一种具备靶向抑制阿霉素诱导心肌细胞铁死亡的小分子多肽纳米药物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地说，它涉及一种具备靶向抑制阿霉素诱导心肌细胞铁死亡的小分子多肽纳米药物的制备方法。

背景技术

癌症是造成全球人类死亡的主要疾病之一，癌症作为一种全身性疾病，通常伴有远处器官的侵袭和严重的多器官功能损害，其较高的发病率和死亡率，带来了严重的社会负担。阿霉素作为一种广谱的化疗药物，在肿瘤治疗中得到了广泛的应用。但是，由于其存在剂量依赖性的心脏毒副作用，给患者带来了严重的健康负担，在一定程度上限制了阿霉素的临床应用。因此，减轻阿霉素的心脏毒副作用是亟待解决的问题。

阿霉素对心肌的毒副作用是多因素的，其中氧化应激和细胞死亡占据了主导地位。铁死亡(ferroptosis)作为一种新的调节性细胞死亡，受到研究人员的广泛关注。不同于通常的细胞死亡方式，铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化作用引起的细胞死亡，在形态和机制上有别于其他细胞死亡形式。新近的证据表明铁死亡在阿霉素心肌病中起着关键作用。因此通过一种有效的药物递送策略，将具有抗氧化应激和抑制心肌细胞铁死亡的药物(黄芪苷)精确递送到损伤的心脏部位，并在损伤部位实现较长时间的滞留是一种理想且高效的治疗方案。对于减轻阿霉素心肌损伤，扩大阿霉素的治疗窗口具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具备靶向抑制阿霉素诱导心肌细胞铁死亡的小分子多肽纳米药物的制备方法，其制备的小分子多肽纳米药物，能够靶向阿霉素心肌细胞，从而实现药物在损伤部位的特异性富集。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种具备靶向抑制阿霉素诱导心肌细胞铁死亡的小分子多肽纳米药物的制备方法，包括以下三个步骤：

S1.以Fmoc固相合成方法制备黄芪苷-多肽化合物(BA-pep)和空载体-多肽化合物(Nap-pep)；

S2.将黄芪苷-多肽化合物配置成PBS溶液；

S3.制备小分子多肽纳米药物。

本发明进一步设置为：所述以Fmoc固相合成方法制备黄芪苷-多肽化合物(BA-pep)和空载体-多肽化合物(Nap-pep)的具体操作步骤如下：

1)称取二氯树脂(载量：1.4mmol/g)倒入干燥的固相管中，加入适量二氯甲烷(DCM)，放摇床上30min，通氮气5min，使二氯树脂充分膨胀，压出二氯甲烷溶剂；

2)根据固相管中二氯树脂容量，称取苯丙氨酸Phe(F)(Fmoc-Phe-OH)，加入等摩尔的DIPEA，用二氯甲烷溶解，混合，加入到固相反应器中，再往反应溶液等量的DIPEA，反应1-2h；

3)反应结束后，压干反应液，使用二氯甲烷洗5遍，每次洗1min，然后加入封闭液反应15-30min以封闭树脂上的活性集团，压干反应液；其中封闭液为二氯甲烷、甲醇和DIPEA组成，配制体积比为DCM:MEOH:DIEA＝17-20:2:1。

4)挤出封闭液，并用二氯甲烷洗5次，每次1min，再用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗5次，每次1min；

5)切掉Fmoc保护基团：用20％的哌啶(溶剂为DMF)，切割20-40min，脱除苯丙氨酸上的保护基Fmoc，使之裸露出氨基，压干反应液，用DMF洗5遍每次1min；

6)称取下一个氨基酸脯氨酸Pro(P)(Fmoc-Pro-OH)和等摩尔的HBTU于干燥的小瓶中，加入等摩尔的DIEA，用DMF溶解，超声助溶后，加入固相管反应2h，之后挤出溶液，并用DMF洗5次，1min/次；用20％的哌啶(溶剂为DMF)，切割20-40min，脱除保护基Fmoc，使之裸露出氨基，压干反应液，用DMF洗5遍每次1min；

7)重复上述步骤6)，接着依次加入Fmoc-His-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(otBu)-OH，Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Phe-OH以及最后的黄芪苷。随着肽链的延长，反应难度也逐渐增加，因此，反应后续的氨基酸用量逐渐增加到第一个氨基酸用量的3-6倍以提高目的多肽的产率；

8)反应完成后，用DMF洗5次，再用DCM洗5次，每次1min，配切割液适量，切割液为95％的是三氯乙酸TFA，配制成三异丙基硅烷TIS和水的混合溶液，其体积分数为95％TFA：2.5％TIS：2.5％H

9)收集的液体在旋转蒸发仪上旋干，加入适量无水乙醚，静置3-5min，可见白色沉淀析出，之后用高速离心机离心后去上清，白色沉淀进行冻干得粗产物，产物经高效液相色谱仪提纯后使用。

本发明进一步设置为：所述将黄芪苷-多肽化合物配置成PBS溶液的具体操作步骤如下：所述将黄芪苷-多肽化合物配置成PBS溶液的具体操作步骤如下：在磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合磷酸盐中加入纯水使其溶解得到PBS溶液，随后将黄芪苷-多肽化合物倒入成胶小瓶，并用PBS溶液溶解。

本发明进一步设置为：所述制备小分子多肽纳米药物的具体操作步骤如下：

1)用碳酸钠将S2中所配溶液调pH至中性；

2)将该溶液于酒精灯上加热至沸腾；

3)冷却后可得到具备一定纳米结构的自组装纳米药物。

本发明进一步设置为：所述黄芪苷-多肽化合物结构式为：

所述空载体-多肽化合物化合物结构式为：

本发明进一步设置为：所述PBS溶液的配置需要磷酸二氢钠38.0g，磷酸氢二钠5.04g，并加水定容至1000ml；且每1000mlPBS溶液溶解8.0-12.0g黄芪苷-多肽化合物。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

(1)通过本发明制备的小分子多肽纳米药物，可以实现阿霉素心肌损伤部位的特异性富集。

(2)通过本发明制备的小分子多肽纳米药物，能够显著抑制阿霉素引起的心肌细胞铁死亡，从而实现对阿霉素心肌损伤的治疗。

附图说明

图1是本发明中黄芪苷-多肽发生自组装前后图片；

图2是本发明得到的黄芪苷-多肽纳米药物对经阿霉素处理的H9C2细胞后细胞存活的死活染色图；

图3是本发明得到的黄芪苷-多肽纳米药物对经阿霉素处理的H9C2细胞后铁离子沉积荧光染色图；

图4本发明得到黄芪苷-多肽纳米药物对经阿霉素处理的H9C2细胞后，WB实验验证纳米药物对铁死亡信号通路的影响。

具体实施方式

以下结合附图1-4对本发明作进一步详细说明。

实施例1：多肽化合物Baicalin-FFYEEG-DRVYIHPF和Nap-FFYEEG-DRVYIHPF的固相法合成：

1)称取二氯树脂(载量：1.4mmol/g)倒入干燥的固相管中，加入适量二氯甲烷(DCM)，放摇床上30min，通氮气5min，使二氯树脂充分膨胀，压出二氯甲烷溶剂；

2)根据固相管中二氯树脂容量，称取苯丙氨酸Phe(F)(Fmoc-Phe-OH)，加入等摩尔的DIPEA，用二氯甲烷溶解，混合，加入到固相反应器中，再往反应溶液等量的DIPEA，反应1-2h；

3)反应结束后，压干反应液，使用二氯甲烷洗5遍，每次洗1min，然后加入封闭液反应15-30min以封闭树脂上的活性集团，压干反应液；其中封闭液为二氯甲烷、甲醇和DIPEA组成，配制体积比为DCM:MEOH:DIEA＝17-20:2:1。

4)挤出封闭液，并用二氯甲烷洗5次，每次1min，再用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗5次，每次1min；

5)切掉Fmoc保护基团：用20％的哌啶(溶剂为DMF)，切割20-40min，脱除苯丙氨酸上的保护基Fmoc，使之裸露出氨基，压干反应液，用DMF洗5遍，每次1min；

6)称取下一个氨基酸脯氨酸Pro(P)(Fmoc-Pro-OH)和等摩尔的HBTU于干燥的小瓶中，加入等摩尔的DIEA，用DMF溶解，超声助溶后，加入固相管反应2h，之后挤出溶液，并用DMF洗5次，1min/次；用20％的哌啶(溶剂为DMF)，切割20-40min，脱除保护基Fmoc，使之裸露出氨基，压干反应液，用DMF洗5遍每次1min；

7)重复上述步骤6)，接着依次加入Fmoc-His-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(otBu)-OH，Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Phe-OH以及最后的黄芪苷。随着肽链的延长，反应难度也逐渐增加，因此，反应后续的氨基酸用量逐渐增加到第一个氨基酸用量的3-6倍以提高目的多肽的产率；

8)反应完成后，用DMF洗5次，再用DCM洗5次，每次1min，配切割液适量，切割液为95％的是三氯乙酸TFA，配制成三异丙基硅烷TIS和水的混合溶液，其体积分数为95％TFA：2.5％TIS：2.5％H

9)收集的液体在旋转蒸发仪上旋干，加入适量无水乙醚，静置3-5min，可见白色沉淀析出，之后用高速离心机离心后去上清，白色沉淀进行冻干得粗产物，产物经高效液相色谱仪提纯后使用。

按上述步骤进行了两次实验，实验结果如下所示：

实验结果1：得到的粗产物为2.65g，纯度为51.7％，经液相色谱提纯后，得到纯品1.03g，收率75.34％。

实验结果2：得到的粗产物为3.05g，纯度为58.7％，经液相色谱提纯后，得到纯品1.32g，收率73.74％。

配制浓度为1wt％的黄芪苷多肽纳米药物，具体步骤如下：

1)称取5mg黄芪苷-多肽化合物，倒入成胶小瓶，并用PBS溶液溶解；

2)用1mol/l的碳酸钠调pH至中性；

3)将溶液于酒精灯上加热至沸腾；

4)冷却后可得到具备一定纳米结构的自组装纳米药物。

使用本发明制备得到的水凝胶进行阿霉素心肌损伤改善及铁死亡相关通路测试，测试内容方法和结果如下：

(一)AM/PI染色检测纳米药物对阿霉素心肌损伤的改善作用

通过细胞的死活染色来检测纳米药物对阿霉素干预后的H9C2细胞的存活是否有改善作用。

1)将H9C2以细胞密度为2×10

2)用1μM的阿霉素对心肌细胞处理24h，同时加入相对应的纳米药物，用PBS小心的吹洗3次；之后用AM/PI染色试剂盒进行死活染色，每孔加入工作液1mL,避光并于37℃孵箱中培养30分钟；

3)弃工作液，并用PBS小心吹洗3次，把残留的工作液洗净，之后再在荧光显微镜下观察细胞的死活情况并获取荧光图像。

(二)使用亚铁离子荧光探针-FerroOrange检测细胞内铁水平：

将H9C2以细胞密度为2×10

其结果显示，黄芪苷纳米药物能够显著抑制阿霉素诱导的心肌细胞铁离子沉积。

(三)Westen-blot检测相关蛋白的表达

细胞以106/孔接种于6孔板上，待细胞密度达到80％左右，之后用1uM的DOX干预24h，并在干预开始时依次加入100uM的空载体药物，黄芩苷单药和黄芩苷多肽纳米药物，对细胞进行干预。之后弃上清，PBS冲洗干净后，加入RIPA裂解液裂解20min；通过二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度。用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离20μg蛋白，并转移到PVDF膜上。将5％脱脂奶粉溶于TBST缓冲液对膜上的蛋白封闭2h，样品依次加一抗和二抗孵育结束后，使用TBST漂洗3次，滴加化学发光显影液。选取GAPDH作为内参。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。