因此难以通过与母胎界面中细胞上的受体直接接触发挥作用。文献报道显示，滋养细胞来源的外泌体在妊娠中发挥细胞通讯的作用，以维持母胎免疫耐受。

之前文献报道的评估母胎免疫耐受的方法主要有：测量外周血中的细胞因子或雌激素孕激素水平、比较外周血中免疫细胞群体比例的变化和比较蜕膜中免疫细胞群体比例的变化。

测量外周血中的细胞因子或雌激素孕激素水平主要步骤是：抽取患者适量外周血，取血浆后用ELISA测细胞因子或雌激素孕激素水平。ELISA是一种利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，再进行定量测定的实验方法。但它存在明显的缺点：1.ELSA实验步骤繁多，从而造成干扰因素众多，实验重复性不好；2.ELISA众多步骤均需要手工操作，并且一次实验仅能测一种因子或者激素的表达，费时费力；3，影响细胞因子水平的因素较多，不能精确反映母胎免疫耐受水平。

通过比较外周血中免疫细胞群体变化的步骤主要为：抽取患者适量外周血，分离得到所需的免疫细胞后，通过流式分析法比较不同免疫细胞的比例，多比较的是NK细胞群体或髓源抑制性细胞或T细胞比例的变化，来衡量母胎免疫耐受功能。然而，该方法只能间接体现母胎界面的免疫耐受，且外周血中的免疫细胞的变化容易受其他疾病影响：例如在急性感染的患者外周血中的髓源抑制性细胞比例升高；哮喘患者外周血中会体现出Th1/Th2失衡，Treg比例升高；在一些超敏和自然免疫反应中，患者的NK细胞比例也会升高......因此，该方法具有不稳定性。

通过测量蜕膜中免疫细胞群体变化的主要步骤是：收集流产蜕膜，分离出所需要的免疫细胞，多为NK细胞或髓源抑制性细胞或T细胞，然后通过流式技术分析免疫细胞比例的变化，来衡量母胎免疫耐受功能。虽然理论上这种方法可以直观体现母胎界面的免疫耐受功能，但是由于免疫细胞在蜕膜中分布不均匀，即在底蜕膜中的免疫细胞分布明显高于包蜕膜，清宫术不能够也不可能刮出全部蜕膜组织，这就导致了该方法具有不确定性。并且，为了保护URSA患者的子宫内膜、不影响后续生育需求，目前各大医院提倡采用米非司酮促进蜕膜和孕囊排出的方法，蜕膜组织不能一次性排出，导致蜕膜收集困难。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种检测人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平评估母胎免疫耐受的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种检测人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平评估母胎免疫耐受的方法，包括以下步骤：

1)提取患者绒毛滋养细胞的外泌体；

2)将步骤1)所获得的外泌体与乳胶颗粒结合；

3)标记HLA-E流式抗体，在流式细胞分析仪上分析外泌体中HLA-E的水平。

进一步地，步骤1)具体为：

1.1)在不明原因复发性流产(URSA)患者清宫当天，收集患者绒毛，用pH＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液漂洗；

1.2)将步骤1.1)得到的绒毛组织剪碎成1立方毫米的小碎片，用PBS重悬为组织混合液，再用1mg/ml的胶原酶IV和0.01mg/ml的DNA酶对组织混合液在37℃摇床上消化1小时；

1.3)用70μm的无菌滤器对步骤1.2)得到的组织混合液进行过滤，然后将过滤后的细胞悬液用离心机离心，转速为1,000×g，离心5分钟，离心完成后取出上清液；

1.4)将步骤1.3)得到的上清液用0.22μm的无菌滤器过滤，过滤完后的液体装入超速离心管中，在超速离心机中4℃，100,000×g，离心1小时，弃去上清液，沉淀为外泌体；

1.5)再用PBS重悬外泌体，在超速离心机中4℃，100,000×g，离心1小时，得到沉淀即为清洗后的外泌体；

进一步地，步骤2)具体为：

外泌体用200μl PBS重悬后，用BCA法定量分析外泌体浓度，根据BCA结果，从获得的外泌体重悬液中取出20μg外泌体，加入稀释了100倍的乳胶颗粒10μl混匀，室温下放置15分钟后，加入1ml PBS，然后于4℃摇床上摇晃2小时，然后将乳胶颗粒与外泌体混合物于3，000×g，离心5min，去上清，再用PBS清洗一遍，将沉淀加入100μl PBS中重悬。

进一步地，步骤3)具体为：

3.1)100μl重悬液中加入荧光标记的流式抗体：HLA-E-APC，混匀，室温下避光孵育30min；

3.2)避光孵育完成后，加入1ml PBS,3000×g，离心5min去上清，最后向沉淀中加入200μl PBS上机，分析HLA-E阳性的颗粒比例。

本发明的有益效果是：

(1)HLA-E是抑制性受体NKG2A的配体，与T细胞和NK细胞上的NKG2A结合后发挥免疫抑制效应，由于HLA-E大多数表达在滋养细胞的胞浆，需要经由外泌体分泌到胞外发挥作用，因此外泌体HLA-E水平可以反映母胎免疫耐受的水平。

(2)本发明首先提取出人原代绒毛滋养细胞外泌体，然后通过流式细胞术检测分析外泌体中HLA-E的水平。本发明检测方法操作简便快捷，省时省力。

(3)本发明检测方法中所需要的绒毛组织量较少，容易获得，不给患者增加额外的损伤，且避免了由于组织量少做不出检测结果而造成的人力物力浪费。

附图说明

图1是本发明检测方法的流程图。

图2是本发明采用的Beckman流式细胞分析仪示意图。

图3是对获得的超离后的外泌体的鉴定图，其中图3(a)是通过冷冻透射电镜鉴定的人绒毛滋养细胞外泌体大小和形态图，图3(b)是通过外泌体浓度粒径(NTA)鉴定的人绒毛滋养细胞外泌体粒径分布图，图3(c)是通过Western blot鉴定的人绒毛滋养细胞外泌体的特异性标志分子图，图3(d)是通过流式细胞分析仪鉴定人绒毛滋养细胞外泌体中免疫细胞表面分子携带情况图。

图4是正常女性、胚胎染色体异常导致的复发性流产患者和不明原因复发性流产患者绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E阳性比例的数据统计图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。以下实施例中所用到的试剂，试剂盒，仪器等均能够通过商业途径获得；其中，1M＝1mol/L；PBS指的是pH＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液。

实施例1

一种检测人绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E水平的方法，包括以下步骤：

(1)提取患者绒毛滋养细胞的外泌体：

1.1)在不明原因复发性流产(URSA)患者清宫或排出绒毛当天，收集绒毛组织，用pH＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2遍；

1.2)将绒毛组织用灭菌过的剪刀剪碎成1立方毫米的小碎片，用PBS重悬为组织混合液，再利用1mg/ml的胶原酶IV(Sigma–Aldrich)和0.01mg/ml的DNA酶(购自Sigma–Aldrich)对组织混合液在37℃摇床上晃动消化1小时；

1.3)用70μm的无菌滤器对消化后的组织混合液进行过滤，然后将过滤后的细胞悬液用离心机离心，转速为1,000×g，离心5分钟，离心后的沉淀为细胞与细胞碎片，外泌体存在于上清液中，取出上清液；

1.4)将上清液用0.22μm的无菌滤器过滤，进一步达到去除细小的细胞碎片的目的，过滤完后的液体装入超速离心管中，液体和超离管的总质量需要用电子天平称量精确到0.01g，对角线上的两个装有液体的超速离心管的质量一致，然后按照对角线对称的方式放入定角转子中，在超速离心机中4℃，100,000×g，离心1小时，倒出上清液，沉淀为外泌体；

1.5)用25ml的PBS重悬外泌体得到外泌体溶液，外泌体溶液和超离管的总质量需要用电子天平称量精确到0.01g，对角线上的两个装有外泌体溶液的超速离心管的质量一致，然后按照对角线对称的方式放入定角转子中，在超速离心机中4℃，100,000×g，离心1小时清洗一遍，最终得到的沉淀即为清洗后的外泌体。

图3是对获得的外泌体的鉴定图，其中，人绒毛滋养细胞外泌体的鉴定(NP:Normalpregnancy，健康女性；AK-RSA:Recurrent spontaneous abortion with abnormalkaryotype，胚胎染色体异常的复发性流产患者；URSA:Unexplained recurrentspontaneous abortion，不明原因的复发性流产患者；TC-EXO:Trophoblast cell derivedExosomes,滋养细胞来源的外泌体；TC-Lysate，Trophoblast cell lysate，滋养细胞裂解蛋白)。

图3a是通过冷冻透射电镜鉴定的人绒毛滋养细胞外泌体图，图3b是通过外泌体浓度粒径(NTA)鉴定的人绒毛滋养细胞外泌体粒径分布图，横坐标是外泌体粒径尺寸，纵坐标是外泌体的浓度，图3b表明测得三组外泌体的粒径分别为154.7、151.9和145.8nm；图3a和3b说明提取的物质是外泌体，符合外泌体的形态和大小。图3c是通过Western blot鉴定的人绒毛滋养细胞外泌体的特异性标志分子图，图3c说明提取的外泌体携带外泌体特异的分子Alix、CD63、TSG101和胎盘滋养细胞特异的分子PLAP和HLA-G，且不携带绒毛组织中间充质细胞特异的分子Vimentin和内质网蛋白GRP94；图3d是通过流式细胞分析仪鉴定人绒毛滋养细胞外泌体中免疫细胞表面分子携带情况图。图3d说明了提取的外泌体不携带免疫细胞表面分子，不是淋巴细胞来源的，而是人绒毛滋养细胞来源的。

(2)将所获得的患者绒毛滋养细胞的外泌体与乳胶颗粒结合，因为外泌体直径较小，流式细胞分析仪检测不到，将外泌体吸附到乳胶颗粒上能够更好地被流式仪检测。

2.1)根据BCA法测得外泌体的浓度，取出20μg外泌体于1.5ml ep管中，加入稀释了100倍的醛/硫酸盐乳胶颗粒10μl(Invitrogen,New York,NY,USA)混匀，室温下放置15分钟；所述稀释了100倍的醛/硫酸盐乳胶颗粒的浓度为410μg/μl，具体按照说明书进行稀释。本发明不对此进行改进。本实施例中，采用的BCA法测蛋白浓度，是现有技术中常规的步骤，本发明不对此进行改进。

2.2)然后加入1ml PBS混匀，于4℃摇床上缓慢摇匀2小时，使外泌体与乳胶颗粒充分结合；

2.3)将乳胶颗粒与外泌体混合物于3,000×g，5min，离心，弃上清，沉淀加入1mlPBS，3,000×g，离心5min清洗一遍，弃上清，沉淀用100μl PBS混匀。

(3)在流式细胞分析仪上圈出滋养细胞来源外泌体群体，分析该群体中HLA-E的表达：

3.1)在100μl外泌体溶液(即步骤2.3得到的溶液)中加入荧光标记的流式抗体5μl：HLA-E-APC(货号130-096-846，Miltenyi)混匀，室温下避光孵育30min；

3.2)避光孵育完成后加入1ml PBS 3,000×g，5min离心后去上清，再加入1ml PBS离心清洗一遍，在最终沉淀中加入200μl PBS上机分析HLA-E阳性颗粒的比例。

本发明研究显示绒毛滋养细胞外泌体内容物的改变主要体现在HLA-E表达的下降，因此，通过检测人绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E水平可能被用于评估母胎免疫耐受。

收集的蜕膜人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平如图4所示，图4中，a是流式细胞分析图，横坐标是荧光强度，表示HLA-E的表达强度；b是HLA-E阳性颗粒比例的统计图；

流式检测人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E阳性率(NP:Normal pregnancy，健康女性；AK-RSA:Recurrent spontaneous abortion with abnormal karyotype，胚胎染色体异常的复发性流产患者；URSA:Unexplained recurrent spontaneous abortion，不明原因的复发性流产患者；TC-EXO:Trophoblast cell derived Exosomes,滋养细胞来源的外泌体)，图4b中纵坐标为人绒毛滋养细胞外泌体中，HLA-E阳性的比例。

由图4可知，与健康女性、胚胎染色体异常的RSA患者相比，URSA患者绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E阳性(即外泌体中HLA-E进行表达，则为阳性)比例最小；健康绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E阳性比例的平均值M为：37.02％，标准差SD为15.83％，故而推断出人母胎免疫耐受功能受损时，绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E阳性比例的截断值为：M-2SD＝5.36％；即利用上述流式细胞分析仪法测人绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E水平时，若绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E阳性比例低于5.36％时，则母胎免疫耐受功能可能受损。

由图4可知，URSA患者中，绒毛滋养细胞外泌体中HLA-E水平与正常女性相比显著下降，因此，人绒毛滋养细胞通过分泌外泌体，使外泌体中的HLA-E与母胎界面的NK、T细胞等免疫细胞上的NKG2A结合，抑制NK细胞和T细胞对胎儿的毒性、维持母胎免疫耐受。URSA患者的绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平下降，导致免疫耐受功能受损，通过检测人绒毛滋养细胞外泌体HLA-E水平可以用于评估母胎免疫耐受功能。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。