一种苯胺废水优势菌的驯化及筛选方法

技术领域

本发明是提供一种苯胺废水优势菌的驯化及筛选方法，属于微生物筛选技术领域。

技术背景

苯胺是一种重要的化工原料和中间体，广泛地应用于燃料、医药、炸药、农药、军工等行业，是国际公认的危险化学品。苯胺是一种严重污染环境、危害人体健康的有物质，此类废水排入水体，其毒性不但会妨碍水生生物的生长，同时也严重威胁人类的身体健康。因此，我国的废水排放标准中对苯胺类物质有严格的标准。苯胺废水具有生物毒性强、污染物浓度、含盐量高、色度高等特点，属于典型难降解工业废水。目前，苯胺废水的处理方法主要有物理法、化学法、生物法及联合处理法。其中，生物法是一种经济有效的净化方法，但废水的高毒性限制了其使用，因此，培养筛选出对苯胺有高效降解能力的菌种，使之广泛用于苯胺类化合物废水具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服生物法处理苯胺废水时存在的缺点与不足，提供一种苯胺废水优势降解菌。

本发明的另一个目的是提供所述苯胺废水优势菌的筛选富集方法，该方法有效的提高了苯胺废水的降解效率。

所述的苯胺废水优势降解菌的筛选富集方法，包括如下步骤：

(1)制备菌液：将苯胺废水排污口污泥加入无菌水中，苯胺废水排污口污泥的浓度为0.06g/mL，摇床避光培养24h，得到菌悬液；在灭菌后的无机盐培养基中接种菌悬液，菌悬液的接种量为无机盐培养基体积的5％，摇床避光培养7d，得到菌液；

(2)制备苯胺废水降解菌系：将葡萄糖加入步骤(1)的菌液中，按菌液体积的5％接种苯胺废水，摇床避光进行传代培养，得到苯胺废水降解菌系培养液；每次传代培养时菌液中葡萄糖的量均比上一代减少1/5，苯胺废水的量均比上一代增加，每次增加量为菌液体积的5％，每次传代培养7d，传代培养≥五代，最后一代培养时培养基中不再添加葡萄糖；

(3)筛选苯胺废水降解菌系：往无机盐培养基中加入琼脂，灭菌后，待无机盐培养基凝固后加入经梯度稀释的步骤(2)的苯胺废水降解菌系培养液中并涂布均匀，30℃培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复进行接种培养并划线分离，得到纯化的苯胺废水降解菌系；

(4)对纯化的苯胺废水降解菌系进行复筛：将步骤(3)纯化的苯胺废水降解菌系接种于LB培养基中，长出菌落后，制备成浓度为OD

步骤(1)中，

所述的摇床避光条件为30℃、140r/min；

所述的无机盐培养基的组分为：NaCl1.0g,NH

所述的微量元素液的组成为：MgSO

步骤(2)中，

所述的苯胺废水的浓度为100mg/L；所述的葡萄糖的重量为无机盐培养基重量的0.5％；

所述的摇床避光的条件为于30℃、140r/min培养7天；

所述的无机盐培养基的组分为：NaCl1.0g，NH

所述的微量元素液的组成为：MgSO

步骤(3)中，

所述的琼脂的重量为无机盐培养基重量的2％；

所述的无机盐培养基与步骤(2)的苯胺废水降解菌系培养液的体积比为100:1；

所述的梯度稀释为将步骤(2)的苯胺废水降解菌系培养液按照体积分别稀释103、104、105倍；

所述的无机盐培养基的组分为：NaCl1.0g，NH

所述的微量元素液的组成为：MgSO

步骤(4)中，

所述的LB平板培养基的组成为：蛋白胨2.5g，牛肉膏0.75g，NaCl1.25g，蒸馏水250mL。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明采用生物法处理苯胺废水，具有能耗低、反应条件温和且效率较高。本发明具有专属适应性微生物的筛选驯化培养，降解菌株对苯胺废水的降解效率可以达到75％以上，对于提高生物反应系统的耐受性和稳定性、提高降解效率具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)菌源的采集与菌悬液的制备：采集南京某公司苯胺排污口土壤，将污泥置于4℃冰箱中保存备用；将20g采集回来的土壤置于250mL的无菌水中，30℃振荡12小时，制成菌悬液；

(2)取5mL菌悬液注入盛有100mL无机盐培养基的锥形瓶中，放置于30℃恒温摇床内，140r/min震荡培养7d，得到菌液；

(3)无机盐培养基：无机盐培养基的组分为：NaCl1.0g，NH

(4)取1mL步骤(2)中的菌液，加入100mL的无机盐培养基中，30℃，140r/min震荡培养7d，其中无机盐培养基中加入苯胺的含量至50mg/L，加入葡萄糖的含量至200mg/L；

(5)取1mL步骤(4)中的菌液，加入100mL的无机盐培养基中，30℃，140r/min震荡培养7d，其中无机盐培养基中加入苯胺的含量至100mg/L，加入葡萄糖的含量至100mg/L；

(6)取1mL步骤(5)中的菌液，加入100mL的无机盐培养基中，30℃，140r/min震荡培养7d，其中无机盐培养基中加入苯胺的含量至150mg/L，加入葡萄糖的含量至50mg/L；

(7)取1mL步骤(6)中的菌液，加入100mL的无机盐培养基中，30℃，140r/min震荡培养7d，其中无机盐培养基中加入 苯胺的含量至200mg/L，不再加葡萄糖；

(8)将步骤(7)中的菌液进行梯度稀释，所述梯度稀释是将步骤(7)中的硝基苯降解菌系培养液按照体积分别稀释103、104、105倍，涂布于固体平板上，30℃培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复接种培养并划线分离，得到纯化的苯胺废水降解菌。

(9)对纯化的苯胺废水降解菌进行复筛：将步骤(8)得到的苯胺废水降解菌接种于LB平板培养基中，培养7d，待长出菌落后，将菌种刮于无菌水中，将菌打散成菌液，调节菌液的浓度为OD

最终得到的苯胺废水降解菌系能够以硝基苯废水为底物生长，好氧降解试验表明菌群能够对苯胺废水进行有效的好氧降解；当硝基苯废水的浓度为200mg/L时，7d以后降解率达到72％，10d以后降解效率达到78％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。