一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法

技术领域

本发明涉及一种外泌体分离及鉴定的方法，具体为一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法，属于农业养殖应用领域。

背景技术

外泌体（Exosomes）是细胞分泌的直径约为30～150nm，密度为1.13-1.19g/mL的脂质双分子层结构膜性囊泡，呈圆形或椭圆形，具有典型的“杯盘”形态。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液、羊水和乳汁。外泌体可携带蛋白质、脂质、DNA和RNA(包括mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)及其降解片段等多种具有生物学活性的物质，其作为新型的细胞间通讯分子，不仅参与细胞间正常的信息传递和物质交换等生物学进程，而且在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症等疑难杂症的治疗方面已崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。有研究发现，牛乳汁中的Exosomes包含众多小RNA（miRNA、lncRNA、circRNA），可转运进入免疫细胞，影响小牛胃肠道和免疫系统发育；同时牛乳中Exosomes还可以携带药物到肿瘤靶点，从而提高药物作用效率和安全性。可见，牛乳中外泌体功能越来越受到重视，亟需进一步研究。因此，探索一种价格低、效率高且纯度良好的牛乳Exosomes提取和鉴定方法是科研和疾病治疗的重要前提。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种荷斯坦牛乳外泌体分离的方法，包括荷斯坦牛乳样本采集和密度梯度超速离心分离外泌体，具体包括以下步骤：

A 荷斯坦牛乳样本采集

挑选健康且处于泌乳期的荷斯坦牛，收集30mL乳汁，将收集的荷斯坦牛乳汁保存于4℃低温冰箱备用；

B 荷斯坦牛乳外泌体分离

（1）取A中新鲜采集的荷斯坦牛乳汁于2,000×g、4℃条件下低温离心30min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；

（2）将离心后的上层乳汁转移至新的无菌50mL尖底离心管中，于10,000×g、4℃条件下低温离心45min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；

（3）将步骤（2）中离心后的上层乳汁转移至新的离心管中，选择超速转子，在4℃、100,000×g条件下超速离心120min，弃上层液体，所得下层沉淀为初步分离的荷斯坦牛乳汁外泌体；

（4）向步骤（3）中所获的沉淀中加入20mL 4℃预冷的1×PBS，重悬沉淀，再次4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；

（5）将步骤（4）中离心后的上清转移至新的尖底离心管中，4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；

（6）重复步骤（5）1次；

（7）将步骤（6）中离心后的上清转移至新的离心管中，选择超速转子，4℃、100,000×g条件下超速离心120min，去除上清，保留下层沉淀；

（8）将（7）所获的沉淀重悬于1mL预冷的PBS中，4℃低温保存；

（9）分别配制40%、20%、10%和5%的碘克沙醇，各取3.6mL依次加入到超离管中，最后将步骤（8）中的1mL重悬液缓慢加在最上层，4℃，100,000 ×g，超速离心120 min；

（10）离心后的混合液分成12层，收集中间6～9层的液体，再次4℃， 100,000 ×g，超速离心120min，去除上清，得到提纯后的牛乳外泌体；

（11）将步骤（10）所获外泌体，重悬于100 μL 预冷的PBS中，立即使用或冻存于-80℃超低温冰箱。

优选地，所述用于新鲜牛乳保存和上述步骤（8）中低温冰箱型号为美的BCD-525WKPZM(E)，上述步骤（11）中超低温冰箱型号为Eppendorf CryoCube F570，上述步骤（1）（2）（4）（5）（6）中低温离心机型号为Eppendorf 5810R，上述步骤（3）（7）（9）（10）中低温超速离心机型号为Beckman Optima L-100XP。

一种荷斯坦牛乳外泌体鉴定的方法，包括透射电镜观察鉴定、粒径分析鉴定和Western blot分析鉴定，具体包括以下步骤：

A 荷斯坦牛乳外泌体的透射电镜（TEM）观察鉴定

（1）取10μL上述分离的外泌体+PBS混合液，滴加于100目的铜网上，静置1min，滤纸吸走浮液；

（2）在上述步骤（1）的铜网上，再次滴加10μL磷钨酸，静置1min，滤纸吸走浮液；

（3）常温干燥10min；

（4）电压选择100kv进行透射电镜成像检测并拍照保存；

B 荷斯坦牛乳外泌体的粒径分析（NTA）鉴定

（1）取10μL上述分离的外泌体+PBS混合液，加入1.9mL的1×PBS，稀释至工作浓度悬液；

（2）将步骤（1）中混合液转移至流式管中，通过纳米流式粒径分析仪实时地对悬液中外泌体和囊泡进行逐个成像和观察，并通过Zeta view 8.04.02软件计算出悬液中外泌体的粒径分布和浓度；

C 荷斯坦牛乳样品标志性蛋白免疫印迹（Western blot）分析鉴定

（1）外泌体蛋白样品制备：将冻存于-80℃超低温冰箱的外泌体取出，冰上解冻后，加入100μL RIAP蛋白裂解液，冰上裂解30min；

（2）将（1）中的裂解混合物于低温离心机4℃、12,000×g离心15min，取上清，弃沉淀；

（3）利用BCA蛋白浓度试剂盒制作标准曲线和检测外泌体蛋白浓度，方法概述如下：

分别将20μL浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准品和20μL（2）中的上清液加入96孔板中，每组三次重复；配置并加入BCA工作液（A液：B液=50:1）至上述孔中，振荡混匀，37℃恒温箱孵育30min；利用全波长酶标仪测定A562的吸光度；利用不同浓度的蛋白标准品测得的吸光度，Excel绘制标准曲线，获得回归公式，并带入外泌体蛋白吸光值到以上公式，计算出外泌体蛋白浓度；

（4）变性：取40μL裂解后的混合液与10μL的5☓SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀后，100℃煮沸5min，获取变性蛋白；

（5）上样、电泳和转膜：打开购置的商品化12%预制胶，插入电泳槽，加满电泳缓冲液，将变性后的20μL蛋白样品加入电泳孔中，进行电泳；电泳完毕后取出电泳胶，浸泡于甲醇中活化10s，然后置于预冷的转膜缓冲液中，在垫子上依次垫海绵、三层滤纸、电泳胶，将膜盖于电泳胶上，在膜上盖三张滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，插入转膜槽中，打开电源，90V、60min恒压转膜；

（6）封闭：将转好的膜置于室温脱色摇床上，浸入5%的脱脂牛奶，封闭1h；

（7）一抗：将Calnexin、CD63、CD81及TSG101一抗浓储液和5%的脱脂牛奶按1:2000稀释后，4ºC孵育膜过夜；

（8）二抗：用1☓TBST在室温脱色摇床上将膜洗涤3次，每次5min，将二抗用1☓TBS按1：5000稀释，室温下孵育60min后，1☓TBST洗涤3次，每次5min；

（9）曝光：取出PVDF膜，沥干水分，蛋白面朝上平铺于保鲜膜上，将等体积混合的ECLA/B混合液滴加到膜上避光反应1min；将膜夹起移入塑封膜中，在此操作过程中蛋白面始终朝上；

（10）将膜置于成像仪中，曝光10s，调整好亮度和对比度，保存图片。

优选地，所述透射电镜型号为Hitachi 7700，所述滤纸型号为Whatman HC0002，所述纳米颗粒跟踪分析仪型号为Particle Metrix ZetaVIEW 17-310，所述全波长酶标仪型号为 Bio-Tek(Eon)，所述恒温箱为；所述成像仪型号为GE LAS4000。

优选地，所述蛋白裂解液规格为Beyotime/P0013，所述BCA蛋白浓度检测试剂盒规格为Beyotime/P0010S，所述5☓SDS-PAGE蛋白上样缓冲液规格为Beyotime/P0015，所述商品化12%预制胶规格为GenScript/M01210C，所述电泳缓冲液规格为GenScript/M00138，所述转膜缓冲液规格为GenScript/M00139，所述PVDF膜为MERCK MILLIPORE IPVH00010，所述5%的脱脂牛奶规格为Solarbio/D8340。

优选地，所述粒径分析鉴定中外泌体直径为30～150 nm。

优选地，所述电泳过程中浓缩胶设置电压60V、30min，分离胶设置为120V、60 min。

优选地，所述透射电镜型号为FEI Tecnai Spirit T12；所述滤纸型号为WhatmanHC0002，所述纳米颗粒跟踪分析仪型号为Particle Metrix ZetaVIEW 17-310，所述成像仪型号为GE LAS4000mini。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法，具有以下优点，

（1）本发明通过优化的方法分离得到的荷斯坦牛乳外泌体与传统超高速离心方法和商用试剂盒方法相比，增加了外泌体的获取量和浓度，减少了脂质和囊泡的含量，大大提高了外泌体的纯度，为提取高质量荷斯坦牛乳外泌体提供了参考依据；

（2）分别通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析仪以及蛋白免疫印迹的方法鉴定外泌体，分别从形状、粒径及特异性抗原方面鉴定，可最大限度保证外泌体分离结果的可靠性。

附图说明

图1为本发明的荷斯坦牛乳外泌体电镜图。

图2A为本发明外泌体粒径分布百分比和平均粒径值。

图2B为本发明外泌体粒径分布统计图。

图3A为本发明外泌体浓度值和检测颗粒数。

图3B为本发明外泌体颗粒二维散点图。

图4为本发明外泌体蛋白标准曲线图。

图5为本发明外泌体特异性蛋白表达图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明公开一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定方法

实施例中仪器设备型号：

所述低温冰箱型号为美的BCD-525WKPZM(E)，所述超低温冰箱型号为EppendorfCryoCube F570，所述低温离心机型号为Eppendorf 5810R，所述低温超速离心机型号为Beckman Optima L-100XP，所述透射电镜型号为Hitachi 7700，所述滤纸型号为WhatmanHC0002，所述纳米颗粒跟踪分析仪型号为Particle Metrix ZetaVIEW 17-310，所述全波长酶标仪型号为 Bio-Tek(Eon)，所述恒温箱为Thermo Fisher 3111；所述成像仪型号为GELAS4000。

实施例中试剂规格：

所述蛋白裂解液规格为Beyotime/P0013，所述BCA蛋白浓度检测试剂盒规格为Beyotime/P0010S，所述5☓SDS-PAGE蛋白上样缓冲液规格为Beyotime/P0015，所述商品化12%预制胶规格为GenScript/M01210C，所述电泳缓冲液规格为GenScript/M00138，所述转膜缓冲液规格为GenScript/M00139，所述PVDF膜为MERCK MILLIPORE IPVH00010，所述5%的脱脂牛奶规格为Solarbio/D8340，5%的脱脂牛奶采用TBST配制，所述一抗规格分别为CD63（Proteintech/25682-1-AP）、CD81（Proteintech/27855-1-AP）、TSG101（Proteintech/14497-1-AP）、Calnexin（Proteintech/10427-2-AP）。

实施例一荷斯坦牛乳外泌体分离的方法

包括荷斯坦牛乳样本采集和密度梯度超速离心分离外泌体，具体包括以下步骤：

A 荷斯坦牛乳样本采集

（1）乳样：挑选健康且处于泌乳期的荷斯坦牛，于晨间挤奶时，收集30mL乳汁，装入无菌的50mL尖底离心管内；

（2）保存：将收集的荷斯坦牛乳汁随冰袋一起带回实验室，保存于4℃低温冰箱，4小时内处理。

B 荷斯坦牛乳外泌体分离

（1）将A中收集的乳样于2000×g、4℃条件下低温离心10min，收集上层乳汁，弃下层沉淀，用以去除脂肪、细胞碎片等；

（2）将步骤（1）中离心后的上层乳汁转移至新的无菌尖底离心管中，于10000×g、4℃条件下低温离心45min，收集上层乳汁，弃下层沉淀，用以去除较大的囊泡等；

（3）将步骤（2）中离心后的上层乳汁转移至新的尖底离心管中，选择超速转子，在4℃、100,000×g条件下超速离心120min，弃上层液体，所得下层沉淀为初步分离的荷斯坦牛乳汁外泌体混合物；

（4）向步骤（3）中所获的沉淀中加入20mL 4℃预冷的1×PBS，重悬沉淀，再次4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀，重复3次，用于清洗初步分离的外泌体混合物；

（5）将步骤（4）中离心后的上清转移至新离心管中，选择超速转子，4℃、100,000×g条件下超速离心120min，去除上清，保留下层沉淀；

（6）重复步骤（5）1次；

（7）将步骤（6）中离心后的上清转移至新离心管中，选择超速转子，4℃、100,000×g条件下超速离心120min，去除上清，保留下层沉淀；

（8）将步骤（7）中所获的沉淀重悬于1mL预冷的PBS中，4℃低温保存；

（9）分别配制40%、20%、10%和5%的碘克沙醇，各取3.6mL并依次加入到超离管中，最后将步骤（8）中的1mL重悬液缓慢加在最上层，4℃，100,000 ×g，超速离心120 min，用以分离高纯度外泌体；

（10）离心后混合液分成12层，收集中间6～9层的液体，再次4℃，100,000 ×g，超速离心120min，去除上清，得到提纯后的牛乳外泌体；

（11）将步骤（10）所获外泌体，重悬于 100 μL 预冷的PBS中，并冻存于-80℃超低温冰箱中保存。

实施例二荷斯坦牛乳外泌体鉴定的方法之透射电镜（TEM）观察鉴定

（1）将实施例一中冻存于-80℃超低温冰箱的外泌体+PBS混合液取出，室温解冻至完全融化，取外泌体+PBS混合液10μL，滴加于100目的铜网上，静置1min，滤纸吸走浮液；

（2）在所述步骤（1）的铜网上，再次滴加10μL磷钨酸，静置1min，滤纸吸走浮液；

（3）常温干燥10min；

（4）电压选择100kv进行透射电镜成像检测并拍照保存，结果如图1所示：分离的外泌体呈圆形，如“杯盘”结构，直径集中为80nm左右。

实施例三荷斯坦牛乳外泌体鉴定的方法之粒径分析（NTA）鉴定

（1）将实施例一中冻存于-80℃超低温冰箱的外泌体+PBS混合液取出，冰上解冻至完全融化，取外泌体+PBS混合液10μL，加入1.9mL的1×PBS，稀释至工作浓度悬液；

（2）将步骤（1）中混合液转移至流式管中，通过纳米流式粒径分析仪实时地对悬液中直径为30～150nm外泌体和囊泡进行逐个成像和观察，并通过Zeta view 8.04.02软件计算出悬液中外泌体的粒径分布和浓度，结果如图2所示：牛乳外泌体平均粒径为73.82nm；如图3所示外泌体浓度为8.76E+9粒/mL。

实施例四荷斯坦牛乳外泌体鉴定的方法之Western blot分析鉴定

（1）外泌体蛋白样品制备：将冻存于-80℃超低温冰箱的外泌体取出，冰上解冻后，加入100μL RIAP蛋白裂解液，冰上裂解30min；

（2）离心：将（1）中的裂解混合物于低温离心机4℃、12,000×g离心15min，取上清，弃沉淀；

（3）蛋白标曲制作及蛋白浓度检测：分别将20μL浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准品和20μL裂解后的混合液加入96孔板中，每组三次重复；配置并加入BCA工作液（A液：B液=50:1）至上述孔中，振荡混匀，37℃恒温箱孵育30min；利用全波长酶标仪测定A562的吸光度；利用不同浓度的蛋白标准品测得的吸光度，Excel绘制标准曲线，结果如图4所示：

获得回归公式：y=0.4287x+0.0683，R

带入外泌体蛋白吸光值y=0.711到以上公式，计算得出：外泌体蛋白浓度

（4）变性：取40μL裂解后的混合液与10μL的5☓SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀后，100℃煮沸5min，获取变性蛋白；

（5）上样、电泳和转膜：打开购置的商品化12%预制胶，插入电泳槽，加满电泳缓冲液，取变性后的20μL蛋白样品加入电泳孔中，进行电泳；电泳完毕后取出电泳胶，浸泡于甲醇中活化10s，然后置于预冷的转膜缓冲液中，在垫子上依次垫海绵、三层滤纸、电泳胶，将膜盖于电泳胶上，在膜上盖三张滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，插入转膜槽中，打开电源，90V、60min恒压转膜；

（6）封闭：将转好的膜置于室温脱色摇床上，浸入5%的脱脂牛奶，封闭1h；

（7）一抗：将Calnexin、CD63、CD81及TSG101一抗浓储液和5%的脱脂牛奶按1:2000稀释后，4ºC孵育膜过夜；

（8）二抗：用1☓TBST在室温脱色摇床上将膜洗涤3次，每次5min，将二抗用1☓TBS按1：5000稀释，室温下孵育60min后，1☓TBST洗涤3次，每次5min；

（9）曝光：取出PVDF膜，沥干水分，蛋白面朝上平铺于保鲜膜上，将等体积混合的ECLA/B液混合液滴加到膜上避光反应1min；将膜夹起移入塑封膜中，在此操作过程中蛋白面始终朝上；

（10）将膜置于成像仪中，曝光10s，调整好亮度和对比度，保存图片，结果如图5所示：外泌体样本1,2,3可检测出特异性蛋白CD63、CD81及TSG101，检测不出Calnexin蛋白，而普通细胞样本（BMECs）只能检测出Calnexin蛋白，这说明所述方法提取的外泌体纯度良好。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。