一种定位植物组织中植物激素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种定位植物组织中植物激素的方法。

背景技术

植物激素在植物生长发育的多个方面发挥着极其重要的作用，而且植物激素还是植物感受外部环境变化、调节自身生长状态和维持生存必不可少的信号分子。植物激素的分布和浓度对其生理反应很重要，只有作用位点中的激素积累才能诱发生理效应。生长素广泛参与植物发育的各种形态发生过程，一方面，生长素调控细胞分裂和促进细胞伸长；另一方面，以其分布的浓度梯度影响植物个体及其器官的形态建成，因此，了解植物激素在组织和器官中的分布特点和分布模式对理解植物的生长发育有重要意义，是探讨植物激素在植物体内发挥作用机制的基础。

现有对于植物激素在植物组织中的分布情况的了解仍然很少，基于此，如何提供一种简便、准确、快速和清晰的方式测定植物内源激素的分布和含量情况，是本领域技术人员在研究中急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种定位植物组织中植物激素的方法，在无需组织切片的前提下，对植物组织中植物激素的分布和含量情况进行简便、准确、快速和清晰的观测。

根据本发明的一个方面，提供一种定位植物组织中植物激素的方法，包括如下步骤：S1.向植物组织中加入固定剂进行固定处理，得到预处理的植物组织；上述固定剂包括多聚甲醛，哌嗪-1,4-二乙磺酸，硫酸镁，乙二胺四乙酸，其中，多聚甲醛在固定剂中的质量百分比为4％，哌嗪-1,4-二乙磺酸在固定剂中的浓度为50mmol/L，所述硫酸镁和所述乙二胺四乙酸在固定剂中的浓度为5mmol/L；S2.向预处理的植物组织中加入封闭剂进行封闭处理，得到待测植物组织；S3.将待测植物组织与辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体结合，然后加入磷酸缓冲液进行洗脱处理，得到植物激素抗原-辣根过氧化物酶标抗体复合物；S4.向植物激素抗原-辣根过氧化物酶标抗体复合物中加入含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢的显色剂发生显色反应，然后加入终止剂终止所述显色反应后观察和拍照。本发明提供的方法首先对植物组织进行固化处理和封闭处理，并采用特定的固定剂对植物组织进行固定，该固定剂能够快速地渗透进入植物组织中发挥固定作用，有效地防止植物组织中内源激素的流出对观测结果造成不利影响，从而保证了定位效果的准确性，而且采用该固定剂进行固定处理能够在保留植物组织的原状的前提下实现对植物激素的快速固定和原位固定，操作简单快速。固定处理和封闭处理之后将待测植物组织与辣根过氧化物酶(HRP)标记的植物激素抗体结合形成植物激素抗原-辣根过氧化物酶标抗体复合物，然后洗脱并加入含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的显色剂发生显色反应，在HRP催化下TMB产生可溶性蓝色产物附着在植物组织上，且植物组织颜色深浅与植物激素含量呈正相关，通过观察蓝色产物的位置和蓝色产物的显色深浅程度从而判断植物激素的分布情况和含量情况。本发明操作简单快速，结果形象直观，能够有效地避免非特异性染色的干扰，将植物激素在植物组织内的分布与含量可视化，同时能够保证观测结果的准确性和稳定性，并且本发明提供的方法不需要进行组织切片，进一步在保证植物组织完整性的前提下简单快速地实现了植物激素的原位定位。

优选地，加入固定剂进行固定处理之后，加入磷酸缓冲液进行洗脱处理。

优选地，封闭剂包括牛血清蛋白，其中，牛血清蛋白在封闭剂中的质量百分比为2％。封闭剂中的牛血清蛋白(BSA)能够封闭非特异性位点，提高检测结果的准确性。

优选地，加入封闭剂进行封闭处理之后，加入磷酸缓冲液进行洗脱处理。

优选地，在S3中，辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体的浓度为8～15ug/ml。由于过高浓度的HRP会导致后续TMB染色呈现绿色或红色，以及加入终止剂终止显色反应易出现沉淀，因此将植物组织与在上述浓度的HRP标记的植物激素抗体结合，能够改善植物激素的定位效果，有利于清晰准确地观测到植物激素的分布和含量。

优选地，辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体的制备方法包括：

S3.1将植物激素抗体在碳酸盐缓冲液中进行透析，得到预处理植物激素抗体；碳酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为9.6；预处理植物激素抗体的浓度为2mg/ml；

S3.2将辣根过氧化物酶加入高碘酸钠溶液和乙二醇中在4℃避光条件下进行氧化反应30分钟，溶液变为褐色表示辣根过氧化物酶氧化完成，即得到氧化的辣根过氧化物酶；辣根过氧化物酶的浓度为2mg/ml，高碘酸钠溶液的浓度为0.1mol/L，辣根过氧化物酶与高碘酸钠溶液的体积比为1：1；

S3.3将上述预处理植物激素抗体与上述氧化的辣根过氧化物酶混合均匀并在室温反应2小时，然后加入硼氢化钠在4℃进行还原反应30分钟，得到辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体；辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体的浓度为10ug/ml；预处理植物激素抗体与氧化的过氧化物酶的摩尔比为1：4，硼氢化钠溶液的浓度为0.5mol/L；硼氢化钠溶液与氧化的辣根过氧化物酶的体积比为1：10。该方法首先通过透析将植物激素抗体中含有的游离氨基除去，并将HRP的糖基氧化成醛基，使醛基与抗体的氨基发生反应形成稳定结构，进而加强植物激素抗体的特异性和亲和力，有利于后续的显色反应更加准确和清晰，从而提高结果的准确性和稳定性。

优选地，磷酸缓冲液包括氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾，其中，氯化钠的浓度为0.14mmol/L，氯化钾的浓度为2.7mmol/L，磷酸氢二钠的浓度为10mmol/L，磷酸氢二钾的浓度为1.8mmol/L。磷酸缓冲液中不含有Tris、NH4

优选地，在S3中，待测植物组织与辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体结合的温度为35～40℃，时间为25～35分钟。上述温度能够在保证结果的稳定性和准确性的前提下，使HRP标记的抗体与植物组织中的植物激素充分结合。上述温育时间既能保证充分且快速使植物激素与酶标抗体结合，又能避免长时间温育导致后续染色终止后出现沉淀等干扰情况造成结果的不准确和不清晰。

优选地，待测植物组织与辣根过氧化物酶标记的植物激素抗体结合的温度为37℃，时间为30分钟。

优选地，在S4中，显色剂是由显色剂A液和显色剂B液按照体积比1:1复配而成，其中，显色剂A液包括过氧化氢、乙二胺四乙酸、柠檬酸和磷酸氢二钠；显色剂B液包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、盐酸和聚乙烯吡咯烷酮。本发明通过优化显色液的配方，采用特定组分组成的显色剂检测待测植物组织中的植物激素，并在使用前将多个组分进行合理复配形成统一的显色剂，进而使显色时不易产生沉淀，降低了非特异性染色的干扰，并且通过加入聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂使显色结果更加稳定和准确。

优选地，在显色剂A液中，过氧化氢的浓度为0.5mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L、柠檬酸的浓度为0.5mmol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.5mmol/L；在显色剂B液中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为1mmol/L、盐酸的浓度为1mmol/L，吡咯烷酮羧酸的质量百分比为10％。通过控制显色剂组分的含量，能够在较快的时间内完成显色反应，并保证结果的准确性和稳定性。

优选地，显色反应的温度为35～40℃，时间为5～15分钟。上述温度能够实现充分且完全地进行显色反应，进而判断植物组织中的植物激素的分布和含量情况。

优选地，显色反应的温度为37℃，显色反应的时间为10分钟。

优选地，终止剂与显色剂的体积比为1：1，终止剂包括硫酸和二甘醇，其中，硫酸的浓度为0.5mol/L，二甘醇在终止剂的质量百分比为5％。上述含量的终止剂能够有效地终止显色反应，避免显色过度、发生沉淀等现象造成结果不清晰和不准确。

优选地，植物激素为生长激素。

附图说明

图1为本发明实施例1中显色时间(分别为0、5、10min)对拟南芥根尖IAA染色影响示意图；

图2为本发明实施例1中显色剂处理5分钟对拟南芥根尖染色区域影响示意图；

图3为本发明实施例2中利用浓度分别为0、5、25、50nmol/L的外源IAA处理拟南芥幼苗根尖后染色情况示意图；

图4为本发明实施例2中利用外源IAA处理拟南芥幼苗根尖后染色灰度图；

图5为本发明对比例1中不加入HRP标记的抗体后的显色时间(分别为0、5、10min)对拟南芥根尖IAA染色影响示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例和实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种定位植物组织中植物激素的方法，包括以下步骤：

1.固定：取根长为2cm的植物组织，浸入足量固定剂中反应30min；上述固定剂包括多聚甲醛，哌嗪-1,4-二乙磺酸，硫酸镁，乙二胺四乙酸，其中，在固定剂中多聚甲醛的质量百分比为4％，哌嗪-1,4-二乙磺酸的浓度为50mmol/L,硫酸镁的浓度为5mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5mmol/L；

2.洗脱：将上述固定好的植物组织移至足量磷酸缓冲液中反复冲洗3-5遍，得到预处理的植物组织；其中磷酸缓冲液包括氯化钠0.14mmol/L，氯化钾2.7mmol/L，磷酸氢二钠10mmol/L，磷酸氢二钾1.8mmol/L；

3.封闭：将上述预处理的植物组织转入足量封闭剂中反应30min；其中按照质量百分比计算，封闭剂中含有2％牛血清蛋白；

4.洗脱：操作同2，得到待测植物组织；

5.将上述待测植物组织与HRP标记的抗体结合：

5.1抗体处理：生长素抗体利用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)透析，浓度配置为2mg/ml；

5.2HRP氧化：2mg/ml辣根过氧化物酶(HRP)与0.1mol/L高碘酸钠等体积混合，并加入乙二醇(乙二醇的体积为HRP与高碘酸钠混合溶液体积的1％)4℃避光反应30分钟，溶液变为褐色表示HRP氧化完成；

5.3HRP标记IAA抗体:将2mg/ml生长素抗体与氧化的HRP溶液按摩尔比1：4混匀，室温反应2小时；加入HRP溶液体积10％0.5mol/L硼氢化钠溶液4℃反应30分钟，得到浓度为1mg/ml HRP标记好的IAA抗体，稀释至10ug/ml备用，然后将上述洗脱好的植物组织浸入HPR标记好的IAA抗体溶液中，37℃温育30min，

6.洗脱：操作同2，得到生长素抗原-辣根过氧化物酶标抗体复合物；

7.显色：将上述生长素抗原-辣根过氧化物酶标抗体复合物浸入含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢的显色剂中，37℃避光温育5min；显色剂为显色剂A液和显色剂B液等体积混合调整pH为4.0然后0.22um滤膜过滤得到的，其中，显色剂A液包括过氧化氢0.5mol/L,乙二胺四乙酸1mmol/L，柠檬酸0.5mol/L,磷酸氢二钠0.5mmol/L；显色剂B液包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)1mmol/L，HCl 1mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮10％；

8.终止：将终止液等体积混入上述显色剂中；其中终止液包括浓度为0.5mol/L硫酸和质量百分比为5％的二甘醇。

9.观测：利用光学显微镜明场拍摄植物组织。生长素(IAA)在拟南芥根尖的分布如图1所示(图1由左向右依次为加入显色剂处理0、5、10min利用光学显微镜明场对拟南芥幼苗根尖拍照结果)，显色区域如图2所示(图2为加入显色剂处理5min利用光学显微镜明场对拟南芥幼苗根尖拍照，虚线方框内为根尖显色区域，图2中的右图为左图的放大图)，由图可知，本发明提供的方法成功地在拟南芥的根尖中实现了对生长素进行了定位，没有出现非特异性染色，加入显色剂5min相较于加入显色剂10min的颜色略浅，显色5min和显色10min均可以清晰辨别生长素的分布和通过颜色深浅判断生长素的浓度，且该方法简单快速。

按照上述方法设置3次重复实验，进行植物组织中植物激素的定位并观测，观测结果同上，都可以快速且清晰地辨别生长素的分布和通过颜色深浅判断生长素的浓度。由此说明，本发明提供的定位植物组织中植物激素的方法稳定性高，可重复性好。

实施例2

本实施例参照实施例1进行植物组织中植物激素的定位，本实施例与实施例1构成区别的是：将实施例1步骤1的植物组织替换为经过含有外源IAA溶液(IAA在含有外源IAA溶液中的浓度分别为0、5、25、50nmol/L)处理后的植物组织。除了上述区别以外，本实施例所采用的物料以及工艺操作与实施例1严格保持一致。IAA在拟南芥根尖的分布如图3所示(图3由左向右依次为加入浓度分别为0、5、25、50nmol/L IAA处理植物组织，在显色剂处理5min利用光学显微镜明场对拟南芥幼苗根尖拍照结果)，灰度值如图4所示。由图3可知，本发明提供的方法成功地在拟南芥幼苗根尖中对IAA进行了定位，染色清晰，没有出现非特异性染色；由图4可知，颜色深浅与植物生长素含量呈正相关，随着IAA含量的升高，灰度值更高，显色程度更深。因此可以通过观察IAA的颜色位置和颜色深浅程度判断生长素的分布和含量，且该方法简单快速。

对比例1

本对比例提供一种定位植物组织中植物激素的方法，包括以下步骤：用液氮研磨粉碎拟南芥根尖组织后称取0.1g于1.5mL离心管中，加入180μL PBS，使用植物生长素(IAA)酶联免疫分析试剂盒(Meimian Industrial Co.,Ltd,China)，加入待测样品10μL和样品稀释液40μL于酶标板底部，用封板膜封板后置于37度温育30min，小心揭掉封板膜，弃去液体甩干，每孔加满洗涤液静置30s后弃去，每孔加入酶标试剂50μL置于37度温育30min，弃去液体，每孔加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀37度避光显色10min，每孔加入50μL终止液，450nm波长依次测量各孔的吸光度(OD值)。本对比例可以实现生长素的定位，但需要经过仪器才能观测生长素的分布和含量情况，不能在不破坏植物组织的前提下实现对植物激素的原位定位。

对比例2

本对比例参照实施例1进行植物组织中植物激素的定位，本对比例与实施例1构成区别的是：省略实施例1步骤5(将植物组织与HRP标记的抗体结合)。除了上述区别以外，本对比例所采用的物料以及工艺操作与实施例1严格保持一致。本对比例定位植物激素的观测结果如图5所示(图5由左向右为不加入HRP标记的抗体后显色剂处理0、5、10min利用光学显微镜明场对拟南芥幼苗根尖拍照结果)，观测结果说明，显色时间分别为5min和10min对应的生长素显色浅，无法清晰观测显色情况及深浅程度。由此说明，采用本发明提供的方法利用HRP标记的生长素抗体对生长素进行定位，能够清晰观测生长素的分布情况和含量情况，进而改善生长素的定位效果，使生长素的分布和含量可视化。

对比例3

本对比例参照实施例1进行植物组织中植物激素的定位，本对比例与实施例1构成区别的是：将实施例1步骤1的固定剂替换为由4％多聚甲醛、DMSO、NP-40组成的显色剂。除了上述区别以外，本实施例所采用的物料以及工艺操作与实施例1严格保持一致。本对比例定位植物激素的观测结果如下：生长素的显色浅、呈现浑浊，无法清晰观测到显色情况及显色深浅程度。将实施例1与本对比例对植物组织中植物激素的定位效果做比对，在相同的固定时间下，采用实施例1提供的固定剂固定生长素，该固定剂的固定效果更好，生长素不容易溢出，显色快速且清晰；而且能够在不进行组织切片的前提下实现原位观测生长素的分布情况和含量情况。由此说明，采用本发明提供的方法利用特定的固定剂对植物组织进行固定，能够在保证植物组织完整性的前提下实现原位观测植物激素，并改善生长素的定位效果。

对比例4

本对比例参照实施例1进行植物组织中植物激素的定位，本对比例与实施例1构成区别的是：将实施例1步骤1的固定剂替换为由4％多聚甲醛、硫酸镁、乙二胺四乙酸组成的显色剂。除了上述区别以外，本实施例所采用的物料以及工艺操作与实施例1严格保持一致。本对比例定位植物激素的观测结果如下：生长素显色浅、且呈现浑浊，无法清晰观测到显色的深浅程度。将实施例1与本对比例对植物组织中植物激素的定位效果做比对，在相同的固定时间下，采用实施例1提供的固定剂固定生长素，该固定剂的固定效果更好，生长素不容易溢出，显色快速且清晰；而且能够在不进行组织切片的前提下实现原位观测生长素的分布情况和含量情况。由此说明，采用本发明提供的方法利用特定的固定剂对植物组织进行固定，能够在保证植物组织完整性的前提下实现原位观测植物激素，并改善生长素的定位效果。

对比例5

本对比例参照实施例1进行植物组织中植物激素的定位，本对比例与实施例1构成区别的是：省略实施例1步骤1(固定)。本对比例定位植物激素的观测结果如下：植物组织显色浅，无法清晰地观测IAA的分布情况。由此说明，采用本发明提供的方法利用固定剂对植物组织进行固定处理，能够保存植物组织的抗原性和细微结构，从而提高生长素的定位效果，有利于清晰准确地观测生长素的分布和含量。

对比例6

对比例参照实施例1进行植物组织中植物激素的定位，本对比例与实施例1构成区别的是：省略实施例1步骤3(封闭)。除了上述区别以外，本对比例所采用的物料以及工艺操作与实施例1严格保持一致。本对比例的观测结果如下，植物组织显色浑浊、有杂质、无法清晰观测IAA的分布。由此说明，采用本发明提供的方法向植物组织中加入封闭剂进行封闭处理，能够避免生长素的分解和非特异性的吸附，进而改善显色效果，保证了对生长素原位定位的准确性和稳定性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。