总胆红素测定试剂盒的制作方法

技术领域

本发明涉及试剂盒制备技术领域，尤其涉及一种总胆红素测定试剂盒的制作方法。

背景技术

总胆红素是人体内由血红素代谢产生的结合和非结合型胆红素的总称，总胆红素异常偏高常见于肝胆疾病，近年来一些研究表明血液中胆红素低于正常值常与冠心病有关。因此，对人体的血清、血浆或尿液中总胆红素的测定，是医学检验最常规的项目之一。试剂在PH3.00左右，有表面活性剂合加速剂的存在下，样品中的总胆红素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素，测定吸光度前后的变化，计算样品中总胆红素的含量。

胆红素的测定，传统采用的是重氮试剂法，该法历史悠久，测值较准，其主要缺点即试剂稳定性差、反应特异性差等，虽经过了无数的改良，至今仍无满意结果。酶法测定总胆红素具有特异的特点，但其试剂盒由于酶热稳定性差、保存时间短、价格过高不利于推广应用。

现有的试剂盒对脂浊情况较严重的标本检测时测值不准确。现时人们饮食中油脂含量较高，而抽血时不一定是隔夜空腹，所以血清标本中出现脂浊的几率也越来越多，导致样本空白偏高而影响了胆红素测定。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种总胆红素测定试剂盒的制作方法，其可以消除脂浊对检测带来的影响，从而提高检测的准确度。

为了实现上述目的，本发明提供一种总胆红素测定试剂盒的制作方法，包括以下步骤：

A、制作试剂1，所述试剂1包括柠檬酸缓冲液、表面活性剂和曲通，所述柠檬酸缓冲液的成分包括异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶，且所述异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶的比例为200:180:3:1；

B、制作单剂试剂，所述单剂试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠的比例为1:4:7:2；

C、将柠檬酸缓冲液和单剂试剂进行搅拌混合，混匀后，在37℃条件下保温3～10分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；

D、将反应液倒入到试剂盒内，所述试剂盒内承载有底物试剂，所述底物试剂包括氧化酶底物和底物缓冲液，所述氧化酶底物和底物缓冲液的比例为12:7。

根据本发明的总胆红素测定试剂盒的制作方法，所述柠檬酸缓冲液的PH值为2.6～3.4，所述表面活性剂的含量为0.2～1.2g/L，所述曲通为曲通100，且所述曲通的含量为1.5～7.5ml/L。

根据本发明的总胆红素测定试剂盒的制作方法，所述磷酸氢二钠的含量为1～5.5g/L，所述磷酸二氢钾的含量为0.25～1.5g/L，所述钒酸钠的含量为0.15～0.7g/L，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.2～1.0g/L。

根据本发明的总胆红素测定试剂盒的制作方法，所述酶试剂包括20﹪～30﹪(重量)的纤维素酶和1％～4％(重量)的葡糖氧化酶。

根据本发明的总胆红素测定试剂盒的制作方法，所述葡糖氧化酶包括30﹪的内切纤维素酶，45﹪的中性木聚糖酶和25％β－葡聚糖酶。

根据本发明的总胆红素测定试剂盒的制作方法，所述柠檬酸缓冲液的PH值为3.0，所述表面活性剂的含量为0.7g/L，所述曲通为曲通100，且所述曲通的含量为5.2ml/L。

根据本发明的总胆红素测定试剂盒的制作方法，所述磷酸氢二钠的含量为3.5g/L，所述磷酸二氢钾的含量为0.86g/L，所述钒酸钠的含量为0.43g/L，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.67g/L。

本发明提供了一种总胆红素测定试剂盒的制作方法，包括以下步骤：

A、制作试剂1，所述试剂1包括柠檬酸缓冲液、表面活性剂和曲通，所述柠檬酸缓冲液的成分包括异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶，且所述异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶的比例为200:180:3:1；

B、制作单剂试剂，所述单剂试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠的比例为1:4:7:2；

C、将柠檬酸缓冲液和单剂试剂进行搅拌混合，混匀后，在37℃条件下保温3～10分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；

D、将反应液倒入到试剂盒内，所述试剂盒内承载有底物试剂，所述底物试剂包括氧化酶底物和底物缓冲液，所述氧化酶底物和底物缓冲液的比例为12:7。

本发明的有益效果：利用表面活性剂加速总胆红素的反应，提高反应速率，曲通促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定结果影响，可促进胆红素的氧化反应，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾利于试剂中各种成分的分散稳定性，钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠可络合测试样本中的二价金属离子，减少样本中胆红素的自氧化，进而消除脂浊对检测带来的影响，从而提高检测的准确度。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种总胆红素测定试剂盒的制作方法，包括以下步骤：

A、制作试剂1，所述试剂1包括柠檬酸缓冲液、表面活性剂和曲通，所述柠檬酸缓冲液的成分包括异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶，且所述异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶的比例为200:180:3:1；

B、制作单剂试剂，所述单剂试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠的比例为1:4:7:2；

C、将柠檬酸缓冲液和单剂试剂进行搅拌混合，混匀后，在37℃条件下保温3～10分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；

D、将反应液倒入到试剂盒内，所述试剂盒内承载有底物试剂，所述底物试剂包括氧化酶底物和底物缓冲液，所述氧化酶底物和底物缓冲液的比例为12:7。

优选的是，本发明的柠檬酸缓冲液的PH值为2.6～3.4，所述表面活性剂的含量为0.2～1.2g/L，所述曲通为曲通100，且所述曲通的含量为1.5～7.5ml/L，柠檬酸缓冲液(PH2.6～3.4)酸性过大易促使胆红素发生自氧化，所以不能使反应pH太低。表面活性剂0.2～1.2g/L加速总胆红素的反应，提高反应速率。曲通100 1.5～7.5ml/L促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定结果影响，可促进胆红素的氧化反应。

另外，本发明的磷酸氢二钠的含量为1～5.5g/L，所述磷酸二氢钾的含量为0.25～1.5g/L，所述钒酸钠的含量为0.15～0.7g/L，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.2～1.0g/L，磷酸氢二钠1～5.5g/L磷酸二氢钾0.25～1.5g/L利于试剂中各种成分的分散稳定性，钒酸钠0.15～0.7g/L，乙二胺四乙酸二钠0.5g/L可络合测试样本中的二价金属离子，减少样本中胆红素的自氧化。

进一步的，本发明的酶试剂包括20﹪～30﹪(重量)的纤维素酶和1％～4％(重量)的葡糖氧化酶，利用酶试剂实现原料中部分淀粉类多糖和非淀粉多糖的水解，得到利于发酵过程的糖类物质，提高生物发酵水平，有效降低可溶性多糖和单糖的残留，从而降低废水中的COD。

更好的，本发明的柠檬酸缓冲液的PH值为3.0，所述表面活性剂的含量为0.7g/L，所述曲通为曲通100，且所述曲通的含量为5.2ml/L，能够有效促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定结果影响，可促进胆红素的氧化反应。

本发明提供了一种总胆红素测定试剂盒的制作方法，包括以下步骤：

A、制作试剂1，所述试剂1包括柠檬酸缓冲液、表面活性剂和曲通，所述柠檬酸缓冲液的成分包括异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶，且所述异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶的比例为200:180:3:1；

B、制作单剂试剂，所述单剂试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠的比例为1:4:7:2；

C、将柠檬酸缓冲液和单剂试剂进行搅拌混合，混匀后，在37℃条件下保温3～10分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；

D、将反应液倒入到试剂盒内，所述试剂盒内承载有底物试剂，所述底物试剂包括氧化酶底物和底物缓冲液，所述氧化酶底物和底物缓冲液的比例为12:7。所述葡糖氧化酶包括30﹪的内切纤维素酶，45﹪的中性木聚糖酶和25％β－葡聚糖酶。所述磷酸氢二钠的含量为3.5g/L，所述磷酸二氢钾的含量为0.86g/L，所述钒酸钠的含量为0.43g/L，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.67g/L。

综上所述，本发明提供了一种总胆红素测定试剂盒的制作方法，包括以下步骤：

A、制作试剂1，所述试剂1包括柠檬酸缓冲液、表面活性剂和曲通，所述柠檬酸缓冲液的成分包括异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶，且所述异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、稳定剂和辅酶的比例为200:180:3:1；

B、制作单剂试剂，所述单剂试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠的比例为1:4:7:2；

C、将柠檬酸缓冲液和单剂试剂进行搅拌混合，混匀后，在37℃条件下保温3～10分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；

D、将反应液倒入到试剂盒内，所述试剂盒内承载有底物试剂，所述底物试剂包括氧化酶底物和底物缓冲液，所述氧化酶底物和底物缓冲液的比例为12:7。

本发明的有益效果：利用表面活性剂加速总胆红素的反应，提高反应速率，曲通促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定结果影响，可促进胆红素的氧化反应，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾利于试剂中各种成分的分散稳定性，钒酸钠和乙二胺四乙酸二钠可络合测试样本中的二价金属离子，减少样本中胆红素的自氧化，进而消除脂浊对检测带来的影响，从而提高检测的准确度。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。