一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及抗生素的检测技术领域，特别是涉及一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法。

背景技术

目前抗生素类药物应用广泛，主要应用方式是作为兽药，其检测主要集中在动物源性食品中。主要的检测方法有高效液相色谱法，高效液相色谱-串联质谱法，毛细管电泳法，酶联免疫法。

抗生素菌渣是发酵生产抗生素过程中的副产物，主要由发酵菌丝体、糖类、粗蛋白、少量未利用完全的无机盐以及未提取完全的抗生素和其代谢产物组成。外观呈豆腐渣样，气味因培养的菌类不同而异，含水率一般较高，堆积存放容易二次发酵产生臭味气体。在利用微生物发酵生产林可霉素的过程中由于提取率低菌渣中残留大量的林可霉素，而且极难降解，造成严重的环境污染。据有关资料统计，我国林可霉素年排放量约为数百万吨，目前主要处理方式是占用土地堆放。林可霉素菌渣外观呈土青色，含水率在70-85％之间，堆放处理不仅造成资源浪费，而且经雨水冲刷后还会污染土壤、地下水等生态环境。过去一直对菌渣采用干燥加工处理后作为饲料或饲料添加剂使用。但是，近期研究结果发现，菌渣中残留的抗生素会在动物体内积累，人类食用此类动物源性食品会对身体造成危害。而且动物长期使用抗生素，会对其产生抗药性，诱导产生耐药细菌，破坏环境的微生态平衡。2008年中国将抗生素菌渣列入危险废物的名单，抗生素菌渣未经无害化处理严禁二次利用。建立稳定、灵敏、高效的菌渣林可霉素残留量检测方法，为菌渣污染控制标准的制定奠定基础。

抗生素在菌丝体残留量的检测在国外研究比较早，主要是检测青霉素发酵中间产物中青霉素含量。目前国内报道的检测菌渣中林可霉素的方法是微生物培养法，此方法的灵敏度均较低，而且方法不完善，方法的准确度和精密度以及检出限均有待考量，不能满足现代残留检测分析的要求。因此，准确可靠的残留检测方法还有待探讨。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术中无法快速/准确检测林可霉素菌渣中林可霉素的缺陷，没有一种有效解决基质效应的影响的问题，而提供一种林可霉素菌渣中林可霉素提取且测定残留量的方法，以期为探明林可霉素菌渣中林可霉素的残留及其转化提供方法依据。

本发明的一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有林可霉素的菌渣，加入体积百分含量为0.1％～0.15％的氨化乙腈提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；

2)称取PSA、C

二、标准曲线绘制：

用甲醇将林可霉素标准贮备液稀释成质量浓度为10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L标准工作溶液；采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准品工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素素残留量；

色谱条件：色谱柱：AglientExtend-C

本发明包含以下有益效果:

应用本方法进行林可霉素菌渣中林可霉素残留的测定，操作简便，准确度高，林可霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的林可霉素菌渣，其回收率、灵敏度、检出限等在各批次菌渣中都有较好的准确度和精密度。

通过本发明的方法可以有效地从菌渣中提取林可霉素，尽最大可能降低菌渣中其他杂质对后续检测的影响，从而提高检测的准确度

(1)本发明首次较完善的提出超声辅助结合分散固相萃取法提取林可霉素菌渣中林可霉素的高效液相色谱法：第一步超声辅助提取林可霉素菌渣中的林可霉素，第二步分散固相萃取技术应用于提取液净化，第三步高效液相色谱-紫外检测器用于林可霉素含量的测定，此方法简单快速，准确可靠。

(2)本发明灵敏度高，可满足我国对于林可霉素在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为林可霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。

本发明方法林可霉素在100～800mg/kg添加浓度水平上回收率为82％～115％。定性检测限为0.027mg/kg，定量检测限为0.089mg/kg。日内变异系数为3％～9％，小于10％；日间变异系数为7.5％～12％，小于15％。

附图说明

图1为林可霉素标准曲线；

图2为浓度100mg/L林可霉素的标准色谱图；

图3为新鲜林可霉素菌渣中残留林可霉素色谱图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有林可霉素的菌渣，加入提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；

2)称取PSA、C

二、标准曲线绘制：

用甲醇将林可霉素标准贮备液稀释成质量浓度为10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L标准工作溶液；采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准品工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素素残留量；

色谱条件：色谱柱：AglientExtend-C

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：林可霉素菌渣与提取剂的质量体积比为1g：5～15mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：林可霉素菌渣与提取剂的质量体积比为1g：10mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：提取剂为体积百分含量为0.1％～0.15％的氨化乙腈。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：提取剂为体积百分含量为0.12％的氨化乙腈。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：PSA、C

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：PSA、C

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中无水Na

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：菌渣中林可霉素残留量为800～850mg/Kg。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：菌渣中林可霉素残留量为800～820mg/Kg。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：该方法的定性检测限为0.027mg/kg，定量检测限为0.089mg/kg。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的一种菌渣中林可霉素残留效价的检测方法，它包括如下步骤：

仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为AglientExtend-C

1)供试品样品制备：称取样品1g(精确至0.0001g)，于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL提取剂(012％氨化乙腈)，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液。精确称取50mgPSA、94mgC

2)标准曲线绘制：用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L和400.0mg/L标准溶液，采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以对应的标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液各10μL注入液相色谱仪中，进行分析检测。

4)计算：计算分离出的林可霉素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得处林可霉素含量。

5)方法回收率、检测限和定量限：采用加标回收法检测方法的回收率，向菌渣中添加100、400、和800mg/kg的林可霉素标准品溶液，用上述方法检测林可霉素含量，计算本方法的回收率。以3倍信噪比确定检测限，以10倍信噪比确定定量限。实验结果表明本方法的回收率为82％～115％，定性检测限为0.027mg/kg，定量检测限0.089mg/kg。

实施例2

本实施例的菌渣中残留林可霉素检测方法，包含以下步骤：

仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为AglientExtend-C

1)供试品样品制备：称取样品1g(精确至0.0001g)，于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL提取剂(012％氨化乙腈)，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液。精确称取50mgPSA、94mgC

2)标准曲线绘制：用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为10.00mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L和400.0mg/L标准溶液，采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以对应的标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液个10μL注入液相色谱仪中，进行分析检测。

4)计算：计算分离出的林可霉素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得处林可霉素含量。

5)方法回收率、检测限和定量限：采用加标回收法检测方法的回收率，向菌渣中添加100、400、和800mg/kg的林可霉素标准品溶液,用上述方法检测林可霉素含量，计算本方法的回收率。以3倍信噪比确定检测限，以10倍信噪比确定定量限。实验结果表明本方法的回收率为82％～115％，定性检测限为0.027mg/kg，定量检测限为0.089mg/kg。

方法验证：

在林可霉素菌渣样品中的加标浓度分别为100、400、800mg/kg。采用本实验方法进行分析检测，实验室重复进行3次，求得的回收率及其标准偏差，样品中林可霉素的含量按公式(1)计算。

式中：X—样品中林可霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

C—样品溶液中林可霉素的浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

m—样品质量，单位为克(g)；

V—样品溶液体积，单位为毫升(mL)

本实施例方法林可霉素在100～800mg/kg添加浓度水平上回收率为82％～115％。定性检测限为0.027mg/kg，定量检测限为0.089mg/kg。日内变异系数为3％～9％，小于10％；日间变异系数为7.5％～12％，小于15％。