一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用。

背景技术

环境与遗传因素共同决定了叶柄的发育。光照和温度等环境因素影响叶柄的发育(Tsukaya et al.,2002)。在许多植物中，光敏色素控制这叶柄的伸长(Morgan and Smith1979,Child et al.1981,Duke and Lane 1984)。在长日照条加下，大豆叶柄长度较短日条件下变的更长(Thomas et al.,1985)。叶柄有无的遗传往往被认为是由显性单基因控制(陈果等，2017；刘洪泰等，2019；李肯，2019)。在烟草中，陈果等(2017)利用EMS诱导短叶柄突变体与无叶柄烟草种质革新三号杂交，构建F

综上所述，关于烟草叶柄有无的遗传研究，仅仅局限于经典的遗传分析和初步定位上，控制叶柄有无的基因还未被克隆，因此本发明提出一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用克服现有技术的不足和填补其研究领域的空白。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用，具有用于控制烟草叶柄发育和提高烟草生长质量和产量的优点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用。

优选的，所述控制烟草叶柄形成发育的基因包括NtabKNOX1基因，所述NtabKNOX1基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸的CDS序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。

优选的，所述NtabKNOX1基因的亲本选自烤烟品种K326和香料烟种质Samsun。

优选的，所述NtabKNOX1基因包含突变体Samsun-cas9-30或Samsun-cas9-34，所述Samsun-cas9-30的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述Samsun-cas9-34的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

优选的，所述突变体Samsun-cas9-30在NtabKNOX1基因的第一个外显子上有一个T碱基插入；

所述突变体Samsun-cas9-34在NtabKNOX1基因的第一个外显子上有一个A碱基插入。

优选的，所述NtabKNOX1基因不包含突变体Samsun-cas9-30和/或Samsun-cas9-34。

优选的，所述NtabKNOX1基因用于控制植物叶片的形态形成和发育。

优选的，所述NtabKNOX1基因用于控制烟草叶柄的形成和发育。

优选的，S1.大田环境下调查从烟草BC

S2.通过已公布的烟草K326参考基因组比对和基因组注释分析，确定目标基因区间内与生长发育相关的基因，确定其为候选基因并命名为NtabKNOX1基；

S3.利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑突变体，根据NtabKNOX1基因的CDS序列设计两个编辑靶位点SG1和SG2，靶位点引物序列分别为SG1：GTTTATGGAAGAAGCAGCGG；SG2：GGGCGAGGCTATCGGCAGTA，编辑载体采用BGK012-DSG载体；

S3.1.选取NtabKNOX1基因的CDS序列的两个靶位点SG1和SG2两个靶位点，分别设计Oligo(5’-3’)UP/LW引物；

S3.2.制备Oligo二聚体并通过T4连接酶与线型转化载体即gRNA-u6连接，反应体系为：配置gRNA-u6片段，1μl；T4 ligase，0.3μl；Oligo二聚体，0.3μl；T4 PNK，0.1μl混匀后瞬时离心，在23℃条件下反应1h，继续加入T4 ligase，0.3μl；H

S3.3.取上述反应液转化到DH5α感受态细胞中，冰浴静置30min后取出，42℃热激30s，立即置于冰上2min；加入LB液体培养基，振荡培养；取菌液涂布于LB固体培养基(LB+50mg/LKan)上，倒置培养，过夜；

S3.4.挑取单克隆接种到LB液体培养基(LB+50mg/LKan)中，扩大培养至浑浊，采用质粒提取试剂盒进行抽提；

S3.5.将测序成功的质粒转化EHA105感受态细胞中，保存菌种。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明不仅精确定位了基因区间位置，还控制烟草叶柄生长发育的基因进行克隆，分析了NtabKNOX1基因生物信息学，并对其功能进行了证明，该型基因可以广泛用于控制烟草叶柄的生长，构型和发育，可以用于提高叶片的机械支持和营养输送的效率，对烟草的生长质量和产量带来的显著的正面影响，对提高该种经济作物所带来的经济效益具有明显的现实意义。

附图说明：

图1为本发明的NtabKNOX1基因结构示意图及Samsun-cas9-30和Samsun-cas9-34突变体CRISPR/Cas9基因编辑位点；

图2位本发明的Samsun(野生型)、Samsun-cas9-30(突变体)和Samsun-cas9-34(突变体)三种材料的叶片比较图。

具体实施方式

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种控制烟草叶柄形成发育的基因的克隆方法和应用。

试验材料：

亲本为烤烟品种K326(无叶柄)，香料烟种质Samsun(有叶柄)。双亲配置杂交组合F

实施方法：

1.目标基因精细定位

在之前研究基础上(刘洪泰等，2019)，在目标区间(Chr05:M5-84_M5-42)内进一步加密标记。在大田环境条件下调查各BC

2.确定候选基因

通过已经公布的烟草K326参考基因组(https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome)比对和基因组注释分析，发现精细定位区间内包含一个与生长发育相关的基因，该基因的拟南芥同源基因为AT4G08150.1，该基因为编码同源异型盒蛋白的转录因子，在植物叶片的形态建成中起重要作用。因此将该基因确定为候选基因，命名为NtabKNOX1。

3.候选基因NtabKNOX1验证

为了获得NtabKNOX1基因编辑突变体，首选利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑突变体，根据NtabKNOX1基因的CDS序列，利用在线网站(http://www.multicrispr.net/index.html)设计两个编辑靶位点SG1和SG2。靶位点引物序列分别为SG1：GTTTATGGAAGAAGCAGCGG；SG2：GGGCGAGGCTATCGGCAGTA，编辑载体采用BGK012-DSG载体。针对目标基因编辑操作主要包括以下几部分：

1)编辑载体构建

a.设计靶位点引物：选取NtabKNOX1基因的CDS序列的两个靶位点SG1和SG2两个靶位点，分别设计Oligo(5’-3’)UP/LW引物

b.制备Oligo二聚体：配置20μL反应体系：Anneal Buffer，16μl；SG1-UP，1μl；SG1-LW，1μl；SG2-UP，1μl；SG2-LW，1μl；配置好之后混匀，进行PCR反应，程序设置如下：变性95℃，3min；退火，20℃；以约0.2℃/秒缓慢降至20℃。

c.通过T4连接酶将线性化载体与Oligo二聚体连接，反应体系：gRNA-u6片段，1μl(线性化载体)；T4 ligase，0.3μl；Oligo二聚体，0.3μl；T4 PNK，0.1μl；配置好之后混匀，瞬时离心，23℃反应1h，继续加入以下成分，23℃反应1h或者4℃过夜；T4 ligase，0.3μl；H

d.取5μl上述反应液转化到50μlDH5α感受态细胞中，轻轻弹拨混匀，冰浴静置30min(不可晃动)；轻轻取出，42℃热激30s，立即置于冰上2min；加入100μl LB液体培养基，37℃振荡培养1h；取60μl菌液涂布于LB固体培养基(LB+50mg/LKan)上，37℃倒置培养，过夜。

e.挑取单克隆接种到LB液体培养基(LB+50mg/LKan)中，扩大培养至浑浊，按照北京全式金公司的

f.将测序成功的质粒转化EHA105感受态细胞中，保存菌种，便于用于烟草的遗传转化。

2)烟草农杆菌遗传转化

a.无菌苗准备

消毒：首先将受体材料Samsun种子装入2mL的离心管，在无菌超净工作台中，加入700μL75％乙醇溶液浸泡30sec，吸出乙醇溶液，用灭菌的ddH

b.叶片的预培养/农杆菌的培养

农杆菌复苏：将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有相应抗生素的平板上划线，28℃黑暗培养2天至出现单菌落；预培养：大约4周以后，选择健壮且较嫩的XHJ1025植株，在超净工作台中将无菌苗叶片剪成约0.5cm*0.5cm大小的1cm

c.农杆菌的侵染转化

在超净工作台中，将预培养好的叶片放入9cm无菌玻璃皿中，加入适量农杆菌菌液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温放置侵染8～10min(具体看叶片及菌液的状态)，并不时晃动。

侵染后取出叶盘放到灭过菌的滤纸上吸去表面菌液，置于TC培养基，叶背面朝上，25℃人工气候室中，黑暗培养3d；

利用灭菌的ddH

14d后，将边缘长出阳性愈伤的叶片转移到TS培养基上继续培养，一般15d天左右可分化出小芽，30天时可分化出幼苗；

待分化出的小芽长到2～3cm左右，将其切下先转移到TR培养基，让幼苗长大，待取样鉴定后将阳性单株转移到生根瓶中，继续培养至可以移栽。

(4)PCR鉴定转基因烟草

以SLS法提取的转基因烟草的基因组DNA为模板，分别检测CRISPR/Cas9转基因植株是否含有抗潮霉素的筛选基因与SG1/SG2的编辑情况。扩增体系如下：2×EasyTaq PCRMasterMix，10μL；PrimerF，0.5/0.5μL；Primer R，0.5/0.5μL；DNA模板，2μL；ddH

3)目标基因NtabKNOX1纯合编辑突变体获得

鉴定为编辑成功的阳性苗T0代自交收获种子，种植获得T1代，利用PCR方法扩增编辑位点，筛选获得纯合编辑材料。

4)NtabKNOX1基因编辑纯合突变体表型观察

盘栽种植野生型Samsun及目标基因编辑纯合突变体，在烟草旺长期观察有无叶柄表型。

结果：

1.NtabKNOX1基因生物信息学分析

NtabKNOX1基因全长5723个碱基，CDS序列为1089个碱基，编码363个氨基酸，功能注释为同源异型盒蛋白的转录因子。

2.NtabKNOX1基因敲除突变体表型

利用CRISPR/Cas9技术对Samsun中的NtabKNOX1进行了基因编辑，获得了两个纯合编辑突变体Samsun-cas9-30和Samsun-cas9-34。如图1所示，两个纯合突变体在基因NtabKNOX1第一个外显子上有一个T或者A的碱基插入，进而导致编码蛋白提前终止，影响了功能。

进一步比较了野生型Samsun和两个突变体Samsun-cas9-30和Samsun-cas9-34的叶柄表型。如图2所示，两个突变体Samsun-cas9-30和Samsun-cas9-34的叶基部长出叶耳，导致叶柄消失。结果强烈证明，基因NtabKNOX1控制叶柄的有无，该基因的功能缺失，导致无叶柄表型。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。