一种用于检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的引物探针组合物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物技术体外诊断领域，具体而言，涉及一种用于检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的引物探针组合物及试剂盒。

背景技术

寄生虫是一类常见的能引起犬猫消化道疾病的病原体，主要寄生在犬猫肠道，通过吸食体内营养物质为生，造成犬猫机体出现营养不良甚至贫血的症状，危害犬猫健康。贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫是较为常见的两种犬猫消化道寄生虫。

其中，贾第鞭毛虫是一种原生动物寄生虫，分布广泛，可感染多种哺乳动物以及人类，犬猫常见感染蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)，主要造成慢性腹泻、软便、甚至便血等临床症状，基因分型发现蓝氏贾第鞭毛虫有A、B、C、D、F等多种集聚体，我国犬猫贾第鞭毛虫的集聚体主要为犬，C、D型，猫，F型。

胎儿三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)是一种单细胞有鞭毛的原虫，固定寄生于犬猫的结肠，是犬猫顽固、长期又时断时续的软便(时常带有粘膜和血丝)等肠道寄生虫病最常见的诱因，常与贾第虫症状混淆，易出现误诊。

目前临床上针对犬猫消化道寄生虫的常用诊断方法多为显微镜粪检法，微生物培养法、免疫学检测和PCR法等技术。其中，显微镜粪检法虽简单，但灵敏性不高，且对涂片操作和样本要求较高，较难区分贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫形态。微生物培养法的检测周期长，不适合临床快速检测。免疫学检测的灵敏度较低，检测病原单一。普通PCR方法可特异性的扩增病毒的基因片段，灵敏度较高，但需在扩增后进行凝胶电泳分析，容易造成污染，且PCR法主要以液态PCR反应体系为主，对于实验环境和操作人员要求较高，不易运输保存。

实时荧光定量PCR法在扩增的过程中即可监测到是否有病原体存在，无需电泳、无污染，且可通过对不同病原体的探针标记不同检测通道的荧光报告基团，实现同时对多种病原体进行核酸检测，此外，使用冻干PCR体系，可以降低人员操作步骤，方便常温保存和运输。

目前市面上鲜有报道同时检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的实时荧光定量PCR试剂盒。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的引物探针组合物及试剂盒以快速准确地实现两种寄生虫病原体的检测。发明人采用多重实时荧光PCR检测可实现快速准确地同时检测引起犬猫消化道疾病的两种寄生虫病原体，对猫消化道疾病的临床诊断及治疗有着重要的意义。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种用于同时检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的引物探针组合物，其包括用于检测贾第鞭毛虫的第一引物探针和用于检测胎儿三毛滴虫的第二引物探针，第一引物探针的序列如SEQ ID NO.1-3所示，第二引物探针的序列如SEQ ID NO.4-6所示。

具体的序列如下：

SEQ ID NO:1：贾第鞭毛虫-F ACGGAGAACGCMGARAGGA；

SEQ ID NO:2：贾第鞭毛虫-R GCGCTRACGGCYCTCTCG；

SEQ ID NO:3：贾第鞭毛虫-P ATCGTCTCCTTCTCGATSGCRG；

SEQ ID NO:4：

胎儿三毛滴虫-F1 GGATGTCTTGGCTTCTTACACG；

SEQ ID NO:5：

胎儿三毛滴虫-R1 CGCAATGTGCATTCAAAGATCGA；

SEQ ID NO:6：胎儿三毛滴虫-P1 TGCGATAAGCGGCTGGA。

本发明针对贾第鞭毛虫的靶基因beta-giardin基因(简称BG基因)设计引物和探针，经过检测验证，发明本发明提供的引物和探针能够覆盖蓝氏贾第鞭毛虫的A、B、C、D、F等多种类型的集聚体，具有阳性检出率100％的技术优势。本发明提供的上述引物探针具有检测灵敏度高、准确度高、特异性好的优势。由于不同类型的集聚体的序列在同一位点存在多个突变点，若扩增不同类型的集聚体，需要设计不同的引物探针，因此在设计的时候，一方面需要避开突变点，一方面通过设计简并序列使得引物探针可以同时扩增多种集聚体系列。而本发明提供的上述引物探针能够覆盖蓝氏贾第鞭毛虫的A、B、C、D、F等多种类型的集聚体，可以用于多种集聚体的扩增。

针对胎儿三毛滴虫的靶基因ITS1-ITS2设计引物和探针，本发明提供的用于胎儿三毛滴虫检测的引物探针具有检测灵敏度高、准确度高、特异性好的优势，有利于开发相应的检测试剂或试剂盒。

本发明的提出，可以直接一次性检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫，除了特异性好，灵敏度高的优势外，还具有检测时间短，检测过程无需开盖，无污染，可满足室温运输保存的需求。本发明的提出，为犬猫消化道寄生虫病的临床诊断提供了快速准确地检测方法。

在本发明应用较佳的实施方式中，第一引物探针和第二引物探针中探针的5’端均标记有荧光报告基团，第一引物探针和第二引物探针中探针的3’端均标记有荧光猝灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，荧光报告基团包括不限于FAM、VIC、HEX、CY3、NED、ROX、CY5、JOE、TET、TAXAS RED和ALEXA。

在本发明应用较佳的实施方式中，荧光淬灭基团包括不限于TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL和QSY。

只要能满足荧光的激活和猝灭，均可用于贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的荧光检测。

本发明还提供了一种用于同时检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的试剂或试剂盒，其包括上述的引物探针组合物。上述试剂或试剂盒具有较好的检测灵敏度和特异性，且检测耗时短，无污染，可以满足临床的快速检测需求。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒还包括PCR预混液，PCR预混液包括PCRbuffer和酶混合液。

PCR buffer是指能够满足PCR反应的溶液，包括dNTP、金属离子、稳定剂等成分，可选自市售的PCR buffer。

酶混合液包括Taq酶等物质。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒还包括阳性标准品。阳性标准品选自贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的靶基因的质粒。贾第鞭毛虫的靶基因为beta-giardin基因，长度为807bp。胎儿三毛滴虫的靶基因为ITS1-ITS2之间一段长298bp的序列。

本发明还提供了一种引物探针组合物在制备检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的试剂盒中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒在用于检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫时，PCR反应条件包括：95-96℃3-5min；95-96℃5-15s，60-62℃20-30s，共40个循环；其中60-62℃采集荧光信号。

在上述PCR反应条件下，荧光信号强度良好，可以满足寄生虫的检测。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒在用于检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫时，PCR反应条件包括：95℃3min；95℃5s，60℃20s；共40个循环，其中60℃采集荧光信号。

本发明具有以下有益效果：

本发明针对贾第鞭毛虫的靶基因beta-giardin基因设计的第一引物探针，经过检测验证，发明本发明提供的引物和探针能够覆盖蓝氏贾第鞭毛虫的A、B、C、D、F等多种类型的集聚体，具有阳性检出率100％的技术优势。本发明提供的上述引物探针具有检测灵敏度高、准确度高、特异性好的优势。

针对胎儿三毛滴虫的靶基因ITS1-ITS2设计的第二引物探针，具有检测灵敏度高、准确度高、特异性好的优势，有利于开发相应的检测试剂或试剂盒。

本发明的提出，可以直接一次性检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫，除了特异性好，灵敏度高的优势外，还具有检测时间短，检测过程无需开盖，无污染，可满足室温运输保存的需求。本发明的提出，为犬猫消化道寄生虫病的临床诊断提供了快速准确地检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为贾第鞭毛虫引物探针筛选结果图；

图2是胎儿三毛滴虫引物探针筛选结果图；

图3是试剂盒特异性测试中贾第鞭毛虫检测通道结果图；

图4是试剂盒特异性测试中胎儿三毛滴虫检测通道结果图；

图5是试剂盒检测限测试中贾第鞭毛虫在最低检测限的扩增图；

图6是试剂盒检测限测试中胎儿三毛滴虫在最低检测限的扩增图；

图7为贾第鞭毛虫的扩增产物测序后的结果与NCBI比对后的结果图；

图8为胎儿三毛滴虫的扩增产物测序后的结果与NCBI比对后的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的引物探针组合物。

发明人通过查询两种病原体的相关资料文献，针对贾第鞭毛虫的BG基因以及胎儿三毛滴虫ITS1-ITS2基因之间的序列进行引物设计，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成相关病原的质粒，并使用引物探针设计软件选择合适的序列，即尽量避免引物的二聚体和发卡结构，且其引物退火温度在60℃左右。特别的，贾第鞭毛虫的引物探针，优先覆盖C、D、F型，兼顾A、B型。筛选后得到如下序列：

初步设计后的引物探针序列均有多对引物或探针可选，对其进行筛选测试，测试过程如下：

委托赛默飞世尔科技公司进行合成引物探针，并按照说明书进行稀释。

分别对贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的临床样本进行核酸提取，提取后的病原体核酸，先使用Comparison of Microscopy,Rapid Immunoassay,and Molecular Techniquesfor the Detection of Giardia Lamblia and Cryptosporidium Parvum文献中正向引物-127R-5′-TTGCCAGCGGTGTCCG-3′和反向引物-105T,FAM-5′-CCCGCGGCGGTCCCTGCTAG 3′对贾第鞭毛虫的核酸进行扩增，采用Improvements in Tritrichomonas foetusmolecular testing文献中的正向引物GAACGTTGCATAATGCGATAAGC，反向引物AACATATATGCGTGTTCTAGCAAGCT，探针FAM-ATCTTTGAATGCACATTGCGCGCC-BHQ1对胎儿三毛滴虫的核酸进行扩增，然后对目的基因使用Sanger测序以确认贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的临床样本中确实分别含有贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫基因组。

分别使用不同引物或探针组合配制PCR试剂，并加入对应的真实阳性样本的病原体核酸，进行扩增，结果如图1和图2。

对各引物或探针组合的扩增结果进行筛选，优选的引物组应满足Ct值较小(Ct小于35)且荧光值更高。按照图1和图2的对比结果，选出每种病毒检测结果中最佳的一对引物，即:

SEQ ID NO:1：贾第鞭毛虫-F ACGGAGAACGCMGARAGGA；

SEQ ID NO:2：贾第鞭毛虫-R GCGCTRACGGCYCTCTCG；

SEQ ID NO:3：贾第鞭毛虫-PFAM-ATCGTCTCCTTCTCGATSGCRG-BHQ1；

SEQ ID NO:4：

胎儿三毛滴虫-F1 GGATGTCTTGGCTTCTTACACG；

SEQ ID NO:5：

胎儿三毛滴虫-R1 CGCAATGTGCATTCAAAGATCGA；

SEQ ID NO:6：胎儿三毛滴虫-P1HEX-TGCGATAAGCGGCTGGA-MGB。

实施例2

本实施例提供了一种检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的试剂盒，其包括实施例1中筛选出的检测效果较好的引物探针组合SEQ ID NO:1-6。

试剂盒采用25μL反应体系，包括17.95μL PCR反应液(Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl

PCR反应条件为：(1)95℃预变性3-5min；(2)95℃变性5-15s；(3)60℃退火/延伸20-30s，采集荧光。

其中(2)-(3)共进行40个循环。对反应条件进行优选，在不影响性能的条件下尽量缩减时间，最终确定的反应条件为：95℃3min；95℃5s，60℃20s；共40个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

实验例1

本实验例测试各引物或探针的特异性，将PCR的扩增产物进行测序，测序委托西安擎科生物科技有限公司进行。测序结果与NCBI中的贾第鞭毛虫(NCBI号：LC437431.1)和胎儿三毛滴虫(NCBI号：MK770857.1)的标准序列进行BLAST对比。

对比结果显示扩增产物确实为贾第鞭毛虫或胎儿三毛滴虫中的片段，符合预期，见图7和图8。

实验例2

本实验例对实施例2中的试剂盒进行特异性测试。

按照上述实施例2中犬猫消化道寄生虫病原体(贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫)核酸检测试剂盒的组分及比例进行配制，然后分别加入目标病原体和其它干扰病原体核酸进行测试，病原体包括贾第鞭毛虫、胎儿三毛滴虫、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒。按照实施例2优化后的PCR反应条件进行扩增。

图3为贾第鞭毛虫检测通道扩增图，其中有扩增曲线的为贾第鞭毛虫病毒，其余病原均未扩增；图4为胎儿三毛滴虫检测通道扩增图，其中有扩增曲线的为胎儿三毛滴虫病毒，其余病原均未扩增。表明检测试剂盒具有较高的检测特异性。

实验例3

本实验例对实施例2提供的试剂盒进行重复性测试。

本实验对贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫质粒进行扩增，每种样本重复扩增10次，得出下表数据，变异系数(CV，％)均小于2％。

实验例4

本实验例对实施例2提供的试剂盒进行灵敏度测试。

贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫的质粒均由通用生物(安徽)股份有限公司合成。将各病原体的质粒分别稀释至1.0×10

图5是贾第鞭毛虫在最低检测限(1.0×10

综上，本发明提供的检测引物探针组合物及试剂盒可一次性检测贾第鞭毛虫和胎儿三毛滴虫，特异性好，灵敏度高，检测时间短，且检测过程无需开盖，无污染，室温运输保存。为犬猫消化道寄生虫病的临床诊断提供快速准确地检测方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。