一种微生物真空冷冻干燥保护剂及制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物真空冷冻干燥保护剂技术领域，具体涉及一种无色杆菌保护剂及制备方法及其应用。

背景技术

真空冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了真空冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展真空冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。影响微生物真空冷冻干燥的效果的因素有如下几个：(1)菌的种类和质量；(2)保护剂；(3)干燥速度；(4)空气的影响；(5)温度的影响；(6)含水量的影响。

由于受自然界各种因素的影响，单一菌剂在复杂的自然环境下效果通常不太稳定，复配生防菌剂可有效弥补单一菌株的缺点，提高功效。

中国发明专利“一种反硝化脱氮复合菌剂及其制备方法和应用”(CN107488621A)公开了一种反硝化脱氮复合菌剂(含有无色杆菌)的保护剂：β-环糊精、麦芽糊精和羧甲基纤维素。中国发明专利“用于化工废水处理的复合微生物菌剂及其筛选和制备方法”(CN109402016A)公开了一种反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)的菌种保护剂：吐温-20、黄原胶和甘油。中国发明专利“一种富硒蔬菜专用菌肥及其制备方法”(CN113372147A)公开了一种反硝化无色杆菌的真空冷冻干燥保护剂：保护剂包括以下组分：8-12mg/L脱脂牛奶、5-8mg/L果糖和0.05-0.1mg/L聚-γ-谷氨酸。中国发明专利“一种甲醛高效降解菌剂、制备及其应用”(CN113773995A)公开了一种降解甲醛的无色杆菌的保护剂：酵母粉35％；鱼蛋白35％；微量元素30％。

现有结果显示，无色杆菌与保护剂混合后，真空冷冻干燥后菌种的成活率不高。

发明内容

为了解决现有技术中无色杆菌在真空冷冻干燥后成活率及其活性不高的技术问题，本发明提供以下技术方案：

一种微生物真空冷冻干燥保护剂，所述真空冷冻干燥保护剂包含PQQ。

优选的，所述微生物真空冷冻干燥保护剂还包含蔗糖、糊精和谷氨酸钠。

优选的，所述微生物真空冷冻干燥保护剂包含按质量份计以下成分：52×10

优选的，所述方法为：将微生物真空冷冻干燥保护剂的组分溶于蒸馏水，灭菌冷却得到所述真空冷冻干燥保护剂。

优选的，所述微生物真空冷冻干燥保护剂的质量分数为8％。

本发明的微生物真空冷冻干燥保护剂在微生物真空冷冻干燥中的应用。

优选地，所述微生物为无色杆菌、肠杆菌、假单胞菌中至少一种。

优选地，所述微生物中无色杆菌、肠杆菌和假单胞菌的活菌数比为4:4:2。

优选地，所述无色杆菌为无色杆菌(Achromobacter insuavis)SL8，于2022年3月18日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:M 2022286；所述肠杆菌为肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12，保藏号：CCTCC NO:M 2022288，于2022年3月18号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址:中国.武汉.武汉大学；所述假单胞菌为假单胞菌(Pseudomonas sp.)NT04，保藏号为CCTCC NO:M 20221479，保藏日期为2022年9月23日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

本发明的有益效果：

本发明通过将PQQ与蔗糖、糊精和谷氨酸钠进行复配，得到能显著提高微生物存活率的真空冷冻干燥保护剂，采用本发明的技术方案，微生物的真空冷冻干燥后成活率最高能达到89.4％，节约成本，为功能微生物经过冷冻干燥加工成菌粉。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明涉及的无色杆菌(Achromobacter insuavis)SL8，其16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12，其16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的保藏号：CCTCC NO:M2022288，；无色杆菌(Achromobacter insuavis)SL8的保藏号：CCTCC NO:M 2022286。上述2株微生物于2022年3月18号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址:中国.武汉.武汉大学。

假单胞菌(Pseudomonas sp.)NT04的保藏号为CCTCC NO:M20221479，其16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，保藏日期为2022年9月23日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

液体发酵培养基或液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，加水溶解，最后定容至1000mL，pH7.0±0.2，高压灭菌(121℃、30min)。

实施例1不同组分保护剂的配置

将不同组分的保护剂按照表1所示的配方混合。

表1不同配方的保护剂组合

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实施例2微生物冻干制剂的制备

(1)种子液制备。将活化后的菌株(无色杆菌SL8及其与其他微生物复配)接至100mL液体培养基中(接种量1％)，在台式恒温振荡器中以26℃、220r/min条件培养48h，制得种子液。再将种子液接入100mL液体发酵培养基中(接种量1％)，在同等条件下培养96h，制得菌液。

(2)制取菌悬液。取1000mL菌液于离心管中，在4℃条件下，5000r/min离心8min，弃掉上清液后添加生理盐水补充至离心前体积，重复3次获得澄清上清液，最终将菌泥悬浮于生理盐水中，经漩涡震荡使之充分混匀。

(3)制备保护剂。将表1中1-10和12的保护剂按照配方分别溶于蒸馏水中，配制成浓度为8％(质量分数)的保护剂溶液，灭菌后，与菌悬液混合(保护剂与菌液混合重复3次)。

(4)真空冷冻干燥。将前期配制好的保护剂按1∶1体积比加入菌悬液中，去除离心管盖，换为封口膜，于-80℃预冻4h。将预冻样品取出后迅速放入冷冻阱内，用真空冷冻干燥机对样品进行冻干，待其完全变为粉末状后进行真空包装，置于干燥处保存备用。

实施例2微生物经真空冷冻干燥后存活率的测定

将实施例1制备的菌粉溶于LB液体培养基，划线培养后数菌，计算菌粉中总活菌数。其中，存活率(％)＝真空冷冻干后活菌总数/真空冷冻干前活菌总数×100％。结果如表2所示：

表2不同保护剂处理下微生物的存活率

注：在表2中组号1、5-11中微生物为无色杆菌；组号2和12为无色杆菌、肠杆菌和假单胞菌的复配剂(4:4:2)；组号3为无色杆菌、假单胞菌的复配剂(4:2)；组号4为无色杆菌和肠杆菌的复配剂(1:1)。

从表2的组号5的数据可以看出，微生物在含有PQQ的真空冷冻干燥保护剂的存活率达到65.3％；微生物在含有蔗糖、糊精和谷氨酸钠的的真空冷冻干燥保护剂的存活率达到80.3％；组号2-4的数据表明将PQQ与蔗糖、糊精、谷氨酸钠复配能显著提高微生物在冷冻干燥过程的损失率，提高粗活率。

从组号6-10和12的数据显示，使用麦芽糊精、吐温-20、脱脂牛奶、脱脂牛奶、果糖、聚-γ-谷氨酸、酵母粉、鱼蛋白、微量元素30％，相比不使用真空冷冻干燥保护剂(组号11)虽然也能一定程度提高无色杆菌真空冷冻干燥后存活率，但是与组号1-5的数据相比，真空冷冻干燥后存活率提高效果不佳。

本发明人通过大量实验，得到一种能显著提高无色杆菌及其复配菌的真空冷冻干燥后成活率的保护剂，为无色杆菌及其复配菌的广泛应用提供基础。