茶树的干旱胁迫分子标记引物及其联合开发方法和应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及茶树的干旱胁迫分子标记引物及其联合开发方法和应用。

背景技术

茶树是世界上消费最广泛的三种非酒精饮料之一，体现了许多经济、健康和文化价值。喝茶有许多健康益处，如降低血清胆固醇，预防低密度脂蛋白氧化，并降低心血管综合征的风险。茶还是中国一种重要的经济作物，有很高的经济价值和经济效益。对茶开展深入的分子研究工作、选育优良品种及提高茶树抗逆能力对茶产业的进一步发展尤为重要。

由于茶树在自然环境条件下易受到干旱胁迫的影响，对茶树的生长发育造成不良影响。许多优良性状为多基因控制的数量性状，所以利用常规的育种手段往往会消耗大量的人力物力和时间。

分子生物学育种可以增强对非生物胁迫环境的抗性，加速优良品种的选育，具有很大的发掘潜力。因此，研究人员寄希望于分子生物学技术方法，以克服常规育种中的抗胁迫能力弱的问题。

相比于重要农作物，利用分子生物技术进行茶树的遗传改良起步较晚，标记开发模式单一，仅用一种分子标记，结果可靠性较低。另外，基于某个基因组开发的分子标记应用范围较窄，在其他茶树品种中应用受到限制。

近年来分子标记技术发展迅速，作为育种的辅助工具，分子标记具有高效、准确、不受环境影响等特点，其应用越来越受到重视。特别是SSR标记技术，具有结果可靠、重复性好、多态性丰富、操作简单、呈共显性遗传等特点，十分有利于茶树品种的鉴定。然而，单一分子标记的使用范围和效力往往是有限的，结合其他分子标记联合开发和应用将会更大程度上发挥分子标记技术的优势。

ILP标记技术是一种基因标记，引物保守性高通用性好，相比于SSR标记更易于使用和记录，具有很好的应用前景；但ILP标记仅存在于染色体基因区段，对于其他非编码区间不能使用。因此，SSR标记和ILP标记具有各自的优点，联合开发使用两种标记，将它们应用于茶树的育种、遗传多样性分析、核心种质资源的收集，将会获得更好的效果。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供茶树的干旱胁迫分子标记引物及其联合开发方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种茶树干旱胁迫分子标记引物的联合开发方法，包括以下步骤：

(1)扫描茶树基因组序列中的SSR位点、intron位点，获得相应的位点信息；根据位点信息提取出引物前体序列，设计引物并进行ePCR验证，获得初选SSR分子标记引物对和初选ILP分子标记引物对；

(2)根据参与茶树干旱胁迫的基因表达量，筛选出差异表达基因，获得差异表达基因的序列；

(3)根据步骤(2)得到参与茶树干旱胁迫的差异表达基因的序列，将步骤(1)得到的初选SSR分子标记引物对和初选ILP分子标记引物对在参与茶树干旱胁迫的差异表达基因序列中做ePCR验证，如果一对引物在电子模拟PCR中扩增出了条带，则该对引物为与干旱胁迫相关的分子标记引物。

优选的，步骤(2)中，利用Linux平台上的hisat2、stringtie、python软件得到参与茶树干旱胁迫的基因表达量，利用R包筛选出差异表达基因。

本发明的第二方面，提供与茶树干旱胁迫相关的分子标记引物组合，包括：SSR分子标记引物对和ILP分子标记引物对；

所述SSR分子标记引物对为如下(1)-(5)中的至少一对：

(1)USSR1，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)USSR5，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)USSR9，其序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(4)USSR11，其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

(5)USSR12，其序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

所述ILP分子标记引物对为如下(i)-(v)中的至少一对：

(i)UILP1，其序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；

(ii)UILP5，其序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；

(iii)UILP7，其序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；

(iv)UILP8，其序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；

(v)UILP10，其序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。

本发明的第三方面，提供上述分子标记引物组合在如下(1)或(2)中的应用：

(1)鉴定茶树的抗旱能力；

(2)培育抗旱能力提高的茶树品种。

本发明的第四方面，提供一种鉴定茶树抗旱能力的试剂盒，所述试剂盒以上述分子标记引物组合为有效成分。

本发明的有益效果：

(一)非生物胁迫分子标记引物的联合开发方法

本发明采用两种分子标记联合开发的方法，规避了单一分子标记的局限性，如SSR序列两侧序列种间保守性较低，这大大限制了SSR标记在其他物种中的利用，ILP标记仅存于染色体基因区段，对于其他非编码区间则不能使用该方法，多种分子标记方法的联合使用将每种标记的优势相结合，结果更加客观。

(二)获得的非生物胁迫分子标记引物

采用本发明的方法获得的茶树的SSR、ILP非生物胁迫分子标记引物，有利于分子辅助育种、增强茶树的抗逆性及遗传资源的保存。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，分子生物学育种可以增强对非生物胁迫环境的抗性，加速优良品种的选育，具有很大的发掘潜力。但单一分子标记存在局限性，如SSR序列两侧序列种间保守性较低，这大大限制了SSR标记在其他物种中的利用；ILP标记仅存于染色体基因区段，对于其他非编码区间则不能使用该方法。多种分子标记方法的联合使用将每种标记的优势相结合，结果更加客观。

发明人在前期研究中提出了一种树木通用分子标记的联合开发方法(CN107190096A)，获得了树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物，克服了目前树木分子标记少、标记通用性较低、树木品种难以区分的问题，提高了树木品种鉴定结果的准确性。

在此基础上，发明人进一步结合茶树的非生物胁迫抗性，开发设计了一组与茶树的干旱胁迫相关的分子标记引物。

在本发明的一种实施方案中，给出了本发明的茶树的SSR、ILP非生物胁迫分子标记引物的联合开发方法，包括以下步骤：

Step1：SSR位点和intron位点扫描

从公共数据平台(http://tpia.teaplant.org/download.html)下载茶树品种“舒茶早”的基因组序列和基因组注释信息，扫描基因组序列中的SSR位点、intron位点，获得相应的位点信息。一般认为SSR位点的最小长度为12bp，即单核苷酸重复单元至少为12重复，二核苷酸重复单元至少6重复，三核苷酸重复单元至少为4此重复，四核苷酸重复单元至少为3重复，五核苷酸至少为3重复，六核苷酸重复单元至少为2重复，七核苷酸重复单元至少为2重复。

Step2：引物设计

基于上一步获得的位点信息，利用perl程序，提取出位点两侧长度为60bp的DNA序列做为引物前体，然后利用eprimer3软件进行引物设计，设计好的引物成对存在，其中，前引物的长度为20bp左右，一般为15bp-25bp，后引物的长度也为20bp左右，一般为15bp-25bp。

Step3：ePCR验证

结合所下载的茶树基因组序列，利用Linux平台上的ePCR软件对设计好的引物进行电子模拟PCR，如果一对引物在所下载的茶树品种电子模拟PCR中扩增出了条带，则该对引物即为一个分子标记。

Step4：从公共数据平台下载茶树干旱胁迫的数据，利用Linux平台上的hisat2、stringtie、python等软件得到参与茶树干旱胁迫的基因表达量，利用R包筛选出差异表达基因。

Step5：结合扩增到的SSR、ILP分子标记，利用Linux平台上的ePCR软件进行电子模拟PCR，如果一对引物在电子模拟PCR中都扩增出了带条，则该对引物即为一个干旱胁迫分子标记。

Step4：从从NCBI公共数据平台(项目号为PRJNA545401)下载茶树干旱胁迫的转录组数据，利用Linux平台上的hisat2、stringtie、python等软件得到参与茶树干旱胁迫的基因表达量，利用R包筛选出差异表达基因，继而找到其对应的基因序列。

Step5：结合Step3中扩增唯一的SSR、ILP分子标记与在Step4得到的与干旱胁迫的基因序列，利用Linux平台上的ePCR软件进行电子模拟PCR，如果一对引物在电子模拟PCR中都扩增出了带条，则该对引物即为一个干旱胁迫分子标记。

本发明在原有筛选SSR、ILP分子标记的基础上，进一步与干旱胁迫进行关联，找到与干旱胁迫相关联的分子标记引物，为加速抗旱茶树品种的选育奠定了基础。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1：茶树的干旱胁迫分子标记引物联合开发

Step1：SSR位点和intron位点扫描

(1)下载基因组序列

根据“舒茶早”这一参考基因组来筛选与干旱胁迫相关的分子标记，参考基因组是相对标准的，有代表性，可以通过这一个品种筛选出与干旱胁迫相关的分子标记。

从公共数据平台(http://tpia.teaplant.org/download.html)下载茶树品种“舒茶早”基因组序列和基因组注释信息。“舒茶早”基因组序列的版本号为：CSS_ChrLev_20200506.gff3.gz TPIA。

茶树品种的信息如下：

(2)扫描位点

扫描基因组序列中的SSR位点、intron位点，获得相应的位点信息。一般认为SSR位点的最小长度为12bp。

通过扫描，我们得到的相应的位点信息如下：

Step2：引物设计

(1)提取引物前体

基于上一步获得的位点信息，利用perl程序，提取出位点两侧长度为60bp的DNA序列做为引物前体。

我们得到的引物前体的信息如下：

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(2)设计引物

利用eprimer3软件进行引物设计，设计好的引物成对存在，其中，前引物的长度为20bp左右，一般为15bp-25bp，后引物的长度也为20bp左右，一般为15bp-25bp。

我们设计得到的引物的信息如下：

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Step3：一次ePCR验证

结合所下载的茶树基因组序列，利用Linux平台上的ePCR软件对设计好的引物进行电子模拟PCR，如果一对引物在所下载的茶树品种电子模拟PCR中扩增出了条带，则该对引物即为一个分子标记。

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经过ePCR验证，我们共计得到了12对SSR分子标记引物、10对ILP分子标记引物。

Step4：得到差异表达基因

从NCBI公共数据平台(项目号为PRJNA545401)下载茶树干旱胁迫的数据，利用Linux平台上的hisat2、stringtie、python等软件得到参与茶树干旱胁迫的基因表达量，利用R包筛选出差异表达基因，共从37687个基因中筛选出6501个干旱胁迫下表达上调的基因和7287个干旱胁迫下表达下调的基因。根据得到的差异表达基因，得到基因名称，再根据基因名称与基因组文件，通过TBtools软件得到所有基因名称的序列。

Step5：二次ePCR验证

根据Step4得到参与茶树干旱胁迫的差异表达基因的序列，将Step3得到的SSR、ILP分子标记引物在参与茶树干旱胁迫的差异表达基因序列中做ePCR验证，如果一对引物在电子模拟PCR中扩增出了条带，则该对引物即为与干旱胁迫相关的分子标记引物。

最后共筛选得到的5对SSR分子标记引物和5对ILP分子标记引物，具体如下：

这10对分子标记引物所对应的基因名称如下：

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实施例2：茶树干旱胁迫分子标记引物的应用考察

将实施例1筛选出的5对SSR分子标记引物和5对ILP分子标记引物应用于茶树抗旱品种的早期选育，具体如下：

从日照圣谷山茶场中选择10个茶树种质资源，利用USSR1和UILP1的分子标记引物组合对茶树种质资源的抗旱性进行鉴定。取茶树种质资源幼苗期的嫩叶，提取DNA，以提取的DNA为模板，分别利用USSR1分子标记引物对和UILP1分子标记引物对进行扩增，若均有扩增条带出现，则将对应的茶树种质资源的抗旱能力鉴定为“抗旱++”；若只有一对引物有扩增条带出现，则将对应的茶树种质资源的抗旱能力鉴定为“抗旱+”；若没有扩增条带出现，则将对应的茶树种质资源的抗旱能力鉴定为“不抗旱”。

对于这10个茶树种质资源，采用传统的耐旱性鉴定方法，即通过田间观察和测量MDA含量、SOD活性、净光合速率和蒸腾速率等生理生化指标，鉴定其抗旱性。结果表明：采用本发明的茶树干旱胁迫分子标记引物的鉴定结果与传统的耐旱性鉴定结果一致；但采用本发明的茶树干旱胁迫分子标记引物能极大提高鉴定效率，特别是在早期对茶树的耐旱能力进行鉴定，有利于加速对茶树抗旱品种的选育。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。