一种兼具化疗增敏与化疗保护的抗肿瘤纳米药物及其制法

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤纳米药物及其制备方法，具体涉及一种近红外光照下CO与化疗药物的协同控释的抗肿瘤纳米药物及其制法及其制备方法。

背景技术

化疗作为目前应用广泛的一种肿瘤治疗手段，理论上可以在足够的药物剂量下实现肿瘤治愈，然而化疗药物的剂量限制性毒性严重限制了病人的最大耐受剂量，致使给药剂量无法达到治愈的需求，极大地限制了化疗的临床效果。因此，在提高化疗药物效用的同时降低药物的毒副作用，从而在病人耐受剂量限度内将化疗药物对肿瘤的效用提升到治愈限度之上，是实现化疗治愈肿瘤的关键。

探索增强化疗药物效用的主要手段有：（1）将治疗药物靶向递送到病灶部位，从而增大病灶部位与正常组织间的药物浓度差；（2）使用化疗增敏手段来增强化疗药物对肿瘤细胞的效用，包括抑制肿瘤细胞药物外排以提高药物的利用率、提高肿瘤细胞对药物的治疗敏感性以提高药物作用效果等。探索降低药物毒副作用的主要手段是：使用化疗保护手段来减弱药物对正常组织细胞的杀伤性。这些手段的应用在提升化疗效果方面取得了巨大的进展，然而与实现肿瘤治愈之间仍然存在着很大的差距。这是因为化疗增敏增强药物对增殖活跃细胞的杀伤性，化疗保护减弱药物对增殖活跃细胞的杀伤性，作用机制上的拮抗性限制了它们的联合使用。单独使用化疗增敏或化疗保护，不足以达到肿瘤化疗治愈的预期目标，甚至可能减弱另一方面的效果（化疗增敏可能加剧化疗药物对正常细胞的杀伤，化疗保护可能减弱化疗药物对肿瘤细胞的效用）。探索一种能够区别肿瘤细胞与正常细胞的纳米药物，辅以肿瘤细胞靶向，增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤性，减弱微量扩散到正常组织药物对正常细胞的杀伤性，同时从化疗增敏与化疗保护两个角度，提高化疗药物效用、病人最大耐受剂量，可实现化疗治愈肿瘤。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种同时具备肿瘤细胞化疗增敏与正常细胞化疗保护的抗肿瘤纳米药物；本发明的第二目的在于提供上述抗肿瘤纳米药物的制备方法。

技术方案：本发明的一种兼具化疗增敏与化疗保护的抗肿瘤纳米药物，由热响应性的两亲性共聚物以及共聚物包覆的一氧化碳控释材料和活性药物组成；所述热响应性的两亲性共聚物为一端呋喃功能化的疏水性共聚物与一端马来酰亚胺基功能化的聚乙二醇共价键连接的聚合物；所述一氧化碳控释材料为硫化铜纳米粒子接枝羰基锰的近红外光吸光材料；所述活性药物为具有肿瘤抑制作用的丝分裂阻断类化疗药物；所述热响应性的两亲性共聚物、一氧化碳控释材料和活性药物形成纳米粉末。

上述方案中，所述的疏水性聚合物包括聚己内酯，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物或聚乳酸的任一种，采用上述疏水性聚合物的原因是一方面它们具有优良的生物相容性，另一方面它们可以构成纳米药物的内核，并作为药物负载的场所；所述的活性药物包括阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的任一种；采用此类药物的原因它们虽然从理论上讲具有良好的肿瘤抑制效果，然而治疗效果却受限于其自身的剂量限制性毒性。

进一步地，所述一端呋喃功能化的疏水性共聚物与一端马来酰亚胺基功能化的聚乙二醇的分子量均为2K~20K Da；制备的纳米粉末尺寸为50~1000 nm，优选为100~200 nm。

本发明还保护一种兼具化疗增敏与化疗保护的抗肿瘤纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、一氧化碳控释材料的制备：将硫化铜纳米粒子溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入2-氨基乙硫醇，室温、避光条件下搅拌反应，离心去除上清液后重新分散在N,N-二甲基甲酰胺中，再加入2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸，N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温、避光条件下搅拌，然后在氮气保护下加入五羰基溴化锰，室温、避光条件下搅拌，离心去除上清液后，冻干，制成粉末状一氧化碳控释材料；

步骤二、热响应性的两亲性共聚物的制备：将疏水性共聚物溶于丙酮中，并加入碳酸钾、正四丁基溴化铵和二溴甲基呋喃，加热反应得到一端含有呋喃基的疏水性共聚物；然后将一端含有呋喃基的疏水性共聚物与马来酰亚胺基聚乙二醇加入到N,N-二甲基甲酰胺中，加热搅拌反应得到热响应性的两亲性共聚物PM-DA-PEG；

步骤三、将PM-DA-PEG、活性药物和一氧化碳控释材料溶于二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到去离子水中，超声乳化后，通过旋转蒸发仪除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到抗肿瘤纳米药物粉末。

进一步地，所述步骤一中，加入的硫化铜纳米粒子与2-氨基乙硫醇的质量比为（5~20）：1；加入的2-氨基乙硫醇、2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和五羰基溴化锰的摩尔比为1：（0.5~1.5）：（1~1.2）：（1~1.2）：（0.5~3）。

进一步地，所述步骤二中，加入的疏水性共聚物、碳酸钾、正四丁基溴化铵和二溴甲基呋喃的1：（1~1.2）：（1~1.2）：（1~1.2）；其中，疏水性共聚物包括聚己内酯，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物或聚乳酸的任一种。

进一步地，所述步骤二中，一端含有呋喃基的疏水性共聚物与马来酰亚胺基聚乙二醇的摩尔比为1：（1.1~1.5）；反应温度为20~45℃，反应时间为40~50 h。

进一步地，所述步骤三中，PM-DA-PEG、活性药物和一氧化碳控释材料的质量比为10：（2~5）：（2~5）；二氯甲烷与水的体积比为1：（5~20）。

本发明的反应原理为：

硫化铜纳米粒子可以与2-氨基乙硫醇中的巯基共价结合，形成稳定的Cu-S键，使其表面存在大量氨基，进而通过氨基与2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸中的羧基反应，引入联吡啶结构，此结果可以与五羰基溴化锰作用，取代两个羰基形成螯合物，其结构如图1所示。其中，疏水性共聚物与二溴甲基呋喃反应，在其一端进行呋喃基化得到一端含有呋喃基的PM-Fur，然后PM-Fur与马来酰亚胺基聚乙二醇（PEG-Mal）进行迪尔斯-阿尔德反应，使得呋喃基团与马来酰亚胺基进一步进行共价键聚合，得到热响应性两亲性共聚物PM-DA-PEG，由于呋喃基团与马来酰亚胺基共价结合形成DA结构，DA结构是一种亚稳定结构，它能够在温度高于60 ℃时分解。其次，本发明采用硫化铜纳米粒子作为一氧化碳控释材料的改性基底，这是因为硫化铜纳米粒子在近红外光照下，表面的基态电子被激发到激发态，在激发态电子返回基态时，既可以产生激发态电子被周围基团利用，也会释放热量。激发态电子会沿联吡啶结构传递给羰基锰，从而诱发其释放CO；热量可以作为纳米药物的药物控释开关。

纳米药物的响应机制如图1所示，当纳米药物在近红外光照射后，硫化铜既可以产生激发态电子，经联吡啶结构传递，激发羰基锰释放出CO；硫化铜又可以释放热量，使PM-DA-PEG裂解，纳米药物解体，从而释放出所包覆的化疗药物。因此，本发明所提供的纳米药物可以实现单一近红外光照下，CO与化疗药物的协同递释。由于CO是一种兼具肿瘤化疗增敏与化疗保护的气体小分子，且其在细胞内的存留时间较短，因此本发明设计的同时释放CO和热量的硫化铜基底材料，结合具有热响应两亲性共聚物组装成的纳米压物，可以实现CO与化疗药物的同时释放，从而最大化地充分发挥CO的功能，提高肿瘤治疗效果。

有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著优点：发明所制备的药物可以同时释放CO与化疗药物，释放的CO可以针对肿瘤细胞与正常细胞在线粒体上的差异，区别对待肿瘤细胞与正常细胞，在肿瘤细胞内会因CO的作用而提升化疗药物的作用效果，在正常细胞内会因CO的作用而减弱药物的毒副作用，实现肿瘤细胞化疗增敏且对正常细胞化疗保护，从而可以大大提升化疗的治疗效果。

附图说明

图1为本发明的制备原理示意图；

图2为实施例1制备的纳米药物分别经近红外光照10分钟和未经近红外光照后的光学 照片和透射电子显微镜照片；

图3为实施例1制备的纳米药物在经近红外光照10分钟(2)和未经照射(1)后的CO释放曲线；

图4为实施例1制备的纳米药物在经近红外光照10分钟(2)和未经照射(1)后的化疗药物释放曲线；

图5为实施例1制备的纳米药物对肿瘤细胞的抑制效果；

图6为实施例1制备的纳米药物对正常细胞的抑制效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1）一氧化碳控释材料的制备：将100mg硫化铜纳米粒子溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入一定量的0.1 mmol 2-氨基乙硫醇（HS-CH

2）热响应性的两亲性共聚物的制备：取0.5 mmol的聚己内酯（PCL）（分子量为5KDa）溶解于丙酮中，然后加入等摩尔量的碳酸钾、正四丁基溴化铵以及二溴甲基呋喃，在65℃下加热回流反应48小时，得到一端含有呋喃基的聚己内酯PCL-Fur；再取0.1 mol的PCL-Fur与0.11 mol的马来酰亚胺基聚乙二醇（分子量为5K Da），加入到20 mL 的DMF溶剂中，在25℃下加热搅拌48小时，得到热响应性的两亲性共聚物PCL-DA-PEG；

3）纳米药物的制备：取50 mg PCL-DA-PEG、5 mg阿霉素、3 mg COPIRS粉末溶于5mL二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到10 mL去离子水中，超声乳化后，通过旋转蒸发仪除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到尺寸为150 nm的纳米药物粉末。

实施例2

1）一氧化碳控释材料的制备：将100mg硫化铜纳米粒子溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入一定量的0.15 mmol 2-氨基乙硫醇（HS-CH

2）热响应性的两亲性共聚物的制备：取1 mmol的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）（分子量为5K Da）溶解于丙酮中，然后加入1.1倍摩尔量的碳酸钾、正四丁基溴化铵以及二溴甲基呋喃，在65℃下加热回流反应48小时，得到一端含有呋喃基的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物PLGA -Fur；再取0.1 mol的PLGA -Fur与0.12 mol的马来酰亚胺基聚乙二醇（分子量为5K Da），加入到20 mL 的DMF溶剂中，在25℃下加热搅拌48小时，得到热响应性的两亲性共聚物PLGA -DA-PEG；

3）纳米药物的制备：取50 mg PLGA -DA-PEG、5 mg紫杉醇、5 mg COPIRS粉末溶于5mL二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到60 mL去离子水中，超声乳化后，通过旋转蒸发仪除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到尺寸为80 nm的纳米药物粉末。

实施例3

1）一氧化碳控释材料的制备：将70mg硫化铜纳米粒子溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入一定量的0.1 mmol 2-氨基乙硫醇（HS-CH

2）热响应性的两亲性共聚物的制备：取1 mmol的聚乳酸（PLA）（分子量为2K Da）溶解于丙酮中，然后加入1.2倍摩尔量的碳酸钾、正四丁基溴化铵以及二溴甲基呋喃，在65℃下加热回流反应48小时，得到一端含有呋喃基的聚乳酸PLA -Fur；再取0.1 mol的PLA -Fur与0.15 mol的马来酰亚胺基聚乙二醇（分子量为2K Da），加入到20 mL 的DMF溶剂中，在25℃下加热搅拌48小时，得到热响应性的两亲性共聚物PLA -DA-PEG；

3）纳米药物的制备：取50 mg PLA -DA-PEG、3 mg阿霉素、3 mg COPIRS粉末溶于5mL二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到40 mL去离子水中，超声乳化后，通过旋转蒸发仪除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到尺寸为250 nm的纳米药物粉末。

性能对比测试

实施例4

将实施例1中制备的纳米药物溶于水后，分成两份，一份使用近红外光照射10分钟，另一份不照射，对其进行观察，拍照，并制样通过透射电子显微镜对其进行观察。结果如图1所示。经近红外光照射（ⅱ）组在照射10 分钟后即出现浑浊，静置24小时后完全沉淀，而未经照射组（ⅰ）在静置24 h后仍然澄清。参见图2，从TEM图像中可以发现，纳米药物粒径约为100 nm，内部的高衬度黑的为硫化铜纳米粒子，呈现硫化铜被包覆在纳米粒子内的结构形式；经近红外光照射的纳米药物在经历10 min照射后，硫化铜随机分布，已经不再具备纳米粒子包覆硫化铜的结构形式，说明纳米药物完全裂解；而未经照射的在静置24 h后形貌几乎没有发生变化，仍然具备纳米粒子包覆硫化铜结构。综上可知，实施例1制备的纳米药物能够在近红外光照下完全解体，释放出所包覆的纳米药物。

实施例5

将实施例1中所制备纳米药物，分别测试其阿霉素（Dox）的释放速率和CO的控释速率，结果如图3和图4所示。经历近红外光照10 min后，CO与Dox都几乎完全释放出来，而未经光照组的释放速率都相对缓慢。而且从图3和图4的比较可以看出，在光照10min左右时，CO的释放总量约为90%，Dox的释放总量为55%，因检测方式的差异，CO的量可以直接检测，而释放出的Dox需要扩散出半透膜，有一定的滞后性，结合Dox后续的释放量以及图2的结构，可以说明Dox与CO的释放速率比较接近，说明了CO与化疗药物可以协同控释。

实施例6

使用实施1制备的纳米药物分布与肿瘤细胞及正常细胞共培养24 h后，检测细胞的存活率，来分析纳米药物对肿瘤细胞和正常细胞的作用效果。参见图5，在肿瘤细胞中，纳米药物（CO&Dox@NPs）经光照后对肿瘤细胞有极大的杀伤性，而使用不能释放CO的CuS代替COPIRS构成的纳米药物（CuS&Dox@NPs）对细胞的杀伤性大打折扣，即有CO存在可以提升化疗药物对肿瘤细胞的杀伤性。参见图6，在正常细胞中，纳米药物（CO&Dox@NPs）经光照后对正常细胞有的杀伤性较弱，而CuS&Dox@NPs对正常细胞的杀伤性却更大，即有CO的存在可以降低化疗药物对正常细胞的毒性。因此，本发明所制备的纳米药物可以兼具化疗增敏与化疗保护。