一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜及其制备方法

技术领域

本发明属于抗菌食品包装领域，具体涉及到一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜及其制备方法。

背景技术

抗菌包装对于有效防止食品腐烂具有重要的意义。目前，大多数抗菌活性包装都是将抗菌剂直接添加或直接负载到包装材料中，抑制微生物滋生，延长食品货架期。目前食品包装中使用的抗菌剂主要分为合成抗菌剂和天然抗菌剂。合成抗菌剂主要有Ag、ZnO、季铵盐等，但是这些合成抗菌剂往往存在毒性大或成本高等缺点，并且添加到包装材料中对人类的健康也存在潜在的危害。天然抗菌剂主要来源于食物或植物，包括抗菌精油、植物提取物、壳聚糖等，这些抗菌剂具有很好的生物相容性，不会对人类健康和环境造成危害。其中抗菌精油在食品包装中应用广泛，但是精油存在易挥发和分解，不溶于水，产生刺激性气味等缺点，限制了其发挥有效作用。因此，合理设计缓释以及控释抗菌精油释放的活性包装材料受到研究者们的广泛关注。

静电纺丝技术是一种简便、高效、低成本的制备纳米纤维的技术。利用静电纺丝制备的纳米纤维直径在5-1000nm，具有比表面积大、孔隙率和负载率高、结构可调以及良好的机械性能等特点，在生物医学、纺织品、过滤材料、能源和食品包装等领域具有广阔的应用前景。静电纺丝技术不仅可以制备单轴的一级结构纳米纤维，也可以制备核壳、多轴和多孔等二级结构纳米纤维，进一步拓展了其在各种领域的应用。

肉桂精油是从植物提取的天然精油，具有良好的抗菌性和抗氧化活性，是一种安全的食品添加剂。目前大多数活性包装材料都是通过静电纺丝技术、流延成膜法或者微胶囊的形式将肉桂精油进行包裹或者掺杂，达到缓释的目的。迄今为止，虽然这些载体能够防止肉桂精油过快释放，延长食品货架期，但是在包装环境中仍然不能达到可控释放的目的，所以刺激响应控制释放体系，尤其是利用细菌自身产生的物质刺激抗菌剂释放实现抗菌保鲜的目的，在食品包装领域具有很大的研究价值和意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜及其制备方法，用于果蔬保鲜。本发明所述方法制备聚乳酸多孔纳米纤维，然后将纳米纤维改性后负载抗菌剂并通过静电组装吸附果胶涂层，利用微生物自身产生的果胶酶分解果胶从而刺激并控制抗菌剂的释放用于食品活性包装。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜的制备方法，将多孔聚乳酸纳米纤维用聚乙烯亚胺改性，得到带正电的聚乙烯亚胺修饰的多孔聚乳酸纳米纤维(即PLA-PEI多孔纳米纤维)，通过物理吸附方法负载肉桂精油，然后利用静电作用组装果胶涂层，得到果胶酶特定刺激响应释放肉桂精油的微生物自身抑制保鲜包装膜，即CEO@PLA-PEI-pectin复合抗菌膜。

进一步地，所述方法具体包括以下步骤：

(1)制备多孔聚乳酸纳米纤维；

(2)将多孔聚乳酸纳米纤维膜清洗，然后进行碱处理；

(3)制备聚乙烯亚胺修饰的多孔聚乳酸纳米纤维；

(4)将聚乙烯亚胺修饰的多孔聚乳酸纳米纤维在肉桂精油的乙醇溶液中振荡一定时间，用乙醇和水清洗，冷冻干燥，得到负载抗菌剂的氨基化多孔纳米纤维；

(5)将负载抗菌剂的氨基化多孔纳米纤维在果胶溶液中浸泡，果胶溶液通过静电组装将多孔纤维的孔洞覆盖，去除未吸附的果胶，干燥，得到果胶包封的负载抗菌剂的多孔纳米纤维，即获得果胶酶特定刺激响应释放肉桂精油的微生物自身抑制保鲜包装膜。

进一步地，步骤(1)制备多孔聚乳酸纳米纤维的具体步骤为：将聚乳酸颗粒溶于二氯甲烷室温下搅拌，制备成聚乳酸静电纺丝溶液，将聚乳酸静电纺丝溶液倒入注射器，控制静电纺丝条件，得到多孔聚乳酸纳米纤维，置于通风橱晾干备用。

优选地，具体步骤为：将1.0g聚乳酸颗粒溶于10mL二氯甲烷(DCM)，得到10％的聚乳酸纺丝溶液，调整环境湿度为50％～80％，将溶液倒入20mL注射器中，静电纺丝设备接入电压为25kV，流速为1.0mL/h，接收距离为15-18cm，制备得到多孔纳米纤维，置于通风橱晾干备用。

进一步地，所述步骤(2)具体为：将多孔聚乳酸纳米纤维膜预先在30％～60％的乙醇水溶液中浸泡20～30min，除去纤维膜表面的杂质，然后在0.1～0.2M的NaOH溶液中50～60℃下浸泡0.5～1.0h。

进一步地，所述步骤(3)具体为：将步骤(2)中NaOH处理过的纳米纤维用EDC/NHS混合溶液活化，EDC/NHS混合溶液中，EDC的浓度为6.0～9.0mg/mL，NHS的浓度为4.0～6.0mg/mL，室温下缓慢搅拌6～12h，水洗，除去未反应的EDC/NHS，获得活化羧基的纳米纤维，将活化羧基的纳米纤维浸泡在聚乙烯亚胺溶液中振荡1～5h(25℃,100rpm)，水洗除去未反应的PEI(聚乙烯亚胺)，冷冻干燥，制备获得聚乙烯亚胺修饰的聚乳酸多孔纳米纤维。

进一步地，所述步骤(4)具体为：通过物理吸附的方法将肉桂精油吸附到聚乙烯亚胺修饰的聚乳酸多孔纳米纤维的孔洞中，将50mg纳米纤维膜浸泡在肉桂精油浓度为50～200mg/mL的乙醇溶液中，摇床震荡过夜，取出，用乙醇和去离子水洗，优选为3次，冷冻干燥。

进一步地，所述步骤(5)具体为：将果胶粉末溶于去离子水，65℃加热搅拌，制备获得4mg/mL的果胶溶液；

本发明提供的制备方法利用静电纺丝技术，通过控制和选择合适的纺丝液组成配比和溶剂，制备了多孔聚乳酸纳米纤维，利用聚乙烯亚胺对纳米纤维进行氨基化改性使其带正电，通过物理吸附负载抗菌肉桂精油，然后利用静电组装涂覆果胶涂层避免肉桂精油过快释放。

一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜，所述保鲜膜包括聚乙烯亚胺修饰的多孔聚乳酸纳米纤维、通过物理吸附方法在聚乙烯亚胺修饰的多孔聚乳酸纳米纤维中负载的具有抗菌作用的肉桂精油、避免肉桂精油过快释放的在最外层涂覆的果胶涂层。

本发明与其他果蔬保鲜包装材料相比，优势在于：

(1)本发明所提供的保鲜膜通过表面修饰和电荷相互作用，以果胶作为多孔纳米纤维孔洞的覆盖层可以将抗菌剂(肉桂精油)包封在纳米纤维中不会提前释放出来，从而可以提高使用时间和效果。更重要的是当微生物侵染果蔬时自身会分泌大量的果胶酶，可以将保护层(果胶层)分解，使抗菌剂释放出来作用于微生物，实现微生物智能自身抑制作用。

(2)本发明所述方法利用聚乙烯亚胺修饰的聚乳酸多孔纳米纤维膜作为抗菌剂载体，聚乙烯亚胺修饰的聚乳酸多孔纳米纤维膜具有高孔隙率和高负载率，可以提高抗菌剂的负载量，延长有效使用时间。

(3)本发明选用的基材为聚乳酸和果胶，聚乳酸具有很好的生物可降解性，果胶是一种来源于水果的多糖，天然无毒、可食用以及生物相容性好。氨基化之后的聚乳酸多孔纳米纤维也具有良好的抑菌活性，实现了协同抑菌，增强了抗菌效果。

(4)本发明制备具有特定结构的多孔聚乳酸纳米纤维膜，方法简单高效、成本低、可操作性强，是一种绿色可持续方法。

(5)本发明制备的果胶涂层的聚乳酸多孔纳米纤维可以在微生物分泌的果胶酶刺激下分解果胶释放肉桂精油,相比于其他缓释体系，本发明具有可控释放抗菌剂的效果，具体原理为：本发明提供的保鲜膜属于刺激响应释放抗菌剂纳米纤维材料在食品包装领域的应用，特别涉及到制备可降解的多孔聚乳酸纳米纤维，将聚乳酸多孔纳米纤维进行氨基化改性后负载肉桂精油并通过静电相互作用吸附带负电的果胶涂层对多孔纳米纤维的“孔洞”进行“封堵”，保护抗菌剂。本发明制备的多孔聚乳酸纳米纤维膜具有很好的生物可降解性和生物安全性，并且具有非常高的孔隙率和高载药吸附量。本发明经多步制备的带正电的PLA-PEI改性多孔纳米纤维膜，外层的果胶涂层能够将抗菌剂进行包封，避免了抗菌剂的过早或过快释放，明显提高抗菌剂的利用效率。本发明制备的刺激响应抗菌包装膜是利用包装环境中微生物自身产生的果胶酶将果胶保护层分解，使抗菌精油从载体中释放出来，不需要外部的刺激因素，实现了抗菌剂的可控释放以及在食物特定位点的杀菌行为。

附图说明

图1a-c是本发明实施例中聚乳酸多孔纳米纤维改性之前和改性之后的形貌图；

图2是本发明实施例中不同PEI修饰的时间下聚乳酸多孔纳米纤维膜的接触角；

图3是本发明实施例中聚乳酸纳米纤维改性之前和改性之后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果；

图4是本发明实施例中聚乳酸纳米纤维改性之前和改性之后对黑曲霉的抑菌效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜的制备方法，具体步骤为：

(1)将1.0g聚乳酸颗粒溶于10mL二氯甲烷(DCM)，得到10％的聚乳酸纺丝溶液，调整环境湿度分别为20％,50％,80％，将溶液注入20mL注射器中，静电纺丝电压为25kV，流速为1.0mL/h，接收距离为15cm，制备得到多孔PLA纳米纤维，即多孔聚乳酸纳米纤维，根据扫描电镜图观察纤维形貌，当静电纺丝环境湿度为80％时，纤维的成孔率最高，孔更均匀，纤维形貌如图1a所示。

(2)将多孔聚乳酸纳米纤维膜预先在50％乙醇水溶液中浸泡，除去纤维膜表面的杂质，然后在0.2M的NaOH溶液中浸泡60min(50℃)。

(3)将NaOH处理过的纳米纤维用EDC/NHS混合溶液活化，，EDC/NHS混合溶液中，EDC的浓度为6mg/mL,NHS的浓度为4mg/mL，室温下缓慢搅拌12h，水洗3次，除去未反应的EDC/NHS，获得活化羧基的纳米纤维，将活化羧基的纳米纤维浸泡在10mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中分别振荡5h(25℃，100rpm)，水洗3次，除去未反应的PEI，冷冻干燥，最终得到PLA-PEI纳米纤维，即得聚乙烯亚胺修饰的聚乳酸多孔纳米纤维。

(4)通过物理吸附的方法将肉桂醛吸附到PLA-PEI纳米纤维的孔洞中，然后将50mg纳米纤维膜浸泡在50mg/mL的乙醇溶液中，摇床震荡12h，取出，用乙醇和去离子水洗2次，冷冻干燥，最终得到CEO@PLA-PEI纳米纤维。

(5)果胶粉末溶于去离子水，65℃加热搅拌5h，配成4mg/mL的果胶溶液，将负载肉桂醛的纳米纤维膜在果胶溶液中浸泡1h，水洗3次，去除未吸附的果胶，冷冻干燥，得到果胶包封的负载抗菌剂的多孔纳米纤维，即获得果胶酶特定刺激响应释放肉桂精油的微生物自身抑制保鲜包装膜；其中，当果胶溶液浓度为4mg/mL时，果胶涂层能够把多孔纤维的孔洞覆盖并且涂层不会因为太厚而难以释放抗菌剂。

实施例2

一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜的制备方法，具体步骤为：

(1)将1.0g聚乳酸颗粒溶于10mL二氯甲烷，得到10％的聚乳酸纺丝溶液，调整环境湿度为80％，将溶液注入20mL注射器中，静电纺丝电压为25kV，流速为1.0mL/h，接收距离为15cm，制备得到多孔聚乳酸纳米纤维。

(2)将多孔聚乳酸纳米纤维膜预先在50％乙醇水溶液中浸泡，除去纤维膜表面的杂质，然后在0.2M的NaOH溶液中浸泡10min,20min,30min,40min,50min,60min,70min,80min,90min(50℃)，当用NaOH处理时间为60min时，纤维依然保持了完整的形貌，当处理时间超过60min，纤维形貌受损。

(3)将NaOH处理过的纳米纤维在EDC/NHS混合溶液中活化，EDC/NHS混合溶液中EDC的浓度为6mg/mL,NHS的浓度为4mg/mL，室温下缓慢搅拌12h，水洗3次，除去未反应的EDC/NHS，获得活化羧基的纳米纤维。将活化羧基的纳米纤维浸泡在10mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中分别振荡5h(25℃，100rpm)，水洗3次，除去未反应的PEI，冷冻干燥，最终得到PLA-PEI纳米纤维，即得到聚乙烯亚胺修饰的聚乳酸多孔纳米纤维。

(4)通过物理吸附的方法将肉桂醛吸附到PLA-PEI纳米纤维的孔洞中，将50mg纳米纤维膜浸泡在50mg/mL的乙醇溶液中，摇床震荡12h，取出，用乙醇和去离子水洗2次，冷冻干燥，最终得到CEO@PLA-PEI纳米纤维(即果胶酶特定刺激响应释放肉桂精油的微生物自身抑制保鲜包装膜)。

(5)果胶粉末溶于去离子水，65℃加热搅拌5h，配成4mg/mL的果胶溶液，将负载肉桂醛的纳米纤维膜在果胶溶液中浸泡1h，水洗3次，去除未吸附的果胶，冷冻干燥，最终得到CEO@PLA-PEI-pectin复合膜。

实施例3

一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜的制备方法，具体步骤为：

(1)将1.0g聚乳酸颗粒溶于10mL二氯甲烷(DCM)，得到10％的聚乳酸纺丝溶液，调整环境湿度为80％，将溶液注入20mL注射器中，静电纺丝电压为25kV，流速为1.0mL/h，接收距离为15cm，制备得到多孔PLA纳米纤维。

(2)将多孔聚乳酸纳米纤维膜预先在50％乙醇水溶液中浸泡，除去纤维膜表面的杂质，然后在0.2M的NaOH溶液中浸泡60min(50℃)。

(3)将NaOH处理过的纳米纤维在EDC/NHS混合溶液中活化，EDC/NHS混合溶液中，EDC的浓度为6mg/mL,NHS的浓度为4mg/mL，室温下缓慢搅拌12h，水洗3次，除去未反应的EDC/NHS。将活化羧基的纳米纤维浸泡在10mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中分别振荡1h,3h,5h(25℃，100rpm)，水洗3次，除去未反应的PEI，冷冻干燥,，得到PLA-PEI纳米纤维，氨基化处理时间为5h时，纤维形貌保持相对完整，时间大于5，则会胺解过度，纤维形貌如图1b所示。根据不同胺解时间测得的接触角如图2所示，随着PEI修饰的时间增加，纳米纤维表面的氨基增多，纳米纤维膜的接触角更小，亲水性更好。

(4)通过物理吸附的方法将肉桂精油吸附到多孔纳米纤维的孔洞中，将50mg纳米纤维膜浸泡在50mg/mL的乙醇溶液中，摇床震荡12h，取出，用乙醇和去离子水洗2次，冷冻干燥，最终得到CEO@PLA-PEI纳米纤维。

(5)果胶粉末溶于去离子水，65℃加热搅拌5h，配成4mg/mL的果胶溶液，将负载肉桂精油的纳米纤维膜在果胶溶液中浸泡1h，水洗3次，去除未吸附的果胶，冷冻干燥，最终得到CEO@PLA-PEI-pectin复合纳米纤维膜。

实施例4

一种具有微生物智能自身抑制作用的保鲜膜的制备方法，具体步骤为：

(1)将1.0g聚乳酸颗粒溶于10mL二氯甲烷(DCM)，得到10％的聚乳酸纺丝溶液，调整环境湿度为80％，将溶液注入20mL注射器中，静电纺丝电压为25kV，流速为1.0mL/h，接收距离为15cm，制备得到多孔PLA纳米纤维。

(2)将多孔聚乳酸纳米纤维膜预先在50％乙醇水溶液中浸泡，除去纤维膜表面的杂质，然后在0.2M的NaOH溶液中浸泡60min(50℃)。

(3)将NaOH处理过的纳米纤维用EDC/NHS混合溶液活化，EDC/NHS混合溶液中，EDC的浓度为6mg/mL,NHS的浓度为4mg/mL，室温下缓慢搅拌12h，水洗3次，除去未反应的EDC/NHS。将活化羧基的纳米纤维浸泡在10mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中分别振荡5h(25℃，100rpm)，水洗3次，除去未反应的PEI，冷冻干燥，最终得到PLA-PEI纳米纤维。

(4)通过物理吸附的方法将肉桂醛吸附到多孔纳米纤维的孔洞中，将50mg纳米纤维膜浸泡在50mg/mL的乙醇溶液中，摇床震荡12h，取出，用乙醇和去离子水洗2次，冷冻干燥，最终得到CEO@PLA-PEI纳米纤维。

(5)果胶粉末溶于去离子水，65℃加热搅拌5h，配成2mg/mL,4mg/mL,8mg/mL的果胶溶液，将负载肉桂精油的纳米纤维膜在果胶溶液中浸泡1h，水洗3次，去除未吸附的果胶，冷冻干燥，当果胶溶液浓度为4mg/mL时，果胶涂层能够把多孔纤维的孔洞覆盖并且涂层不会因为太厚而难以释放抗菌剂，如图1c所示。

研究果胶酶刺激响应释放肉桂精油的多孔纳米纤维膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果，如图3所示。抑菌实验分为四组，分别为没有加材料的空白组以及分别用纯PLA多孔纳米纤维，氨基化的PLA纳米纤维(PLA-PEI)和果胶涂层的负载肉桂精油的纳米纤维膜(CEO@PLA-PEI-pectin)处理的菌悬液。实验结果发现空白组和PLA组都长满了菌落，氨基化之后的纳米纤维具有很好的抑菌效果，这是因为氨基化之后纤维表面带正电荷，可以与细菌细胞内带负电的物质(主要是蛋白质和核酸)结合，抑制蛋白质的合成，正电荷也可以与细菌细胞膜上带负电的物质相互作用，改变微生物细胞膜的通透性，引起微生物死亡。有果胶涂层的抗菌性相比于没有果胶涂层的抗菌性差一些，这是因为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分泌的果胶酶非常少，不足以全部把果胶分解，果胶涂层对抗菌剂起到一定的保护作用。从抑菌结果看，纳米纤维膜的抑菌性对革兰氏阳性菌的效果比革兰氏阴性菌的效果更好。

进一步地研究果胶酶刺激响应释放肉桂精油的多孔纳米纤维膜对黑曲霉的抑菌效果，如图4所示。抑菌实验分为四组，分别为没有加材料的空白组以及用纯PLA多孔纳米纤维，氨基化的PLA纳米纤维和果胶涂层的负载肉桂精油的纳米纤维膜处理的真菌孢子悬浮液。实验结果发现空白组和PLA组在第三天和第五天孢子逐渐繁殖，菌体直径越来越大，而加了材料的黑曲霉几乎没有长，说明黑曲霉可以分泌大量的果胶酶，果胶酶可以分解果胶涂层，使抗菌剂释放出来作用于真菌。

本发明所提供的保鲜膜能够利用微生物尤其是真菌产生的果胶酶作为刺激响应因素，通过控制果胶酶分解“封堵”果胶涂层的速度达到控制释放抗菌肉桂精油的目的。果胶涂层的PLA多孔纳米纤维不仅具有高孔隙率和高负载率，同时也实现了由缓释到控释的过程，避免了抗菌剂的提前或过量释放。