荧光染料标记的核酸适配体热开关及利用其的检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及荧光染料标记的核酸适配体热开关及利用其的检测方法。

背景技术

快速灵敏的分析检测目标物在环境分析、食品安全、生物分析等领域具有重要意义，需求也日益增加。核酸适配体(也简称为适配体)是可以与目标物选择性高亲和力结合的寡聚核苷酸链，针对目标物，核酸适配体可以从随机序列的核酸文库中通过特定的筛选技术得到。核酸适配体在分析传感领域也显示出了优势，例如核酸适配体容易合成、批间重现性好、易修饰标记功能团等。基于核酸适配体的检测技术具有广泛的应用前景，但不少检测方法仍存在检测时间长、步骤多、操作复杂、通量低、重现性差、需要分离或亲和配体的固定化等局限。微量热泳动(MST)技术是近年来新兴的一种技术，可快速测定样品溶液中荧光分子对红外激光局部加热升温的荧光信号响应，这种技术具有诸多优点，包括高灵敏度、在均相溶液中进行、不需要分离和固定化、比值型分析、样品用量少、通量高、检测迅速等。MST技术主要用于分子间相互作用的表征，在定量检测目标物方面也显示出许多优势。荧光染料标记的核酸适配体可用于MST分析目标物，但不少核酸适配体与目标物结合前后MST信号变化小，甚至不变化，限制了MST在定量分析方面的应用，特别是小分子、金属离子和蛋白质等的检测。因此，需要开发针对目标物具有灵敏MST信号变化响应的荧光染料标记的核酸适配体，将其用于MST分析检测目标物，可充分利用核酸适配体和MST在分析检测方面的优势。

发明内容

本发明构建荧光染料标记的核酸适配体热开关用于灵敏MST分析目标物，所构建的荧光染料标记的核酸适配体与目标物结合前后，对于加热升温表现出不同的稳定性和结构变化响应，可产生显著的MST检测信号变化，可实现快速灵敏检测目标物包括镉离子、黄曲霉毒素B1(AFB1)、免疫球蛋白E(IgE)。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

通过合理设计适配体序列，使适配体与目标物结合前后结构的热稳定性产生差异，在升温区间未结合目标物的适配体和目标物结合的适配体产生的构象变化具有差异。同时适配体合适的末端(3'端或5'端)标记上荧光强度对周围局部环境敏感的荧光染料分子(如荧光素分子等)，构成荧光染料标记的适配体，伴随着荧光染料标记的适配体构象的改变，相应的末端所标记的荧光染料的荧光强度会产生变化。未结合目标物的荧光染料标记的适配体和目标物结合的荧光染料标记的适配体在升温时产生的构象变化具有明显差异时，未结合目标物的适配体和目标物结合的适配体在升温时所标记的荧光染料分子产生的荧光强度变化具有明显差异，我们称之为荧光染料标记核酸适配体热开关，荧光染料分子标记的适配体与目标物结合前后MST信号可产生显著变化。检测目标物时，将荧光染料标记的适配体与目标物温育，然后采用MST仪测定相应溶液的MST信号，通过测定MST信号的变化实现对目标物的检测。针对不同的目标物镉离子、黄曲霉毒素B1、免疫球蛋白E，分别构建相应的荧光染料标记的核酸适配体探针。采用可以与镉离子结合的核酸适配体序列，在其3'末端或5'末端标记上环境敏感的荧光染料分子(如荧光素分子(简称为FAM)等)。采用可以与黄曲霉毒素B1结合的核酸适配体，在其3'末端或5'末端标记上环境敏感的荧光染料分子(如荧光素分子等)。采用可以与IgE结合的核酸适配体，在其3'末端或5'末端标记上环境敏感的荧光染料分子(如荧光素分子等)。

一方面，本发明提供荧光染料标记的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4组成的组。

在一些实施方案中，所述核酸适配体3'末端和/或5'端带有荧光染料标记。

在一些实施方案中，所述荧光染料标记选自由荧光素FAM、Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)、Cy3和BODIPY组成的组。

在一些实施方案中，所述荧光染料标记的核酸适配体与目标物结合前后，产生明显的MST信号变化。

另一方面，本发明提供试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如上所述的荧光染料标记的核酸适配体。

另一方面，本发明提供检测组合物，其特征在于所述检测组合物包含如上所述的荧光染料标记的核酸适配体。

另一方面，本发明提供目标物的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

a.将上述核酸适配体、所述试剂盒中的核酸适配体或所述检测组合物中的核酸适配体与目标物在反应缓冲液中温育；

b.进行微量热泳动检测。

在一些实施方案中，所述温育在4-30℃，优选地20-30℃，优选地25℃进行。

在一些实施方案中，所述温育时间为1-30min，优选地10-30min，优选地10、15、20、25或30min。

另一方面，本发明提供上述荧光染料标记的核酸适配体在目标物的检测中的应用。

在一些实施方案中，所述检测为微量热泳动检测。

在一些实施方案中，所述目标物选自由镉离子、黄曲霉毒素B1和免疫球蛋白E组成的组。

本发明具有如下的优点和效果：

本发明中通过合理设计核酸适配体序列，采用序列末端标记特定荧光染料分子(如荧光素等)的核酸适配体，在优化的实验条件下，发展了可快速灵敏检测镉离子、AFB1和IgE的MST分析方法。所发展的方法具有如下优势：

这种方法不需要分离和分子的固定，操作简单；

方法具有高灵敏度，目标物引起的MST信号变化显著，可实现nM水平目标物的检测，而且采用更灵敏的仪器装置有望进一步降低检测限；

方法检测迅速，每个样品的测定只需要不到20秒，而其他一些检测方法需要多个步骤(如分离等)，检测时间长，可能需要几十分钟，甚至更长；

检测时测定的是荧光强度的比值，检测信号稳定重现性好，波动小；

适配体可特异结合目标物，方法的选择性高；

方法的成本低，荧光适配体探针用量少而且单根毛细管价格低；

方法具有高通量，MST检测时一次可同时检测16个样品或更多；

方法具有样品体积用量少的优点，检测时每根毛细管只需要几微升样品，采用更高级的仪器设备可以进一步降低所需样品体积；

检测方法所用仪器自动化程度高，相应的测定数据可自动生成并进行分析；

方法所用仪器无需流路系统和昂贵的耗材，无需特殊的维护，维护成本低。

本发明使用优化的序列设计和实验条件，所发展的检测方法，目标物与荧光染料标记的核酸适配体探针结合前后MST信号变化显著，具有高灵敏度。镉离子的检测限达到2nM，AFB1的检测限达到0.5nM，而IgE的检测限达到4nM，检测时间可以低至5秒，甚至更少，反应只需一步温育。

附图说明

图1示出采用SEQ ID NO:1-3'FAM检测镉离子的结果。其中A：随着镉离子浓度增加，MST检测曲线的变化情况；B：5s对应的Fnorm值随镉离子浓度变化的情况；C：500nM镉离子、铜离子、镍离子、铅离子、锌离子、锰离子、镁离子、钙离子存在时，MST信号(5s对应的Fnorm)变化情况；D：随稀释自来水、湖水和矿泉水中添加的镉离子浓度增加，荧光探针的MST信号(5s对应的Fnorm)变化情况。

图2示出采用SEQ ID NO:2-3'FAM检测镉离子的结果。其中A：随着镉离子浓度增加，MST检测曲线的变化情况；B：5s对应的Fnorm值随镉离子浓度变化的情况。

图3示出采用SEQ ID NO:3-3'FAM检测AFB1的结果。其中A：随着AFB1浓度增加，MST检测曲线的变化情况；B：10s对应的Fnorm值随AFB1浓度变化的情况；C：125nM AFB1、赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、玉米赤霉烯酮存(ZAE)存在时，荧光探针MST信号(10s对应的Fnorm)的变化情况；D：随稀释的牛奶样品、红酒样品和自来水样品中添加的AFB1浓度增加，荧光探针的MST信号(10s对应的Fnorm)变化情况。

图4示出采用SEQ ID NO:3-5'FAM检测AFB1的结果。其中A：随着AFB1浓度增加，MST检测曲线的变化情况；B：10s对应的Fnorm值随AFB1浓度变化的情况；C：125nM的AFB1、赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、玉米赤霉烯酮(ZAE)存在时，MST信号值(10s对应的Fnorm)的变化情况；D：随稀释自来水和稀释牛奶中添加的AFB1浓度增加，荧光探针的MST信号(10s对应的Fnorm)变化情况。

图5示出采用SEQ ID NO:4-3'FAM检测IgE的结果。其中A：随着IgE浓度增加，MST检测曲线的变化情况；B：5s对应的Fnorm值随IgE浓度变化的情况；C：200nM IgE、血红蛋白、免疫球蛋白G、溶菌酶存在时，荧光探针的MST信号(5s对应的Fnorm)的变化情况；D：随稀释血清样品中添加的IgE浓度增加，荧光探针的MST信号(5s对应的Fnorm)变化情况。

图6示出采用SEQ ID NO:4-5'FAM检测IgE的结果。其中A：随着IgE浓度增加，MST检测曲线的变化情况；B：5s对应的Fnorm值随IgE浓度变化的情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料和试剂，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到的。

所用带有荧光染料分子标记的DNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备纯化。

MST检测方法步骤：荧光染料标记的核酸适配体和目标物在结合缓冲溶液中温育，温育一定时间后，将样品溶液转移到MST仪所用的毛细管中，采用MST仪(Monolith NT.115，NanoTemper Technologies)进行测定。根据荧光染料的种类，选用相应的LED激发光通道。对于荧光素染料标记的探针，选择蓝色LED通道，用于荧光检测。无特殊说明时，LED激发强度选用自动模式，MST红外激光强度选用中级，测定温度为25℃。测定时，按照设定的参数进行测量，在20秒内随时间测定归一化荧光信号Fnorm(Fnorm＝F

本发明中采用的核酸适配体序列如下：

针对镉离子的检测，荧光染料标记的核酸适配体探针如下：

SEQ ID NO:1DNA序列5'-GCA GGT TCA CAG TCT GC-3'，其3'末端带有荧光素FAM标记，简称SEQ1-3'FAM。

SEQ ID NO:1DNA序列5'-GCA GGT TCA CAG TCT GC-3'，其3'末端标记其他荧光染料分子如Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)、Cy3或BODIPY等。

SEQ ID NO:1DNA 序列5'-GCA GGT TCA CAG TCT GC-3'，其5'端标记荧光染料分子如四甲基罗丹明(TMR)、Cy3或BODIPY等。

SEQ ID NO:2DNA序列5'-GCG GGT TCA CAG TCC GC-3'，其3'末端带有荧光素FAM标记，简称SEQ2-3'FAM。

针对AFB1的检测，所用的荧光染料标记的核酸适配体探针如下：

SEQ ID NO:3DNA序列5'-CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC G-3'，其3'末端带有荧光素FAM标记，简称SEQ3-3'FAM。

SEQ ID NO:3DNA序列5'-CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC G-3'，其3'端标记荧光染料分子如Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)、Cy3或BODIPY等。

SEQ ID NO:3DNA序列5'-CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC G-3'，其5'末端带有荧光素FAM标记，简称SEQ3-5'FAM。

SEQ ID NO:3DNA序列5'-CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC G-3'，其5'端标记荧光染料分子如Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)或Cy3等。

针对IgE的检测，所用荧光染料标记的核酸适配体探针如下：

SEQ ID NO:4DNA序列5'-GCA GTT TAT CCG TCC CTC CTA GTG GCT GC-3'，其3'末端带有荧光素FAM标记，简称SEQ4-3'FAM。

SEQ ID NO:4DNA序列5'-GCA GTT TAT CCG TCC CTC CTA GTG GCT GC-3'，其5'末端带有荧光素FAM标记，简称SEQ4-5'FAM。

实施例1采用荧光染料标记适配体检测镉离子

我们将50nM适配体荧光探针SEQ ID NO:1-3'FAM与镉离子在反应缓冲溶液(20mMTris-HCl(pH 7.5)+20mM NaCl)中在25℃温育10分钟，然后利用MST检测。随着镉离子浓度增加，MST检测曲线产生明显变化(检测曲线明显能区分开)，这表明该适配体荧光探针可用于进行MST检测(图1A)，MST中荧光时间曲线逐渐下移。根据特定时间对应的Fnorm信号变化实现对镉离子的检测。图1B显示了5s对应的Fnorm值随镉离子浓度变化的情况，随着镉离子浓度增加，Fnorm值逐渐下降，镉离子的检测范围为2nM至15.6μM(检测范围是基于更高浓度时，信号不变了，更低浓度时信号和空白信号一样选择的)，检测限为2nM，Fnorm值的最大变化约301‰。其他金属离子如铜离子、镍离子、铅离子、锌离子、锰离子、镁离子、钙离子存在时(浓度为500nM)，荧光探针的MST信号(5s对应的Fnorm值)相对于空白样品只含有荧光探针没有显著变化，而500nM镉离子存在时，MST信号变化(ΔFnorm，为样品溶液的Fnorm值减去空白样品Fnorm值)明显，表明检测方法具有选择性(图1C)。相应的方法可用于检测稀释自来水、湖水和矿泉水(选择这三种物质来检测是因为饮用水中可能含有重金属离子，可以作为样品的代表)中添加的镉离子的检测，图1D显示了随镉离子浓度增加，荧光探针的MST信号(5s对应的Fnorm值)相应的变化情况，镉离子的检测范围为2nM至15.6μM，检测限为2nM，表明所述检测方法可用于实际样品中镉离子的检测。

当采用如下FAM标记的核酸适配体(5’-GGC GGG TTC ACA GTC CGCC-3'(SEQ IDNO:5)，3'端标记FAM；5’-CGG CGG GTT CAC AGT CCG CCG-3’(SEQ ID NO:6)，3'端标记FAM或5'端标记FAM)时，这些FAM标记的核酸适配体与镉离子结合前后，在升温区间构象稳定，并未产生明显的MST信号变化，不能用于MST检测镉离子。

当采用SEQ ID NO:1-5'FAM作为荧光探针，在同样的溶液条件下进行MST检测时，镉离子结合引起的Fnorm值(5s对应的Fnorm)变化小，在所考察的镉离子浓度检测范围内，Fnorm值随镉离子浓度增加，但最大Fnorm值(5s对应的Fnorm)变化仅为15‰，远小于SEQ IDNO:1-3'FAM作为荧光探针时的最大Fnorm值(5s对应的Fnorm)变化(301‰)，表明SEQ IDNO:1-5'FAM相应的灵敏度较低，其镉离子检测限为15nM，检测范围为15nM至977nM。

当采用SEQ ID NO:1，其3'末端标记Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)、Cy3或BODIPY作为荧光探针时，也可用于MST检测镉离子，Fnorm值(5s对应的Fnorm)均随镉离子浓度增加而降低，对应的检测限分别为2nM、15nM、30nM、15nM，可检测的镉离子最大浓度分别为15.6μM、15.6μM、1.9μM、15.6μM，而对应的Fnorm值最大变化分别为约382‰、144‰、40‰、600‰。

当采用SEQ ID NO:1，其5'末端标记四甲基罗丹明(TMR)、Cy3或BODIPY作为荧光探针时，也可用于MST检测镉离子，Fnorm值(5s对应的Fnorm)均随镉离子浓度增加而降低，对应的检测限分别为15nM、15nM、4nM，可检测的镉离子最大浓度分别为7.8μM、7.8μM、15.6μM，而对应的Fnorm值最大变化分别为约145‰、85‰、166‰。当采用SEQ ID NO:1，其5'末端标记Alexas Fluor488作为荧光探针时，不能用于镉离子的检测，镉离子存在时，荧光探针的Fnorm值没有明显变化。

作为对照，Texas Red荧光染料的荧光强度对周围环境和核酸适配体构象变化不敏感，当采用SEQ ID NO:1，其5'末端或3'末端标记Texas Red荧光染料作为荧光探针时，不能用于镉离子的检测，镉离子存在时，荧光探针的Fnorm值没有明显变化。

另外，采用SEQ ID NO:2-3'FAM也可用于MST检测镉离子，结果如图2所示。随着镉离子浓度增加，MST检测曲线产生明显变化(图2A)，MST中荧光时间曲线逐渐下移。根据特定时间对应的Fnorm信号变化实现对镉离子的检测，图2B显示了5s对应的Fnorm值随镉离子浓度变化的情况，检测曲线检测范围为15nM至15.6μM，检测限为15nM，最大的Fnorm值变化约66‰。

当采用SEQ ID NO:2，其3'末端标记Texas Red荧光染料作为荧光探针时，不能用于镉离子的检测，镉离子存在时，荧光探针的Fnorm值没有明显变化。

实施例2采用荧光染料标记适配体MST检测AFB1

SEQ ID NO:3-3'FAM可用于MST检测AFB1。我们将50nM适配体荧光探针SEQ ID NO:3-3'FAM与AFB1在反应缓冲溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)+20mM MgCl

SEQ ID NO:3-5'FAM探针也可用于MST检测AFB1。我们将50nM SEQ ID NO:3-5'FAM与AFB1在反应缓冲溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)+20mM MgCl

当采用SEQ ID NO:3，其3'末端标记Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)、Cy3或BODIPY作为荧光探针时，也可用于MST检测AFB1，Fnorm值(10s对应的Fnorm)均随镉离子浓度增加而上升，对应的检测限分别为0.5nM、0.5nM、1nM、1nM，可检测的镉离子最大浓度分别为2μM、1μM、2μM、2μM，而对应的Fnorm值最大变化分别为约835‰、342‰、527‰、1457‰。

当采用SEQ ID NO:3，其5'末端标记Alexas Fluor488、四甲基罗丹明(TMR)或Cy3作为荧光探针时，也可用于MST检测AFB1，Fnorm值(10s对应的Fnorm)均随镉离子浓度增加而上升，对应的检测限分别为1nM、31nM、2nM，可检测的镉离子最大浓度分别为2μM、1μM、2μM，而对应的Fnorm值最大变化分别为约658‰、44‰、728‰。

当采用SEQ ID NO:3，其5'末端标记BODIPY作为荧光探针时，不能用于MST检测AFB1，AFB1存在时，荧光探针的Fnorm值没有明显变化。

作为对照，Texas Red荧光染料的荧光强度对周围环境和核酸适配体构象变化不敏感，当采用SEQ ID NO:3，其3'末端或5'末端标记Texas Red作为荧光探针时，相应的荧光探针与AFB1结合前后，MST信号都没有明显变化，不能用于MST检测AFB1。

作为对照，在同样的实验条件下，AFB1的如下FAM标记的核酸适配体(5'-GGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCC-3'(SEQ ID NO:7)，3'端标记FAM或5’端标记FAM)与AFB1结合前后，在升温区间构象稳定，MST信号没有明显变化，不能用于MST检测AFB1。

实施例3采用荧光染料标记适配体MST检测IgE

SEQ ID NO:4-3'FAM可用于MST检测IgE。我们将20nM SEQ ID NO:4-3'FAM和不同浓度IgE，在结合缓冲溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl

SEQ ID NO:4-5'FAM也可用于MST检测IgE。将20nM SEQ ID NO:4-5'FAM和不同浓度IgE，在结合缓冲溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl

作为对照，在同样的实验条件下，IgE的如下FAM标记的核酸适配体(5'-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3'(SEQ ID NO:8)，3'端标记FAM或5'端标记FAM)与IgE结合前后，MST信号没有明显变化，不能用于MST检测IgE。

序列(左边为5'端，右边为3'端)

SEQ ID NO:1检测镉离子的适配体序列

GCA GGT TCA CAG TCT GC

SEQ ID NO:2检测镉离子的适配体序列

GCG GGT TCA CAG TCC GC

SEQ ID NO:3检测AFB1的适配体序列

CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC G

SEQ ID NO:4检测IgE的适配体序列

GCA GTT TAT CCG TCC CTC CTA GTG GCT GC

SEQ ID NO:5检测镉离子的适配体序列

GGC GGG TTC ACA GTC CGCC

SEQ ID NO:6检测镉离子的适配体序列

CGG CGG GTT CAC AGT CCG CCG

SEQ ID NO:7检测AFB1的适配体序列

GGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCC

SEQ ID NO:8检测IgE的适配体序列

GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。